Summary
इस प्रोटोकॉल प्राथमिक Lgr5-positve organoid संस्कृति और रेट्रोवायरल पारगमन के बाद प्रदर्शन बताते हैं. इस विट्रो organotypic में उपन्यास में बाहर ले जाने के लिए कार्यात्मक अध्ययन वितरित transgene की Cre-inducible overexpression या पछाड़ना सक्षम बनाता है और अनुमति देता है मॉडल प्रणाली.
Abstract
Lgr5 पॉजिटिव स्टेम कोशिकाओं आवश्यक विकास के साथ पूरक किया जा सकता है EGF, नोगिन, और संस्कृति इन विट्रो में प्राथमिक 3D उपकला संरचनाओं कभी विस्तार करने के लिए हमें की अनुमति देता है जो आर Spondin, कारकों. दोनों भी organoids बुलाया इन 'मिनी हिम्मत', की वास्तुकला और शारीरिक गुण, बारीकी से उनके vivo में समकक्षों के समान है. इससे उन्हें छोटी आंतों उपकला के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाता है. रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग करना, कार्यात्मक जेनेटिक्स अब सशर्त जीन overexpression या पछाड़ना द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. यह वीडियो organoid संस्कृति की प्रक्रिया, रेट्रोवायरस की पीढ़ी, और इन विट्रो में छोटी आंतों उपकला के प्ररूपी विश्लेषण की सहायता के लिए organoids की रेट्रोवायरल पारगमन को दर्शाता है. रेट्रोवायरल मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में इस उपन्यास organotypic मॉडल प्रणाली costl की आवश्यकता के बिना इन विट्रो में जीन समारोह का तेजी से विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता हैट्रांसजेनिक जानवरों के लिए वाई और समय लेने वाली पीढ़ी.
Introduction
उच्च throughput कार्यात्मक आनुवंशिकी मौजूदा बुनियादी विज्ञान और चिकित्सा में सुधार करने के लिए, शरीर की हमारी जैविक समझ को बढ़ाने की जरूरत है. माउस आनुवंशिकी यह समय लेने वाली और महंगा दोनों हालांकि, vivo में जीन समारोह की जांच के लिए सोने के मानक किया गया है. कम महंगा किया जा रहा है, जबकि अन्य आम चुनाव किया जा रहा है सेल लाइनों, एक उच्च throughput क्षमता है. हालांकि, वे इन विवो में देखा उचित microenvironment और इस तरह शारीरिक प्रतिक्रियाओं को पुन: पेश करने के लिए उनकी अक्षमता से बाधित कर रहे हैं. इसलिए, लागत / समय कुशल उच्च throughput विश्लेषण करते हुए अनुमति देता है एक आसान करने के लिए संभाल मॉडल प्रणाली के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है, वहाँ है इन विवो ट्रांसजेनिक (टीजी) माउस प्रयोगों में मनाया शारीरिक प्रतिक्रियाओं नकल उतार.
Endodermal उपकला के लिए ऐसा ही एक मॉडल प्रणाली 2009 1 में दिखाई दिया. ज्ञान Lgr5 पॉजिटिव आंतों स्टेम कोशिकाओं की खोज से प्राप्त की बीच थास्टेम सेल रखरखाव के लिए आवश्यक अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स और वृद्धि कारकों के लिए इसी जगह के बारे में जानकारी. यह भी organoids 2 के रूप में जाना जाता है 'मिनी हिम्मत' स्थापित करने के लिए संभव हो गया इस जानकारी का उपयोग. हाल ही में organoids 'enteroids' के रूप में भेजा जाता है जहां इन विट्रो संस्कृतियों,, के लिए एक आम सहमति नामकरण 3 सुझाव दिया गया था. सेल लाइनों की तरह, organoids कभी विस्तार और ligands और inhibitors के साथ इलाज के लिए आसान कर रहे हैं. हालांकि, बजाय दो आयामी होने का वे तीन आयामी आत्म आयोजन तहखाना-अंकुर संगठन बनाए रखने संरचनाओं कि के साथ ही स्टेम कोशिकाओं और छोटी आंत (एसआई) की विभेदित सेल प्रजातियों हैं. Organoids एक luminal क्षेत्र है कि चारों ओर उपकला कोशिकाओं की एक परत से मिलकर. फैला हुआ नवोदित संरचनाओं स्टेम सेल कम्पार्टमेंट वाले छोटे आंत्र तहखाने के अनुरूप हैं. वे मील के रूप में नवोदित संरचना की नोक से शुरू पूर्वज कोशिकाओं को अलगटर्मिनली विभेदित कोशिकाओं लुमेन में बहा रहे हैं जहां उपकला अस्तर, की ओर भट्ठी. सेल लाइनों की तुलना में, इस पूर्व vivo प्रणाली को और अधिक बारीकी से सामान्य शरीर विज्ञान का स्मरण दिलाता है और इसलिए छोटी आंतों उपकला के लिए एक होनहार मॉडल प्रणाली है.
रेट्रोवायरल पारगमन के इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम इस उपन्यास organoid संस्कृति प्रणाली में पूर्व vivo जीन समारोह के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है कि एक विधि प्रस्तुत करते हैं. हम एक कदम दर कदम तरीके से संस्कृति organoid वर्णन द्वारा शुरू, और पारगमन प्रक्रिया द्वारा पीछा रेट्रोवायरस की पीढ़ी का प्रदर्शन द्वारा जारी है. अंत में, समस्या निवारण के लिए अतिरिक्त सलाह के लिए एक अनुभाग है. इस तकनीक का एक फायदा यह आंतों उपकला में homeostasis, सेल भाग्य का निर्णय और सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लाइव इमेजिंग या दवा स्क्रीनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है. कारण उनके सरल वास्तुकला और तेजी से कारोबार दर के लिए, organoids एक आदर्श मॉडल है प्रतिनिधित्ववयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए ystem. इसके अलावा रेट्रोवायरल पारगमन पूर्व स्थापित ट्रांसजेनिक चूहों के साथ ही मानव रोगी के नमूने से व्युत्पन्न organoids के लिए लागू किया जा सकता है. में दस्तक और नाक आउट दृष्टिकोण मनुष्य के लिए बढ़ाया जा नहीं सकते हैं, मानव एसआई organoids एक आकर्षक विकल्प का गठन.
संक्षेप में, रेट्रोवायरल पारगमन के माध्यम से जीन में गड़बड़ी मानव व्युत्पन्न ऊतकों में पढ़ाई के लिए नए रास्ते खोलने के दौरान जिससे माउस आनुवंशिकी और सेल लाइनों के पूरक, चूहे या मानव ऊतकों के नमूनों से निकाली गई छोटी आंतों organoids में प्ररूपी विश्लेषण की अनुमति देता है. रेट्रोवायरल पारगमन gain- सक्षम बनाता है और नुकसान के समारोह पढ़ाई organoid संस्कृति प्रणाली 4 में प्रदर्शन किया जाएगा. यह बात तीन रुपये (कमी, शोधन, और प्रतिस्थापन) के अनुसार किया जा रहा है, जबकि जीन समारोह, वयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और रोग की जांच के लिए एक बहुमूल्य संसाधन है.
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी चूहों विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था, और सभी प्रक्रियाओं ब्रिटेन के गृह मंत्रालय के नियमों के अनुसार किया गया.
1 तैयारी
- उपयोग की अग्रिम में मीडिया 1 घंटा तैयार कम से कम 10 मिनट उपयोग करने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में और पूर्व गर्म (1 टेबल और सामग्री की सूची में अधिक जानकारी के लिए देखें).
2 संवर्धन छोटे आंतों (एसआई) Organoids
नोट: अन्यथा न कहा गया हो, सभी incubations एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर प्रदर्शन कर रहे हैं. जीवित कोशिकाओं के संपर्क में आने वाले उपकरण और अभिकर्मकों बाँझ होना चाहिए.
पूर्व वार्मिंग यह तहखाने मैट्रिक्स (Matrigel या बीएमई) बोने जब बाहर फैलने से बूँदें रोकता के रूप में टिशू कल्चर प्लेट महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, तहखाने मैट्रिक्स हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए. -20 डिग्री सेल्सियस और पिघलना पर स्टोरउपयोग करने से पहले बर्फ पर.
- तहखाने अलग
- छोटी आंत के अलगाव के लिए तो, राष्ट्रीय नियमों और विनियमों के अनुसार माउस बलिदान अपनी पीठ पर जानवरों की जगह और 70% इथेनॉल के साथ पेट धो लो. उरोस्थि को कमर से एक अनुदैर्ध्य midline चीरा प्रदर्शन करना. सबसे पहले, त्वचा और फिर चमड़े के नीचे ऊतक काटा. पेट को अंधान्त्र से छोटी आंत निकालें. ग्रहणी, सूखेपन और लघ्वान्त्र से अलग तहखाने organoid संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कैल्शियम और मैग्नीशियम (PBS0) बिना पूर्व ठंडा फॉस्फेट बफर खारा के साथ पृथक छोटी आंत धो लें.
- 3-5 सेमी लंबे टुकड़ों में ऊतक में कटौती और यह longitudinally खोलने में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें. संदंश का उपयोग करके ऊतक बिखरा हुआ है.
- एक coverslip का उपयोग विल्ली परिमार्जन. सावधानी के लिए बहुत ज्यादा बल आंसू ऊतक का कारण होगा और कदमों का अनुसरण में तहखाने की उपज कम हो जाएगा.
- पूर्व ठंडा PBS0 usin युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब ऊतक स्थानांतरणजी संदंश. जोरदार झटकों के माध्यम से ऊतक टुकड़े धोएं और PBS0 बदल जाते हैं. 2-3x दोहराने या PBS0 कम से बादल छाए रहेंगे बदल जाता है जब तक.
- एक ट्यूब रोलर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ PBS0 के 30 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक सेते हैं.
- सख्ती ट्यूब हिला और 5 मिमी EDTA के साथ PBS0 के 30 मिलीग्राम से युक्त एक और 50 मिलीलीटर ट्यूब ऊतक स्थानांतरण. (पहले ऊतक युक्त) 1 मिमी EDTA समाधान तहखाने और विल्ली का एक मिश्रण शामिल होंगे. यह अक्सर विल्ली के एक उच्च प्रतिशत शामिल है के रूप में इस अंश organoids के बोने के लिए उपयुक्त नहीं है.
- एक ट्यूब रोलर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ऊतक आगे सेते हैं.
- सख्ती ट्यूब हिला और एक साफ 50 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान इकट्ठा. तहखाने की उपस्थिति की पुष्टि और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा 50 μl में तहखाने की गिनती से, जैसे संख्या, अनुमान है. 50-100 तहखाने प्राप्त करने और एक 1.5 एमएल टी को हस्तांतरण करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणनाUbe.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन. सतह पर तैरनेवाला त्यागें एक पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से थाली में तहखाने मैट्रिक्स के 50 μl में गोली, और बीज resuspend. तहखाने मैट्रिक्स polymerizes तो 5-15 मिनट के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं.
- 500 μl ENR मध्यम साथ ओवरले (1 टेबल देखें). एक छोटे से दौर सिस्टिक आकार दिखाएगा organoids बोने के बाद और संरचनाओं नवोदित एक और 2-3 दिनों के बाद लगभग 24 घंटा दिखाई देने लगते हैं. हर 3 दिन ताजा ENR मीडिया को बदलें.
- पैसेज हर 7 दिनों संस्कृतियों organoid.
- Passaging और बनाए रखने Organoids
- हर 3 दिन और बीतने 1 मीडिया को ताज़ा कर organoids बनाए रखें: लुमेन मृत कोशिकाओं, लगभग हर 7 दिन से भर जाता है के रूप में 5: 3 या 1.
- 1 मिलीलीटर Pipetman टिप का उपयोग कर के माध्यम से तहखाने मैट्रिक्स गुंबद तोड़ और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को अच्छी तरह से यह हस्तांतरण.
- यंत्रवत् pipetting एक के माध्यम से organoids अलग कर देनाpproximately 50x एक ठीक (जैसे, 200 μl) टिप का उपयोग कर.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तहखाने मैट्रिक्स के 150-250 μl में गोली resuspend. एक में बीज 24 अच्छी तरह से थाली (/ अच्छी तरह से तहखाने मैट्रिक्स के 50 μl) पूर्व गर्म. कोट करने के लिए एक बार तहखाने मैट्रिक्स ऊपर और नीचे टिप की दीवार पिपेट बोने से पहले. पिपेट धीरे धीरे बाहर फैलने से तहखाने मैट्रिक्स को रोकने के लिए अच्छी तरह से बीच में बुलबुले और बीज से बचने के लिए. यह अच्छी तरह से केंद्र में तहखाने मैट्रिक्स का एक गुंबद प्राप्त करने के लिए वांछित है.
- तहखाने मैट्रिक्स polymerizes तो 5-15 मिनट के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं. अच्छी तरह से प्रति 500 μl ENR मीडिया के साथ ओवरले.
3 पूर्व संक्रमण एसआई Organoids का उपचार
नोट: चित्रा 1 पारगमन प्रक्रिया दिखाता है.
- ENRWntNic लिए Exchange ENR मध्यम (देखें तालिका 1) और टी में organoids बढ़ने3 दिन के लिए या वे एक पित्ताशय आकारिकी अपनाया है जब तक एक न्यूनतम के लिए अपने मध्यम. निकोटिनामाइड (एनआईसी) संस्कृति दक्षता में सुधार करते हुए Wnt3a स्टेम और Paneth कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है.
4 वायरस उत्पादन
- प्लेटिनम ई कोशिकाओं में से एक 150 मिमी पकवान संक्रमण प्रति की जरूरत है. बीज लगभग puromycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल) और blasticidin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) की उपस्थिति में 15-18 मिलीलीटर मीडिया (DMEM 10% FBS) के साथ 5 x 10 6 कोशिकाओं. वे 70-80% confluency तक पहुँच चुके हैं, 2-3 दिनों के बाद कोशिकाओं Transfect. Puromycin बिना और अभिकर्मक से पहले blasticidin DMEM 10% FBS के लिए मध्यम बदलें.
- Opti- सदस्य के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों को अलग करने के polyethylenimine (पी) के रेट्रोवायरल डीएनए निर्माण की 30 ग्राम और 240 μl जोड़ें. मिक्स और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- दो समाधान पूल और 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. प्लेटिनम ई कोशिकाओं के माध्यम को पूरा मिश्रण जोड़ें और ध्यान से बेनी हिलाई डीएनए पी परिसरों का समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए.
- रातोंरात अभिकर्मक मिश्रण के साथ प्लेटिनम ई कोशिकाओं को सेते हैं और मध्यम अगले दिन ताज़ा. 2 दिनों के लिए नए माध्यम में कोशिकाओं रखें.
- , एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में केवल मध्यम लीजिए 12-16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8000 XG पर एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर और अपकेंद्रित्र के माध्यम से इसे पारित. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पारगमन माध्यम के 250 μl में गोली resuspend (1 टेबल देखें).
5 Organoid टुकड़ा तैयारी
- एक संक्रमण के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली से एक अच्छी तरह से की जरूरत है. 1 मिलीलीटर Pipetman टिप का उपयोग कर के माध्यम से तहखाने मैट्रिक्स गुंबद तोड़ और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण.
- एक महीन मात्रा टिप (जैसे, 200 μl टिप्स) pipetting (30-50x) के माध्यम से organoids यंत्रवत् को बाधित करने के लिए प्रयोग करें. समाधान बादल बन जाएगा और कोई पूरे organoids दिखाई जानी चाहिए.
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र, 900 XG .
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सेल संस्कृति ग्रेड पुनः संयोजक प्रोटीज (जैसे, TrypLE) के 500 μl में गोली resuspend. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. ऊष्मायन के बाद टुकड़ा प्रति कोशिकाओं की संख्या की गणना, प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग organoid टुकड़ों के आकार की जाँच करें. 5-10 कोशिकाओं से युक्त टुकड़े आदर्श होते हैं. टुकड़े के बहुमत कोशिकाओं के एक उच्च संख्या में होते हैं ऊष्मायन समय एक समय में 2 मिनट से बढ़ाया जा सकता है.
- ENR माध्यम के 500 μl जोड़कर हदबंदी की प्रक्रिया को समाप्त.
- कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र, 5 मिनट के लिए 900 XG. सतह पर तैरनेवाला निकालें और बर्फ या 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली रखना.
6 रेट्रोवायरल पारगमन
- एक 48 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से (धारा 4.5 से) रेट्रोवायरल समाधान के 250 μl के साथ organoid टुकड़े का मिश्रण. 1 मिलीलीटर Pipetman टिप का उपयोग धीमी गति से pipetting द्वारा धीरे मिलाएं.
- Parafilm साथ थाली सील.
- 1 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस, 600 XG पर थाली अपकेंद्रित्र. ध्यान Parafilm हटाने और 6 घंटे के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं.
संक्रमित Organoid टुकड़े के 8 सीडिंग
- 5 मिनट के लिए 900 XG पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब, और स्पिन को अच्छी तरह से संक्रमित organoid टुकड़े और पारगमन मीडिया स्थानांतरण.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और शांत करने के लिए 5 मिनट के लिए बर्फ पर गोली युक्त ट्यूब डाल दिया. तहखाने मैट्रिक्स के 100 μl जोड़ें और ऊपर और नीचे धीरे धीरे pipetting द्वारा गोली resuspend.
- एक नया 24 अच्छी तरह से थाली में 50 μl 'मिश्रण सेल तहखाने मैट्रिक्स' के बीज बूँदें. तहखाने मैट्रिक्स solidifies तक 5-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
- वेल्स को polybrene बिना पारगमन मीडिया जोड़ें और एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं. हर 2-3 दिनों मीडिया बदलें.
9 चयन
- प्रारंभ एसईमीडिया के लिए puromycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़कर 2-3 दिनों के बाद रूपांतर.
- टुकड़े फार्म organoids puromycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक ENR मीडिया के साथ पारगमन मीडिया को बदलने के लिए शुरू कर रहे हैं.
10 के बाद संक्रमण एसआई Organoids का उपचार
- संस्कृति के अनुसार "Passaging और organoids बनाए रखने" प्रोटोकॉल (धारा 2.2.1) organoids transduced. 1-2 सप्ताह के बाद एसआई organoids उनके नवोदित संरचनाओं आ जाएगा.
- 1 माइक्रोन का एक काम एकाग्रता में 4 hydroxytamoxifen (4-OHT) जोड़कर miRNA या सीडीएनए की अभिव्यक्ति को प्रेरित नवोदित संरचनाओं की उपस्थिति के बाद. इस कदम Addgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32,702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703), और pMSCV से रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग केवल तभी मान्य है कि नोट -FLIP-Puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)) और रचनात्मक-ERT2 व्यक्त organoids.
संक्रमण और Expr के 11 पुष्टिकरणब्याज की जीन की ession / दमन
- Addgene (32702, 32703 और 32704) से रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग अगर पारगमन क्षमता dsRed अभिव्यक्ति के अवलोकन से इसकी पुष्टि की जा सकती है. कू एट अल 4 में उदाहरण के रूप में इसके अलावा, ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति या दमन, GFP या (जीन पछाड़ना के लिए) 3xHA (जीन overexpression के लिए) मिलान और qPCR का उपयोग, वेस्टर्न ब्लाट से इसकी पुष्टि की जा सकती है.
Representative Results
Organoids केंद्रीय लुमेन वजह से मृत कोशिकाओं (चित्रा 2) की उपस्थिति के लिए अन्धेरा है जब विभाजित होने के लिए तैयार हैं. पूर्व उपचार organoids के 2-3 दिनों के बाद एक दौर सिस्टिक आकारिकी (चित्रा 3) को अपनाना चाहिए. यह स्थिर एकीकरण प्राप्त करने के अवसरों को बढ़ाने, स्टेम कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है. वायरल गोली के आकार की वजह से गोली आकार के लिए सेल मलबे के अलग योगदान करने के लिए, वायरल सतह पर तैरनेवाला के centrifugation के बाद सबसे अधिक संभावना हो सकती है. पारगमन क्षमता के लिए कोई स्पष्ट संबंध देखा गया है. लोगों को एक स्थिर एकीकरण रहेगा जबकि चयन प्रक्रिया के दौरान गैर transduced organoids, मर जाएगा. MSCV-EGFP रेट्रोवायरस से फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 4) पारगमन निम्नलिखित 2-3 दिनों के भीतर एक पित्ताशय आकृति विज्ञान है, जो जीवित organoids, से होने वाले कोशिकाओं में मनाया जा सकता है.
= "चित्रा 1" के लिए: सामग्री चौड़ाई = "6in" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 51,765 / 51765fig1highres.jpg" चौड़ाई = "600" />
चित्रा 1 रेट्रोवायरल पारगमन की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध ड्राइंग. पूर्व संक्रमण organoids को पूर्व इलाज वे एक पित्ताशय संरचना (चरण 1) अपनाने जब तक ENRWntNic का उपयोग कर रहे हैं. प्लेटिनम ई कोशिकाओं पैकेजिंग सेल लाइन के रूप में इस्तेमाल किया, और वे 70-80% confluency तक पहुंचने तक संवर्धित कर रहे हैं. इसके बाद वे पी का उपयोग कर रेट्रोवायरल निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. वायरस 2 दिन बाद (चरण 2) काटा जाता है. Organoids 1-10 कोशिकाओं (चरण 3) युक्त टुकड़े प्राप्त करने के लिए trypsinized कर रहे हैं, और उसके बाद (चरण 4) संक्रमित हैं. स्थिर एकीकरण (चरण 7) किया जा सकता है साथ spinoculation बाद संक्रमण दक्षता (चरण 5) को बढ़ाने के लिए, संक्रमित organoid टुकड़े सकारात्मक क्लोन के लिए (चरण 6) और 2-3 दिन बाद चयन वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
1765fig2highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा संस्कृति के 4-6 दिन बाद organoids की 2. प्रतिनिधि छवि. लुमेन, मृत कोशिकाओं से भरा अंधेरा प्रकट कर रही है. इस स्तर पर Organoids passaged बनने के लिए तैयार हैं.
3-4 दिनों के लिए ENRWntNic मीडिया में सुसंस्कृत छोटी आंतों organoids की चित्रा 3 प्रतिनिधि छवि. Organoids एक पित्ताशय आकारिकी अपनाने.
छोटी आंतों organoids की चित्रा 4 प्रतिनिधि छवि (एक) वायरल transgene अभिव्यक्ति (बी, EGFP) बताते हैं कि.
| उन्नत स्तरnced DMEM / F12 +++ | |
| 4 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| उन्नत DMEM / F12 | 500 मिलीलीटर |
| Glutamax 100x | 5 मिलीलीटर |
| Hepes 1 एम | 5 मिलीलीटर |
| एंटीबायोटिक्स 100x | 5 मिलीलीटर |
| ENRWntNic मध्यम (20 मिलीग्राम के लिए) | |
| 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| उन्नत DMEM / F12 +++ | 7.2 मिलीलीटर |
| B27 पूरक (50x) | 400 μl |
| एन 2 पूरक (100x) | 200 μl |
| एन एसिटाइलसिस्टीन (500 मिमी) | 50 μl |
| माउस EGF (500 माइक्रोग्राम / एमएल) | 2 μl |
| माउस नोगिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) | 20 μl |
| आर Spondin Conditioned मध्यम | 2 मिलीलीटर |
| Wnt3a वातानुकूलित माध्यम | 10 मिलीलीटर |
| निकोटिनामाइड (1 एम) | 200 μl |
| पारगमन मध्यम (20 मिलीग्राम के लिए) | |
| ताजा तैयार | |
| ENRWntNic मध्यम | 20 मिलीलीटर |
| वाई 27,632 (10 माइक्रोन) | 20 μl |
| Polybrene (8 माइक्रोग्राम / एमएल) | 20 μl |
| ENR मध्यम (20 मिलीग्राम के लिए) | |
| 4 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| उन्नत DMEM / F12 +++ | 17.4 मिलीलीटर |
| B27 पूरक (50x) | 400 μl |
| एन 2 पूरक (100x) | 200 μl |
| एन एसिटाइलसिस्टीन (500 मिमी) | 50 μl |
| माउस EGF (500 माइक्रोग्राम / एमएल) | 2 μl |
| माउस नोगिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) | 20 μl |
| आर Spondin वातानुकूलित माध्यम | 2 मिलीलीटर |
| प्लेटिनम ई कोशिकाओं के लिए मीडिया (500 मिलीलीटर के लिए) | |
| 12 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| DMEM | 449.45 मिलीलीटर |
| भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) | 50 मिलीलीटर |
| Puromycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल) | 50 μl |
| Blasticidin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) | 500 μl |
प्लेटिनम ई कोशिकाओं के लिए विकसित DMEM / F12 +++, ENRWntNic मध्यम, पारगमन मध्यम, ENR मध्यम, और मध्यम के लिए तालिका 1 मीडिया रचना.
Discussion
उच्च पारगमन क्षमता कुछ पहलुओं महत्वपूर्ण हैं को प्राप्त करने के लिए. वे एक दौर सिस्टिक आकार अपनाने जब तक एक ENRWntNic मीडिया के साथ organoids के पूर्व उपचार है. यह स्टेम कोशिकाओं की संख्या और transgene की एक स्थिर एकीकरण प्राप्त करने के लिए, साथ ही पारगमन प्रक्रिया के दौरान एसआई organoids के जीवित रहने की दर में वृद्धि की है, जिससे संभावना बढ़ जाती है. एक अन्य पैरामीटर spinoculation निम्नलिखित ऊष्मायन समय है. क्रमशः गरीब पारगमन दक्षता और organoids की गरीब अस्तित्व में बहुत कम या बहुत लंबी ऊष्मायन का परिणाम है. यह काफी transduced organoids का प्रतिशत बढ़ जाती है, हालांकि spinoculation कदम आवश्यक नहीं है. अंत में, उच्च अनुमापांक वायरस सफल पारगमन के लिए महत्वपूर्ण है. इस पैकेजिंग सेल लाइन और वायरस के प्रकार पर निर्भर है. प्लेटिनम ई सेल लाइन और murine स्टेम सेल वायरस (MSCV) का संयोजन, organoids के पारगमन के लिए पर्याप्त उच्च एक अनुमापांक उत्पादन पाया गया.
ve_content "> नीचे सफल पारगमन को प्राप्त करने में मदद मिल सकती है, जो समस्या निवारण के लिए सुझाव दिए गए हैं. पैकेजिंग सेल लाइन के अभिकर्मक गरीब है तो सबसे पहले, कोशिकाओं के confluency 70-80% के बीच और के ऊष्मायन समय कि है बनाना जमा पी डीएनए मिश्रण 20-30 मिनट के बीच है. पारगमन के दौरान organoids के अस्तित्व अत्यधिक टुकड़ा आकार पर निर्भर करता है. बहुत लंबा trypsinization कम से कम 3 कोशिकाओं से मिलकर टुकड़े के बहुमत का कारण बनता है और इस तरह organoid survivability कम हो जाती है. एक और पहलू है Wnt वातानुकूलित माध्यम की गतिविधि, गतिविधि बहुत कम अस्तित्व को बढ़ा सकते हैं 5 माइक्रोन का एक काम एकाग्रता में CHIR99021 के अलावा के माध्यम से इसे बढ़ा है. CHIR99021 वृद्धि हुई Wnt संकेतन में जिसके परिणामस्वरूप, GSK3 रोकता. इसके अलावा, वाई-27362, जो रोकता organoids पूर्व पारगमन को टुकड़े (1-10 कोशिकाओं से युक्त) को बाधित कर रहे हैं के बाद से anoikis, organoid survivability सुधार लाने के लिए पारगमन मीडिया में जोड़ा जाता है. के रूप में60; ऊपर उल्लेख किया है, spinoculation बाद ऊष्मायन समय 6 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए. गरीब पारगमन मनाया जाता है अन्त में, वायरल अनुमापांक और रेट्रोवायरल वेक्टर के लिए डालने के आकार की सीमा को प्रभावित aforementioned कारकों पर विचार किया जाना चाहिए. पछाड़ना की दक्षता miRNA पर अत्यधिक निर्भर है. दक्षता लक्ष्य जीन और miRNA के संयोजन के साथ बदलता रहता है के बाद से यह सबसे अच्छा काम है कि उन लोगों की पहचान करने के लिए एक दक्षता स्क्रीन प्रदर्शन के लायक है.तकनीक organoid प्रणाली की उपकला घटना तक ही सीमित है. भविष्य में यह क्रमश: प्रतिरक्षा प्रणाली से व्युत्पन्न घटकों के साथ रोगजनकों या पुनर्गठन के सह संस्कृति के माध्यम से संक्रामक या प्रतिरक्षा की मध्यस्थता रोगों का अध्ययन करने के लिए संभव हो सकता है. इसके अलावा, रेट्रोवायरस केवल एक अपेक्षाकृत छोटे आकार का सम्मिलित ले जा सकता है. नतीजतन, स्वाभाविक रूप से होती विनियामक क्षेत्रों को बाहर रखा जा सकता है और इसलिए transgene की अभिव्यक्ति की है कि नकल नहीं कर सकतेअंतर्जात जीन. जैसा कि ऊपर कहा, पछाड़ना दक्षता लक्ष्य जीन और miRNA पर निर्भर है. उपयुक्त पछाड़ना दक्षता के साथ कोई miRNA पाया जा सकता है, तो यह है कि विशेष लक्ष्य जीन के लिए तकनीक का उपयोग सीमित कर सकता है.
सिद्धांततः, organoids सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल सभी मानकीकृत जोड़ तोड़ तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं. रेट्रोवायरल पारगमन 4 सूचित किया जा करने के लिए पहली विधि था, और हाल ही में बीएसी (जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र) -transgenesis 5 उपलब्ध हो गया है. 2-3 सप्ताह के कुल पीढ़ी समय के साथ, पैकेजिंग सेल लाइन में वायरल प्लाज्मिड के अभिकर्मक के बाद, यह एक ट्रांसजेनिक (टीजी) माउस की पीढ़ी की तुलना में काफी तेज है. स्टेम सेल के साथ ही आंतों उपकला के सभी विभेदित सेल प्रजातियों युक्त जबकि इन विवो तहखाना-अंकुर वास्तुकला बनाए रखने से, organoid संस्कृति प्रणाली टीजी पशु और पहले से इस्तेमाल किया सेल संस्कृति के बीच की खाई को पुल.
छोटी आंतों organoids की स्थापना के बाद, मूल संस्कृति प्रोटोकॉल का अनुकूलन अग्नाशय, जिगर, पेट और पेट epithelia 9-11 के संवर्धन की अनुमति दी है. इसके अलावा, मानव आंत्र organoids और ट्यूमर organoids प्राथमिक अदन, सामान्य मानव बायोप्सी से प्राप्त किया गया हैओमा और कोलोरेक्टल कैंसर 10 बायोप्सी. वायरल संक्रमण प्रोटोकॉल आसानी organoids के इन प्रकार के लिए बढ़ाया और मानव व्युत्पन्न ऊतकों में कार्यात्मक अध्ययन प्रदर्शन का एक अभूतपूर्व तरीका प्रदान किया जा सकता है.
साथ में ले ली, छोटी आंतों organoids की रेट्रोवायरल पारगमन स्टेम सेल रखरखाव, भेदभाव, और सेल भाग्य निर्णय, साथ ही सेल संकेतन और सेल सेल बातचीत की जांच के लिए एक बहुमूल्य संसाधन है.
Acknowledgments
कू बीके और Mustata आर सी चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) द्वारा समर्थित है वेलकम ट्रस्ट और एंडरसन-रॉल्फ एक से सर हेनरी डेल फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं. गुप्तचर जम्मू वेलकम ट्रस्ट 4 साल पीएचडी कार्यक्रम के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| HEPES 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| Mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
| R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013. | ||
| Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013. | ||
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
| Polybrene (8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
| 24-well Plate | Greiner Bio One | 662960 | |
| 48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
| Platinum-E cells | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
| Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
| opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| 4-OHT | Sigma | H7904 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
- Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
