Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

doi: 10.3791/51765 Published: August 11, 2014

Summary

Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar model sistem.

Abstract

Lgr5-pozitif kök hücreler gerekli büyüme ile takviye edilebilir EGF Noggin, kültür ve in vitro birincil 3D epitel yapıları sürekli genişleyen için bize izin verir R-Spondin, faktörleri. Hem de organoids denilen bu 'mini cesaret', mimarisi ve fizyolojik özellikleri, yakından in vivo çok benzeyen. Bu onları küçük bağırsak epiteli için cazip bir model sistem yapar. Retroviral transdüksiyon ile fonksiyonel genetik hemen koşullu gen aşırı ifadesi ya da devirme ile gerçekleştirilebilir. Bu video organoid kültür prosedürü, retrovirüslerin üretimi ve in vitro olarak küçük bağırsak epiteli fenotipik analizi yardımcı olmak için organoids retroviral iletimini göstermektedir. Retroviral aracılı gen ekspresyonu ile kombinasyon halinde bu yeni Organotipik model sistemi costl gerek olmadan, in vitro olarak gen fonksiyonunun hızlı analiz için değerli bir araç sağlarTransjenik hayvanlar için, y ve zaman alıcı üretimi.

Introduction

Yüksek verim fonksiyonel genetik mevcut temel bilimleri ve tıp artırmak için, vücudun biyolojik anlayışı artırmak için gereklidir. Fare genetiği zaman alıcı ve masraflı hem de olmasına rağmen, in vivo gen fonksiyonlarını araştırmak için altın standart olmuştur. Daha az pahalı olmak için diğer yaygın bir seçim olan hücre çizgileri, daha yüksek bir randıman kapasitesine sahiptir. Ancak, in vivo olarak görülen uygun mikroçevresinin ve böylece fizyolojik cevapları yeniden kendi yetersizlik tarafından aksýyor. Dolayısıyla, maliyet / zaman verimli, yüksek verim analizi süre verir kolay bir-kolu model sistemi için kesin bir ihtiyaç vardır in vivo olarak transgenik (TG) fare deneylerde tespit edilen ve fizyolojik yanıtlar taklit edebilir.

Endodermal epiteli böyle bir model sistem 2009 1 çıktı. Bilgisi Lgr5-pozitif bağırsak kök hücrelerin keşfinden elde Arasında edildikök hücre bakımı için gerekli ekstra-hücresel matris ve büyüme faktörlerine tekabül niş hakkında bilgi. O da organoids 2 olarak bilinen 'mini cesareti' kurmak mümkün oldu bu bilgiyi kullanmak. En son organoids 'enteroids "olarak adlandırılmaktadır, in vitro kültürler, için bir fikir birliği adlandırma 3 önerilmiştir. Hücre hatları gibi, organoids sürekli genişleyen ve ligandlar ve inhibitörlerle tedavi etmek kolaydır. Ancak, bunun yerine iki boyutlu olmanın üç-boyutlu kendi kendini düzenleyen crypt-villus düzenini korur yapılarının yanı sıra kök hücreler ve küçük bağırsak (SI) farklılaşmış hücre soyları vardır. Organoids bir lümen alanını çevreleyen epitel hücreleri, tek bir yüzeyden oluşmaktadır. Çıkıntılı tomurcuklanan yapılar kök hücre bölmesini içeren ince bağırsak crypts gelmektedir. Bunlar, akut MI ile tomurcuklanan yapının ucundan başlayarak projenitör hücrelerinin farklılaşmasınaterminal açıdan farklılaşmış hücreleri, lümenin içine dökülür epitelial doğru rendelenir. Hücre hatlarına kıyasla bu ex vivo olarak daha yakından sistem normal fizyolojisi tekrarlar ve bu nedenle, ince bağırsak epiteli için umut verici bir model sistem.

Retroviral transdüksiyon Bu video protokolü, biz bu yeni organoid kültür sistemi ex vivo gen fonksiyon çalışmalarını sağlayan bir yöntem mevcut. Bu adım-adım bir şekilde tarif kültür organoid ile başlar ve transdüksiyon prosedürü takip retrovirüslerin üretimi gösteren devam edin. Son olarak, sorun giderme için ek tavsiye için bir bölüm vardır. Bu tekniğin bir avantajı, bağırsak epitel homeostazı, hücre hayati kararlan ve hücre-hücre etkileşimini incelemek canlı görüntüleme ve ilaç taraması ile birleştirilebilir olmasıdır. Nedeniyle, basit mimarisi ve hızlı ciro oranı, organoids ideal bir model s temsilyetişkin kök hücre biyolojisi çalışmaları için istem. Buna ek olarak Retroviral transdüksiyon, önceden belirlenmiş bir transgenik farelerin yanı sıra insan hasta örneklerinden türetilmiş organoids uygulanabilir. In-knock knock-out yaklaşımlar insanlara uzatılamaz gibi, insan SI organoids cazip bir alternatif oluşturmaktadır.

Özetle, retrovirütik iletimi yoluyla gen manipülasyonu insan kaynaklı dokularında çalışmalar için yeni yollar açarken, böylece fare genetiğini ve tamamlayıcı hücre soyları, fare ya da insan doku örnekleri türetilmiş küçük bağırsak organoids fenotipik analiz sağlar. Retroviral transdüksiyon, gain- sağlar ve zarar fonksiyon-çalışmaları organoid 4 kültür sistemi içinde gerçekleştirilmelidir. Bu üç Rs (azaltma, arıtma, ve yedek) uyarınca olurken gen işlevi, yetişkin kök hücre biyolojisi ve hastalığı araştırmak için değerli bir kaynak haline getirmektedir.

Protocol

Aşağıdaki protokole kullanılan farelerin belirli bir patojenden bağımsız koşullarda tutuldu ve tüm işlemler Birleşik Krallık Ofis düzenlemelerine uygun olarak yapıldı.

1. Hazırlık

  1. Kullanılmadan önce 1 saat süreyle ortam hazırlama en az 10 dakika kullanılmadan önce 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtma işlemi (Tablo 1 ve Malzeme Listesi daha fazla bilgi için bkz.)

2. Kültürleme Küçük Bağırsak (SI) Organoids

NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm inkübasyonlar nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 ile gerçekleştirilir. Canlı hücreler ile temas eden aletler ve tepkime maddeleri steril olması gerekmektedir.

Ön ısınma o bodrum matris (Matrıgel veya BME) Yayımlarken dışarı yayılmasını engeller damla gibi doku kültürü plaka önemlidir. Ayrıca, taban matris her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. -20 ° C ve çözülme Mağazasıkullanımdan önce buz üzerinde.

  1. Kriptler Yalıtımlı
    1. Ince bağırsak izolasyonu için daha sonra, ulusal kurallar ve düzenlemelere göre fare kurban sırtında hayvan koyun ve% 70 etanol ile karın yıkayın. Sternum kasıktan bir uzunlamasına orta hat kesi gerçekleştirin. İlk olarak, deri ve deri altı doku daha sonra kesilir. Mideye çekumdan ince bağırsağı çıkarın. Duodenum, jejunum ve ileumdan izole kript organoid kültürü için de kullanılabilir.
    2. Kalsiyum ya da magnezyum (PBS0) olmaksızın önceden soğutulmuş fosfat tamponlu serum fizyolojik ile, izole edilen ince bağırsağı yıkayın.
    3. 3-5 cm uzunluğunda parçalar halinde doku kesmek ve uzunlamasına açık kesmek için makas kullanın. Forseps kullanarak doku yayıldı.
    4. Lamel kullanarak villus kazımak. Dikkat, çok fazla kuvvet gözyaşı doku neden olur ve aşağıdaki adımları izleyerek kriptalarının verimini azaltacaktır.
    5. Önceden soğutulmuş bir PBS0 usin içeren 50 ml'lik bir tüpe transfer dokug forseps. Kuvvetli çalkalama ile doku parçaları yıkayıp PBS0 değiştirin. 2-3 x tekrarlayın veya PBS0 az bulutlu dönene kadar.
    6. Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C'de 30 dakika boyunca 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile PBS0 30 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içinde doku inkübe edin.
    7. Kuvvetlice çalkalanır tüp ve 5 mM EDTA ile PBS0 30 ml ihtiva eden bir 50 ml tüp doku aktarın. (Daha önce doku ihtiva etmektedir), 1 mM EDTA çözeltisi ve kript villi bir karışımını içerecektir. Genellikle villi yüksek bir oranda içerir, Bu fraksiyon organoids bir tohumlama için uygun değildir.
    8. Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C'de 1 saat boyunca doku daha inkübe edin.
    9. Kuvvetlice tüp sarsıntı ve temiz bir 50 ml tüp içinde çözeltisinin toplanması. Kript varlığını doğrulamak ve ışık mikroskopisi ile 50 ul crypts sayarak, örneğin sayısını tahmin ediyoruz. 50-100 kriptaları almak ve 1.5 ml t aktarmak için gerekli hacmi hesaplayınube.
    10. 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin. , Supernatant Önceden ısıtılmış, 24 oyuklu bir plaka içerisinde temel matrisin 50 ul pelet ve tohum yeniden süspanse edin. Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin.
    11. 500 ul ENR ortamı ile Yerleşimi (bakınız Tablo 1). Küçük, yuvarlak bir şekil gösterir kistik organoids tohumlama sonra filizlenen ve yapıları 2-3 gün sonra yaklaşık 24 saat görünür hale gelir. Her 3 günde bir, taze ENR medya değiştirin.
    12. Geçiş 7 günde kültürler organoid.
  2. Pasajlanması ve bakımı Organoids
    1. Her 3 gün ve geçiş 1 medyayı tazeleyerek organoids koruyun: lümen ölü hücreler, yaklaşık her 7 gün ile dolu olur 5: 3 veya 1.
    2. 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp kuyudan aktarın.
    3. Mekanik pipetleme ile a organoids ayırmakpproximately 50x cezası (örneğin, 200 ul) ucu kullanarak.
    4. 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin.
    5. Süpernatantı atın ve bodrum matris 150-250 ul pelletini. Bir tohum 24-kaynaklı plaka (/ oyuk taban matris 50 ul) önceden ısıtılmış. Kaplamak için bir kez bodrum matris yukarı ve aşağı ucunun duvar pipet ekim önce. Pipet yavaşça yayılmasını önlemek için matris temel kuyunun orta kabarcıkları ve tohum önlemek için. Bu iyi merkezinde taban kalıbının bir kubbe almak için arzu edilir.
    6. Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. Kuyu başına 500 ul ENR medya ile Yerleşimi.

3. Ön enfeksiyon SI Organoids Tedavisi

NOT: Şekil 1, iletim prosedürü görüntülemektedir.

  1. ENRWntNic Exchange, ENR ortamı (Tablo 1 e bakınız) ve t organoids büyür3 gün veya bir kistik morfoloji kabul kadar en az onun orta. Nikotinamid (Nic) kültür etkinliğini iyileştirir Wnt3a kök ve Paneth hücrelerinin sayısını artırır.

4. Virüs Üretimi

  1. Platin-E hücreleri bir 150 mm tabak başına enfeksiyona gereklidir. Tohum yaklaşık puromycin (1 ug / ml) ve blasticidin (10 ug / ml) varlığında, 15-18 ml'lik ortam (DMEM +% 10 FBS) ile 5 x 10 6 hücre. Bunlar% 70-80 ulaştığı zaman, 2-3 gün sonra hücrelerin transfekte. Puromisin olmayan ve de transfeksiyon önce blastisidin, DEM +% 10 FBS ile orta değiştirin.
  2. Opti-MEM 1 ml içeren tüpler ayırmak için polietilenimin (PEI) retroviral DNA yapısının, 30 ug ve 240 ul ilave edin. Karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Iki çözeltinin havuzu ve 20-30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. Platin-E hücrelerinin ortamına tam karışımı ilave edilip dikkatle plat sallamake DNA PEI komplekslerinin eşit dağılımını sağlamak için.
  4. Gece boyunca transfeksiyon karışımı ile platin-E hücreleri inkübe ve ortam ertesi gün yenileyin. 2 gün boyunca, yeni bir ortam içinde hücrelerin tutun.
  5. , 50 ml'lik bir Falcon tüpüne sadece orta toplamak 12-16 saat boyunca 4 ° C'de 8000 x g'de, bir 0.45 um filtre ve santrifüj geçirin. Süpernatantı atın ve İletimi orta 250 ul pelet (bakınız Tablo 1).

5. organoid Fragman hazırlanması

  1. Bir enfeksiyonu için bir 24 oyuklu plaka bir de gereklidir. 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp aktarın.
  2. Ince bir ses ipucu (örneğin, 200 ul ipuçları) pipetle (30-50x) aracılığıyla organoids mekanik bozmaya kullanın. Çözelti bulanık hale ve herhangi bir tam organoids görünür olmalıdır.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje, 900 x g .
  4. Süpernatantı atın ve hücre kültürü dereceli rekombinant proteaz (örneğin, TrypLE) 500 ul pelletini. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. İnkübasyondan sonra fragmanının başına hücre sayısının sayılması, ışık mikroskopisi kullanılarak organoid fragmanlarının boyutunu kontrol edin. 5-10 hücreleri içeren fragmanlar idealdir. Parçalarının çoğunluğu hücrelerinin daha yüksek bir sayı içeriyorsa inkübasyon süresi, aynı anda 2 dakika süre ile arttırılabilir.
  5. ENR ortamının 500 ul ekleyerek ayrışma süreci sonlandırmak.
  6. Oda sıcaklığında santrifüj, 5 dakika boyunca 900 x g. Süpernatantı ve buz ya da 4 ° C pelet tutmak.

6. retroviral İletimi

  1. Bir 48-yuvalı plakanın bir çukuruna (bölüm 4.5 'dan itibaren) retroviral çözeltisi 250 ul organoid parçaları birleştirin. 1 ml pipetman ucu kullanarak yavaş pipetle hafifçe karıştırın.
  2. Parafilm plaka mühür.
e "> 7. Spinoculation ve Kaplama

  1. 1 saat boyunca, 32 ° C, 600 x g'de santrifüje plaka. Parafilm dikkatlice çıkarın ve 6 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin.

Enfekte organoid Fragments 8. Tohumculuk

  1. 5 dakika boyunca 900 xg'de 1.5 ml tüp, ve spin kuyudan enfekte organoid fragmanlarını ve iletim ortamı aktarın.
  2. Süpernatantı atın ve serin 5 dakika buz üzerinde pelet içeren tüp koymak. Bodrum matris 100 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme pelletini.
  3. Yeni 24-oyuklu bir plaka içerisinde 50 uL 'karışımı cell temel matris "Tohum düşer. Matris taban katılaşıncaya kadar 5-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Oyuklara polibren olmayan iletim ortamı ilave edin ve bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edin. 2-3 gün medya değiştirin.

9. Seçim

  1. Başlangıç ​​seortama puromisin (1 ug / ml) ilave edilerek 2-3 gün sonra lection.
  2. Fragmanlar oluşturan organoids puromycin (1 mcg / ml) ile desteklenmiş, ENR medya ile İletimi ortamı değiştirmek için ne zaman başlıyor.

10. post-enfeksiyon SI Organoids Tedavisi

  1. Kültür göre, "Pasajlanması ve organoids muhafaza" protokolü (bölüm 2.2.1) organoids transdük. 1-2 hafta sonra SI organoids yeni kurdukları yapıları geri kazanacak.
  2. 1 uM'lik bir konsantrasyonda çalışma 4-OH (4-OHT) eklenerek miRNA ya da DNA ekspresyonunu tomurcuklanan yapıların görünüşünü ardından. Bu aşama Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703) ve ikinci pMSCV, retroviral vektörler kullanılarak halinde geçerli olduğuna dikkat ediniz -Flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) ve kre-ERT2 ifade organoids.

Enfeksiyon ve Expr 11. Onayıİlgi geninin salgılamanın ardından / bastırılması

  1. Addgene (32702, 32703 ve 32704) için, retroviral vektörler kullanılarak Eğer iletim verimliliği DsRed ifade gözlemi ile teyid edilebilir. Koo ve arkadaşlarına 4 de örneklendiği gibi Buna ilaveten, ilgi konusu genin ifade veya bastırılması, GFP veya (gen demonte için) 3xHA (gen aşırı ifadesi için) epitopu ve QPCR kullanılarak, Western Blot ile teyit edilebilir.

Representative Results

Organoids merkezi lümen bağlı olarak ölü hücreleri (Şekil 2) varlığı karanlık bölme zaman hazırdır. Tedavi öncesi organoids 2-3 gün sonra bir yuvarlak kistik morfoloji (Şekil 3) benimsemelidir. Bu stabil entegrasyonunu elde şansını arttıran kök hücrelerin sayısını artırır. Viral pelet boyutu nedeniyle topak boyutuna hücre artıkları arasında değişen katkısı, viral süpernatanın santrifüjleme ile en muhtemel değişebilir. Transdüksiyon verimliliği net bir korelasyon gözlenmiştir. Olanlar istikrarlı bir entegrasyon kalacaktır yerken seçim prosedürü sırasında sigara transdüksiyonlu organoids, ölecek. MSCV-EGFP retrovirüslerden floresan proteini (Şekil 4) transdüksiyonu takip eden 2-3 gün içinde kistik morfolojiye sahip kalan organoids gelen bu hücrelerde görülmektedir.

= "Şekil 1" fo: İçerik-width = "6in" src = "/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" />
Şekil 1. retroviral transdüksiyon işlemin şematik bir çizimi. Önceki enfeksiyon organoids için önceden muamele edilmiş bir kistik yapı (aşama 1) ile uyum sağlayıncaya kadar ENRWntNic bulunmaktadır. Platin-E, hücreler paketleme hücre hattı olarak kullanılan, ve% 70-80 gelinceye kadar büyütülür. Bundan sonra, PEI ile retroviral yapı ile transfekte edilir. Virüsler 2 gün sonra (aşama 2) hasat edilmiştir. Organoids 1-10 hücreleri (aşama 3) ihtiva eden fragmanlar elde etmek, tripsinize edilir, ve daha sonra (adım 4) enfekte edilir. Kararlı bütünleşmesi (adım 7) yapılabilir ile spinoculation takiben enfeksiyon verimliliği (adım 5) artırmak için, enfekte organoid fragmanlar pozitif klonlar için (adım 6) ve 2-3 gün sonra seçim ekilir.

1765fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil kültür 4-6 gün sonra organoids 2. Temsilcisi görüntü. Lümen, ölü hücreleri ile dolu karanlık görünür yapıyor. Bu aşamada Organoids geçişli hazırdır.

Şekil 3,
3-4 gün boyunca ENRWntNic medyada kültüre ince bağırsak organoids Şekil 3. Temsilcisi görüntü. Organoids kistik morfoloji benimsenmesi.

Şekil 4
Ince bağırsak organoids Şekil 4. Temsilcisi görüntüsü (a) viral transgen ifade (b eGFP) gösteriyor ki.

AdvaAdvanced DMEM / F12 +++
4 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın
Gelişmiş DMEM / F12 500 mi
Glutamax 100x 5 mi
HEPES 1 M 5 mi
Antibiyotikler 100x 5 mi
ENRWntNic ortamı (20 ml)
2 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın
Gelişmiş DMEM / F12 +++ 7.2 mL
B27 takviyesi (50x) 400 ul
N2 takviyesi (100x) 200 ul
N-asetilsistein (500 mM) 50 ul
fare EGF (500 ng / ml) 2 ul
Noggin, fare (100 ug / ml) 20 ul
R Spondin conditbahsettiğimiz orta 2 mi
Wnt3a koşullandırılmış ortam 10 mi
Nikotinamid (1 M) 200 ul
Transdüksiyon ortamı (20 ml)
Taze hazırlayın
ENRWntNic orta 20 mi
-Y-27632 (10 uM) 20 ul
Polibren (8 ug / ml) 20 ul
ENR ortamı (20 ml)
4 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın
Gelişmiş DMEM / F12 +++ 17.4 mi
B27 takviyesi (50x) 400 ul
N2 takviyesi (100x) 200 ul
N-asetilsistein (500 mM) 50 ul
fare EGF (500 ng / ml) 2 ul
Noggin, fare (100 ug / ml) 20 ul
R Spondin koşullu ortam 2 mi
Platin-E hücreleri için ortamı (500 ml)
12 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın
DMEM 449,45 mi
Fetal sığır serumu (FBS) 50 mi
Puromisin (1 ug / ml) 50 ul
Blastisidin (10 ug / ml) 500 ul

Platin-E hücreleri için Gelişmiş DMEM / F12 +++, ENRWntNic orta, Transdüksiyon orta, ENR orta ve orta Tablo 1. Medya bileşimi.

Discussion

Yüksek transdüksiyon verimi bazı yönleri kritik ulaşmak. Bir yuvarlak Kistik şeklinin benimsenmesi kadar bir ENRWntNic ortamı ile organoids öncesi bir tedavi yöntemidir. Bu kök hücrelerin sayısını ve transgenin kararlı entegrasyonu elde edilmesi, hem de transdüksiyon işlem boyunca SI organoids hayatta kalma oranının artması, dolayısıyla da olasılığını artırır. Diğer bir parametre spinoculation izleyen inkübasyon zamanı. Sırasıyla yoksul iletim verimliliği ve organoids kötü sağkalım, çok kısa veya çok uzun kuluçka sonuçları. Önemli ölçüde transduse organoids yüzdesini arttırdığı halde spinoculation aşaması esas teşkil etmemektedir. Son olarak, yüksek-titreli bir virüs başarılı iletimi için anahtardır. Bu paketleme hücre hattı ve virüs tipine bağlıdır. Platin-D hücre hattı ve murin stem hücre virüsü (MSCV) kombinasyonu, organoids transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titreye ürettiği bulundu.

ve_content "> Aşağıda başarılı iletimini elde etmek için yardımcı olabilir giderme için ipuçları. paketleme hücre hattının transfeksiyon düşük olup olmadığına, hücrelerin% 70-80 konflüansa ile kuluçkalama süresi bu olduğundan emin olmak Havuza alınan PEİ-DNA karışımı, 20-30 dakika arasındadır. iletimi aşamasında organoids hayatta kalması oldukça parçası boyutuna bağlıdır. çok uzun tripsinizasyon az 3 hücrelerinin oluştuğu parçalarının çoğunluğu neden olmakta ve böylece organoid hayatta kalma azaltır. bir başka etmen Wnt kıvamlandırılmış ortam aktivitesi, etkinliği çok düşük hayatta kalma oranları için 5 uM konsantrasyonda bir çalışma CHIR99021 ilavesi yoluyla da artırılması ise. CHIR99021 artmış Wnt sinyal ile sonuçlanır GSK3 inhibe eder. Ayrıca, Y'nin-27362, burada önler organoids önce iletimine parçaları (1-10 hücresi içeren) için bozulur çünkü anoikis, organoid hayatta kalma artırmak için transdüksiyon ortama ilave edilir. gibi60, yukarıda belirtildiği gibi, spinoculation sonraki kuluçka süresi 6 saat geçmemelidir. Kötü iletim gözlenmesi halinde Son olarak, viral titresi ve retroviral vektör için ek parçanın boyut sınırını etkileyen belirtilen faktör dikkate alınmalıdır. Nakavt etkinliği miRNA son derece bağlıdır. Verimi, hedef gen ve miRNA kombinasyonu ile değiştiğinden dolayı, en iyi işlev yapanlardan belirlemek için bir ekran verim performans değerdir.

Bu teknik alan organoid sisteminin epitel fenomeni ile sınırlandırılmıştır. Gelecekte sırasıyla, bağışıklık sistemi kaynaklı bileşenleri olan patojenlere ya da yeniden kurma ko-kültür ile enfeksiyon ya da bağışıklık aracılı hastalıklar çalışma mümkün olabilir. Ayrıca, retrovirüsler sadece nispeten küçük bir boyutta insertleri taşıyabilir. Sonuç olarak, doğal olarak ortaya çıkan düzenleyici bölgeleri hariç tutulması ve dolayısıyla transgen sentezleme bu taklit edilemezendojen gen. Yukarıda zikredildiği gibi, portatif verimi, hedef geni ve miRNA bağlıdır. Uygun Knockdown verimlilik ile hiçbir MiRNA bulunabilir Eğer o belirli hedef geni için tekniğin kullanımını sınırlayabilir.

Teorik olarak, organoids hücre çizgileri için kullanılan tüm standart manipülasyonu teknikleri ile uyumludur. Retroviral transdüksiyon 4 rapor edilecek ilk yöntem oldu ve son zamanlarda BAC (bakteriyel yapay kromozom) -transgenesis 5 kullanılabilir hale gelmiştir. 2-3 haftalık bir toplam üretim süresi ile, paketleme hücre hattı viral plazmid transfeksiyonundan sonra, bir transgenik (TG) fare üretimi önemli ölçüde daha hızlıdır. Kök hücrelerin yanı sıra bağırsak epiteli tüm farklılaşmış hücre soyları içeren iken, in vivo crypt-villus mimarisini koruyarak, organoid kültür sistemi tg hayvan ve önceden kullanılan hücre kültürü arasındaki köprüdür.

in vitro endodermal epitel fenotipik analizi gerçekleştirmek için bir yöntem ve fonksiyon testleri kaybı: içerir. Bu tg farelerde asgari ihtiyacı olan, yetişkin kök hücre biyolojisi fizyolojik ilgili soruları mümkün olur. Örneğin, koşullu nakavt farelerinin kuşak perinatal öldürücülüğü 6, yeni doğan mutantlardan türetilen organoids kullanılarak önlenebilir. Buna ek olarak, teknik, ilave, yok etme 7,8 gerçekleştirerek paralogues rolünü incelemek için, daha önce belirlenmiş knockout farelerden türetilen organoids uygulanabilir.

Ince bağırsak organoids kurulmasından sonra, orijinal kültür protokol adaptasyon pankreas, karaciğer, kolon ve mide epiteliyalarının 9-11 kültürlenmesini izin verdi. Bundan başka, insan bağırsak organoids ve tümör organoids primer Aden, normal insan biyopsilerinden elde edilmiştiroma ve kolorektal kanser 10 biyopsisi. Viral enfeksiyon protokolü kolay organoids bu tür genişletilmiş ve insan kaynaklı dokularda fonksiyonel çalışmalar yapmak görülmemiş bir yol sağlar.

Birlikte ele alındığında, küçük bağırsak organoids retroviral transdüksiyon kök hücre bakım, farklılaşma ve hücre kader kararı, yanı sıra hücre sinyalizasyon ve hücre-hücre etkileşimleri araştırmak için değerli bir kaynaktır.

Acknowledgments

Koo BK ve Mustata RC Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) tarafından desteklenen Wellcome Trust ve Andersson-Rolf A Sir Henry Dale Bursu tarafından desteklenmektedir. Fink J Wellcome Trust 4 yıllık Doktora Programı tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12  Invitrogen 12634-034
Glutamax 100x  Invitrogen 35050-068
HEPES 1 M Invitrogen 15630-056
Penicillin-streptomycin 100x Invitrogen 15140-122
B27 supplement 50x Invitrogen 17504-044
N2 supplement 100x  Invitrogen 17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM Sigma-Aldrich A9165-5G
Mouse EGF 500 µg/ml Invitrogen Biosource PMG8043
Mouse Noggin 100 µg/ml Peprotech 250-38
R-Spondin conditioned medium The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013.
Wnt conditioned medium The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013.
Nicotinamide 1 M Sigma N0636
Y-27632 10 µM Sigma Y0503-1MG
Polybrene (8 µg/ml) Sigma H9268-5G
Standard BD Matrigel matrix BD Biosciences 356231 Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02)
supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.
24-well Plate Greiner Bio One 662960
48-well Plate Greiner Bio One 677980
CHIR99021 Sigma A3734-1MG
Platinum-E cells Cell Biolabs RV-102
Puromycin Invitrogen A1113802
Blasticidin Invitrogen A1113902
Polyethyleneimine (PEI) Polysciences 23966
opti-MEM Life Technologies 51985-034
TrypLE Invitrogen 12605-010
Parafilm Sigma P7793-1EA
4-OHT Sigma H7904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  2. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
  3. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
  5. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
  6. Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
  7. Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
  8. Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
  9. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
  10. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  11. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J. Vis. Exp. (90), e51765, doi:10.3791/51765 (2014).More

Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J. Vis. Exp. (90), e51765, doi:10.3791/51765 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter