Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Realtid avbildning av endotelceller-cells Junctions Under neutrofila Trans under fysiologiska Flow

Published: August 14, 2014 doi: 10.3791/51766
* These authors contributed equally

Summary

Leukocyter korsa endothelial monolager med hjälp av paracellulära eller transcellulära vägen. Vi utvecklade ett enkelt test för att följa fördelningen av endogena Junktional VE-cadherin och PECAM-1 under leukocyt transendotelial migration under fysiologiska flöde för att skilja mellan de två Transmigration vägar.

Abstract

Under inflammation, leukocyter lämna cirkulationen och korsa endotelet att bekämpa invaderande patogener i underliggande vävnad. Denna process kallas leukocyter transendotelial migration. Två vägar för leukocyter att korsa endothelial monolager har beskrivits: den paracellulära vägen, det vill säga, genom cell-cell korsningar och transcellulära vägen, det vill säga, genom endotelceller kroppen. Däremot har det varit tekniskt svårt att skilja mellan para- och transcellulär rutt. Vi utvecklade ett enkelt in vitro-analys för att studera fördelningen av endogena VE-cadherin och PECAM-1 under neutrofila transendotelial migration under fysiologiska flödesförhållanden. Före neutrofila perfusion, endotelceller kort behandlades med fluorescensmärkta antikroppar mot VE-cadherin och PECAM-1. Dessa antikroppar har inte interfererar med funktionen av båda proteinerna, såsom bestämdes genom elektrisk cell-substrate impedans kännande och FRAP mätningar. Med hjälp av denna analys, kunde vi följa fördelningen av endogena VE-cadherin och PECAM-1 under transendotelial migration enligt flödesförhållanden och skilja mellan de parametrar och transcellulär vandringsvägar för leukocyter över endotelet.

Introduction

Effektiv och hårt kontrollerad leukocyt transendotelial migration (TEM) är av central betydelse i fysiologiska processer såsom immunövervakning och akut inflammation. Under vissa patofysiologiska förhållanden, okontrollerad och överdriven TEM observeras vilket resulterar i kroniska inflammatoriska sjukdomar (t.ex. reumatoid artrit, ateroskleros, astma). Även under tumörcellmetastas, är processen för transendotelial migrering av avgörande betydelse för tumörceller att lämna cirkulationen att metastasera 1-3. För att specifikt störa alltför leukocyter eller tumörcells TEM, krävs en detaljerad förståelse av regleringen av denna process.

Det antages att TEM process sker genom olika steg. Nyskapande studier omdömet två decennier sedan av Butcher och Springer, ledde till att flerstegsmodellen som beskriver processen för TEM 4,5. Modellen håller än, även om en viss annonsditionella steg har inkluderats 6. Alon et al. Beskrivna behovet av närvaro av immobiliserade kemokiner på ytan av endotelet 7. Nyligen visade de att endotelet i sig genererar kemokiner som presenteras vid den endothelial apikala ytan 8. Dessutom satte samma grupp fram vikten av flödesförhållanden under TEM 7. Nyligen, kan flera publikationer fokuserade på de två olika rutter leukocyter ta vid slut diapedes etappen av TEM. De kan antingen gå igenom cell-cell junctions, dvs, den paracellulära flyttväg eller passera den endotelceller kroppen, som kallas transcellulära migrationsvägen 9. Carman och kollegor studerade dessa vägar i detalj och kom fram till att leukocyter företrädesvis välja paracellulär migrationsvägen (90%) över transcellulär vägen (10%) när de passerar en navelven endothelial monolager 10.Men när endotelceller från annat ursprung har använts, t.ex. hjärnan eller mikrocirkulation, fler leukocyter använde transcellulär vägen (30%) 11. Den Vestweber gruppen visade nyligen att när de cell-cell junctions var oförmögna att dissociera från varandra genom användning av en knock-i djurmodell, som ersätter endogena VE-cadherin för en VE-cadherin-alfa-catenin chimären var leukocyt TEM helt blockerad 12 . Överraskande, märkte författarna att TEM blockerades i flera, men inte alla, vävnader. Sammantaget dessa eleganta experiment indikerade att leukocyter drog den paracellulära vägen över transcellulär vägen, även om de regulatoriska signaler som utlöser detta beslut är fortfarande okänd.

Även om majoriteten av leukocyter föredrar paracellulär flyttväg, är det fortfarande svårt att skilja mellan de båda vägarna. Utöver det, trots flera studier som fokuserar på den roll som den endotelceller cells junctjoner, dynamiken i dessa korsningar, särskilt junctionala proteinerna VE-cadherin och PECAM-1, under leukocyt korsning är fortfarande under diskussion. Vi utvecklade en relativt enkel analys i vilken dessa kopplingsmolekyler kan övervakas i realtid under leukocyt diapedes under fysiologiska flödesbetingelser med användning av fluorescensmärkta antikroppar. Dessa antikroppar inte störa eller blockera Junktional integritet eller mobilitet av de riktade proteiner. Denna analys ger oss möjlighet att följa dynamiken i junctionala proteiner under processen för paracellulär TEM. Dessutom denna analys kan också skilja mellan de parametrar och transcellulära vandringsvägar.

Protocol

Neutrofiler isolerades från friska frivilliga som har undertecknat ett informerat samtycke. Forskningen har utförts i enlighet med de institutionella och nationella riktlinjer för mänsklig välfärd.

1 Plating och underhåll av mänskliga navelvenendotelceller

  1. Kultur Human navelvenendotelceller (HUVEC) enligt tillverkarens anvisningar. Väx HUVEC på fibronektin (FN) -belagda skålar (10 ^ g / ml, upplöst i avmineraliserat vatten) med användning av medier (Endothelial Basal Medium (EBM-2)-medium kompletterat med Endothelial Growth Medium (EGM-2) singlequots). Använd cellodling mellan 4-8 passager för experiment.
  2. Dag 1: Coat flödeskammare med 100 ul av fibronektin (10 | ig / ml i PBS) under minst 2 h vid 37 ° C och 5% CO 2.
  3. Dag 2: När cellerna når 80-90% konfluens, trypsinize cellerna efter noggrann tvättning med RT fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,4, centrifugera vid 800 xg och resuspendera vid 800.000 celler / ml med hjälp av media. Plate 80.000 celler i varje enskild kanal för FN-belagda flödeskammare och försiktigt pipettera cellsuspensionen upp och ner. Kultur O / N i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
  4. Dag 3: Uppdatera medierna i flödeskammar slide genom att sakta vända bilden i 45 ° vinkel. (Se figur 1A).
    OBS: Vi rekommenderar att endast ta bort materialet i magasinen och inte i kanalen själv. Borttagning av medierna i kanalerna kan leda till endotelceller förlust och död på grund av att dra kraft media orsakad av pipettering.
  5. Kontrollera genom faskontrastmikroskopi om endotelcellerna har bildat ett monolager (dvs 100% sammanflytande). Om cellerna inte är 100% konfluenta, ändra media två gånger om dagen tills de når 100% konfluens.
  6. När cellerna har nått konfluens, stimulera cellerna med mediet (se steg1,1) innehållande inflammatorisk mediator (TNF-α (10 ng / ml)). Stimulerande HUVEC O / N (dvs., 12 tim) med TNF-α resulterar i en inflammatorisk fenotypen av endotelet, dvs., Uppreglering av celladhesionsmolekyler såsom ICAM-1 och VCAM-1 13.

2. Polymorfonukleära Leukocyte Isolering Använda Percoll lutningar

  1. Förbered N-2-hydroxietylpiperazin-N'-2-etansulfonsyra (HEPES) -buffer (hädanefter kallade: flödesbuffert) före isolering av polymorfonukleära leukocyter (PMN). Flow-buffert används för att tvätta isolerade PMN och som buffert i analysflödet. För att förbereda flödes buffert: späd 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) i en liter demineraliserat vatten och justera till pH 7,4 (detta lager kan hållas vid 4 ° C under flera veckor).
  2. Lägg färska 100 ^ 1 M CaCl2 & #160; (1 mM), 2,5 ml humant albumin från en 200 g / L lager koncentration (0,5% volym / volym) och 0,1 g glukos till 100 ml (0,1% vikt / volym) av flödesbuffert. Därefter välja flödesbuffert med användning av ett 0,45 pm filter. OBS: Detta flöde-buffert måste beredas på nytt för varje experiment.
  3. Före isolering av PMN, förbereda 10% trinatriumcitrat (TNC) lösning i PBS, pH 7,4.
  4. Samla 20 ml helblod i natrium heparin vacuettes från en frisk frivillig. Späd helblod 1: 1 med 10% PBS / TNC i 50 ml rör och pipettspetsar 20 ml utspätt blod försiktigt på 12,5 ml Percoll (en 23% (vikt / vikt) koUoidal lösning i vatten med en densitet av 1,130 g / ml) i ett nytt 50 ml rör. Placera försiktigt rören i centrifugen och snurra i 20 min vid 800 xg med låg acceleration och ingen rast satt vid RT.
    OBS: När du lägger till det utspädda blod till Percoll, luta Percoll-innehållande rör i en 45 ° vinkel och försiktigt pipet det utspädda blodet i röret with långsammast pipett boy inställning.
  5. Ta bort all vätska och därefter fylla röret med iskall erytrocytlys-buffert (4,15 g NH4CI [0,155 M], 0,5 g KHCO3 [0,01 M] och 18,5 mg EDTA (triplex III) [0,1 mM] till 500 ml iskall H2O) för att lysera erytrocyter. Lämna rör på is, ibland vända röret, tills suspensionen stängs mörkröd, följt av centrifugering 500 xg under 5 min vid 4 ° C med raster aktiverade.
    OBS! Pelletfraktion innehåller PMN (neutrofiler, eosinofiler, basofiler) tillsammans med erytrocyter.
  6. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger i iskall lys-buffert vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
  7. Suspendera pelleten med flödes buffert vid RT och bestämmer PMN koncentration med hjälp av antingen en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Häng de PMN i flödes buffert vid 1 x 10 6 celler / ml och hålla vid RT.

3. Märkning av Endothelial Junctional VE-cadherin och PECAM-1

  1. Till PECAM Alexa Fluor 647-antikropp (klon WM59) vid en 1: 100 spädning och kalciumoberoende VE-cadherin-FITC-antikropp (klon 55-7H1) vid en 1:50 utspädning till HUVEC odlingsmedium (se steg 1.1), och inkubera under 30 minuter före start av flödesexperiment att visualisera junctionala dynamik endotelceller under neutrofil transmigration under fysiologiska flödesbetingelser.
    OBS: Innan du lägger de direkt-märkta antikroppar mot flödeskammare, se till att volymen i varje kanal inte överstiger 100 l. Detta hjälper till att hålla kostnaderna antikropps så lite som möjligt.

4. PMN TEM-analys under FLÖDE

  1. Placera PMNs till ett vattenbad under 15 min vid 37 ° C före injicera dem in i flödessystemet.
  2. Anslut slangen till en tom flödeskammare och fyll med varmt (t.ex. 37 ° C) flödesbuffert (se steg 4.3) för att förhindra bildning av luftbubblor vid inställning the flödessystem.
  3. Anslut en sida av en tom flödeskammaren till sprutpumpen flödessystem med användning av silikonslang innehållande en 20 ml spruta och placera den flödeskammaren in mikroskop scenen.
  4. Anslut den andra sidan av en tom flödeskammaren till reservoaren kolv fylld med 37 ° C flödes-buffert (Figur 1B) och börja sprutpumpen för att fylla alla slangar med flödesbuffert. Pumpen kommer att dra flödet-bufferten från reservoaren genom flödeskammaren i sprutan. OBS: Denna slang innehåller också en in-line Luer injektionsöppning, vilket gör att PMN att injiceras med en nål i en kör experiment utan att stoppa flödet och skapa luftbubblor.
  5. Byt ut den tomma flödeskammare med flödet-kammare som innehåller TNF-α-behandlad HUVECs ansluter flödesbuffert innehållande rör och placera den i mikroskop scenen (Figur 1C). Nyp bort rören innan kopplats från och tillm till kamrarna innehåller HUVECs, som inte nyper bort kan resultera i bildandet av luftbubblor inne i slangen och / eller flödeskammare.
  6. Justera flödeshastigheten till en dyn / cm 2, i enlighet med fysiologiska flödeshastigheten i postkapillära venoler (1-5 dyn / cm 2).
  7. Record Differential Interference Contrast (DIC), FITC (488 nm) och Alexa Fluor 647 (647 nm) samtidigt med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop.
  8. Injicera PMN (steg 4.1) långsamt i flödessystemet via in-line Luer injektionsport (figur 1D) med 1 ml sprutor.
  9. Efter några minuter, leukocyter visas, följa och transmigrera. Stoppa experimentet vid önskad tidpunkt genom att koppla bort slangen från flödeskammaren och pipettering fixativ (3,7% formaldehyd i PBS) i flödeskammaren. Tillåt fixering under 10 min, följt av tvättning med PBS. Data analyseras med bildbehandlingsprogram (se material och utrustning tabell).
    OBS: Utför han experiment med en konfokala laserskanning mikroskop utrustat med en klimatkammare med en konstant temperatur på 37 ° C, 5% CO2, och en 63X olja-objektiv.

Representative Results

Vi testade först om antikropparna inte interfererar med barriärfunktion av endotelet. Vi mätte motståndet i endothelial monolager med hjälp av elektrisk cell-substrat impedans avkänning (ECIS). Mer information finns i Van et al. Buul 13 Ingen förändring i resistans observerades när anti-VE-cadherin fluorescensmärkt antikropp tillsattes till cellerna (Figur 2A). En anti-VE-cadherin antikropp som är välkänd för att blockera VE-cadherin funktion minskade motståndet dramatiskt (Figur 2A). Dessutom, de antikroppar som används för avbildning inte förändrar dynamiken i VE-cadherin, som bedömdes genom mätning av fluorescerande återhämtning efter fotoblekning (FRAP) av VE-cadherin-GFP (Figur 2B).

Efter 1-2 minuter, neutrofiler följs den aktiverade endothelial monolager som kan visualiseras i DIC-kanalen (figur 3A). Efter genomsökning efter 5-30 sec, den stora majoriteten av neutrofiler transmigrated genom endothelial monolager genom cell-cell junctions som märkts med antikroppar riktade mot PECAM-1 och VE-cadherin. Under processen att diapedes, fördelningen av VE-cadherin och PECAM-1 följdes i realtid (figur 3B). På platserna för neutrofila diapedes, VE-cadherin var lokalt störs och PECAM-1 visade en ringliknande struktur. Efter avslutad diapedes, korsningar nära och VE-cadherin och PECAM-1 klart flyttade vid ställena för diapedes (Figur 3C). Observera att delar av anti-PECAM-1-antikropp detekterades på ytan av neutrofila när neutrofila nådde baso-laterala sidan av endotel. Men det hindrade inte neutrofiler från att korsa endotel. De observerade dynamiken i VE-cadherin i realtid under neutrofila transendotelial migration var överens med arbetet av Shaw och kollegor somvisade, med hjälp av konfokalmikroskopi och VE-cadherin-GFP-transfekterade endotelceller, som VE-cadherin-GFP sprids i sidled när leukocyter korsade endothelial cell-cell junctions 14. Arbetar också med Su och medarbetare underströk våra observationer av PECAM-1. De visade att, intill sido VE-cadherin diffusion på leukocyt passagen, PECAM-1 var lokalt åter klassificeras i en ring runt transmigrating neutrofil 15.

Figur 1
Figur 1 In vitro-flödeskammaren. (A) Pil indikerar reservoar från vilken mediet behöver uppdateras. (B) Silikon slang som ansluter flödeskammare med in-line Luer injektionsöppning som används för att injicera PMN utan att koppla bort slangen (pilspets). (C) Connektion av ett tomt flödeskammaren till reservoaren kolv fylld med 37 ° C flödes-buffert (pilspets). (D) Anslutning av flödeskammaren med TNF-α-behandlade HUVEC till flödes-buffert-innehållande rör och placerades i mikroskopets objektbord (pilspets).

Figur 2
Figur 2 VE-cadherin antikroppar inte stör junctionala dynamik eller funktion. (A) Endothelial cellmonoskiktet impedans mäts med ECIS. Y-axeln uttrycker impedansen i ohm och x-axeln representerar tiden i timmar. VE-cadherin antikropps klon 55-7H1, märkt med ALEXA647 (blå linje) eller isotyp IgG-ALEXA647 styrning (röd linje) ändrar inte endotelceller monolager impedans, medan VE-cadherin blockerande antikropp CL75 (svart linje) sänkte impedansen . (B

Figur 3
Figur 3 VE-cadherin och PECAM-1 fördelning under neutrofila TEM i realtid. (A) neutrofila (markerad med vit linje) vidhäftning på endotelet och korsar cell-cell korsningen utan att påverka fördelningen av VE-cadherin och PECAM -1. (B) Neutrofil korsar endoteliala monoskiktet genom de cell-cell junctions. En lokal dispersion av VE-cadherin kan observeras och PECAM-1 när ett neutrofila sticker genom cell-cell junctions. White line illustrerar neutrofila närvaro fortfarande på toppen av endotel. Gul linje visar neutrofila membran that är redan under endotelet. (C) neutrofila har helt passerat endothelial monolager. VE-cadherin och PECAM-1 är flyttat till områden av diapedes. Gul linje illustrerar gränser transmigrated neutrofila. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

För detta protokoll är det viktigt att förhindra uppkomsten av luftbubblor i flödeskammare, eftersom detta kommer att leda till cell apoptos och en störd monolager. För att undvika detta vill vi betona att särskilt intresse för steg 4.2 och 4.5, där rören är anslutna till flödeskammaren. Ett annat viktigt steg i protokollet är priming av PMN som hålls vid RT genom att inkubera dem under 15-30 minuter vid 37 ° C före injektion dem till flödeskammaren (steg 4.1). Detta resulterar i priming av leukocyt-integriner, vilket tillåter dem att följa adhesionsmolekyler såsom ICAM-1 eller VCAM-1 på endotel.

Detta protokoll är inte begränsad att studera transmigration av neutrofiler. Även andra leukocyttyper såsom monocyter eller lymfocyter kan användas. Observera att steg 4.1, det vill säga, priming leukocyterna kan skilja mellan leukocyttyper. Dessutom kan andra typer av endotelceller användas. För detta är det fortfarande kritiskatt stimulera endotelceller med lämpliga inflammatoriska stimuli såsom TNF-α eller IL-1β. Om neutrofiler inte svarar i transmigrating, kan man överväga att behandla neutrofiler kort (5 min) med N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-L-fenylalanin (fMLP) peptid 16. Detta kommer att stimulera neutrofiler, särskilt deras integriner, ännu längre, vilket gör dem mer benägna att ansluta sig till endotelet.

Typiskt 1 dyn / cm 2 flödeshastighet används. Denna flödeshastighet mäts i postkapillära venoler, platser där de flesta leukocyter transendotelial migration sker 17. Med användning av de beskrivna flödeskamrarna, är det möjligt att öka flödeshastigheten upp till 10 dyn / cm 2. Det är dock inte lämpligt att öka skjuvning ytterligare. Det kan resultera i oönskat läckage av slangen och att cellerna lossnar från den flödeskammaren.

De resultat som beskrivs i figur 3 indikerar att dessaantikroppar kan användas för att visualisera och studera dynamiken i endotel cell-cell junctions under leukocyt diapedes. Särskilt utöver de befintliga Transmigration analyserna detta protokoll gör det möjligt att diskriminera paracellulär från transcellulär migration under fysiologiska flödesförhållandena i realtid. Eftersom antikropparna färga cell-cell junctions kan man poäng antalet leukocyter som korsar VE-cadherin / PECAM-1-positiva korsningar kontra ej fast VE-cadherin / PECAM-1 platser. På så sätt transcellulär migration kan särskiljas från paracellulär migration.

Det är viktigt att understryka att dessa antikroppar inte stör funktionen hos de proteiner de binder till: den PECAM-1-antikropp som används i denna studie är riktade mot den andra extracellulära domänen. Endotelceller som ströks ut i närvaro av antikroppen visade inte några defekter i spridnings eller bilda ett monoskikt, vilket tyder på att antikroppen åtminstone inteinterferera med homotypiska interaktioner mellan endotelceller. i tillägg till detta, vet båda antikropparna inte försämra förmågan hos neutrofiler att migrera genom den endoteliala monoskiktet. Dessutom är antalet neutrofiler som transmigrera över endothelial monolager i frånvaro eller närvaro av antikropparna inte ändrats (data visas ej). Viktigt ger konfokal laserscanningsmikroskopi oss möjlighet att spela in olika fluorescerande kanaler och DIC samtidigt.

Således gör denna analys studerar dynamiken i VE-cadherin och PECAM-1 samtidigt när en neutrofila korsar endothelial cell-cell korsning och kommer att hjälpa till att förstå varför leukocyter välja en väg över den andra, det vill säga, paracellulär kontra transcellulär.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
μ-Slide VI IBIDI 80606 Flow-chamber
0.45 μm filter  Whatman/GE Lifesciences 10462100
1 ml Syringe  BD Plastipak 300013
20 ml Syringe  BD Discardit II 366296
21 G Needle  BD Microlance 301155
Albumin  Sanquin 15522644
Ammonium chloride (NH4Cl) Merck 1009245000
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 449709
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors Lonza CC-3156 + CC-4176 media
EDTA (Titriplex III) Merck 1370041000
Falcon tubes  Corning Life Sciences 352096
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-2MG FN
Glucose Sigma-Aldrich G7528
HEPES Sigma-Aldrich H3375
In-line Luer injection port  IBIDI 10820
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4•7H2O) Merck 105886
PECAM-1-ALEXA-647  BD Pharmingen 561654 clone WM59
Percoll  GE Healthcare Life Sciences 17-0891-09
Phosphate Buffered Saline Fresenius Kabi  Nederland M090001/01NL PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) Merck 1048540500
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) Sigma-Aldrich P5504
Silicone Tygon 3350 tubing VWR 228-4331 tubing
Sodium chloride (NaCl) Calbiochem (Millipore) 567441
Syringe pump  Harvard Apparatus model number 55-5920
TNF-α  Peprotech 300-01A tumor necrosis factor
Trisodium citrate  Merck 1.06447.5000 TNC
Vacuettes Greiner, Germany 980044
VE-Cadherin-FITC  BD Pharmingen 560411 clone 55-7H1
Zeiss LSM510 META  Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany
Zen Software 2008 Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
  3. Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).
  4. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
  5. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
  6. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  7. Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
  8. Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
  9. Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
  10. Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
  11. Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
  12. Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
  13. Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
  14. Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
  15. Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
  16. Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
  17. Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).

Tags

Immunologi leukocyter Human navelvenendotelceller (HUVEC) transmigration VE-cadherin PECAM-1 endotel transcellulär paracellulär
Realtid avbildning av endotelceller-cells Junctions Under neutrofila Trans under fysiologiska Flow
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kroon, J., Daniel, A. E.,More

Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J. Vis. Exp. (90), e51766, doi:10.3791/51766 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter