Summary
Enkelte fluoroforer kan lokaliseres med nanometer præcision ved hjælp af FIONA. Her er en sammenfatning af FIONA teknik er rapporteret, og hvordan man udfører FIONA eksperimenter beskrives.
Abstract
Fluorescensimagografi med én-nanometer nøjagtighed (FIONA) er en enkel, men nyttig teknik til lokalisering enlige fluorforer med nanometer præcision i xy-planet. Her er en sammenfatning af FIONA teknik er rapporteret og eksempler på forskning, der er blevet udført ved hjælp af FIONA er kort beskrevet. Første, hvordan at oprette det nødvendige udstyr til FIONA eksperimenter, dvs en total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om indretning af optik, er beskrevet. Så hvordan man udfører en simpel FIONA eksperiment på lokalisering immobiliseret Cy3-DNA enkelte molekyler ved hjælp af passende protokoller, efterfulgt af brug af FIONA at måle 36 nm trin størrelse med en enkelt afkortet myosin Va motor mærket med en kvantepunkt, er illustreret. Endelig er de seneste forsøg på at udvide anvendelsen af FIONA til tykke prøver rapporteret. Det er vist, at ved hjælp af en nedsænkning i vand mål og kvantepunkter gennemblødt dybt i sol-geler og kanin øje hornhinder (>200 um), lokalisering præcision på 2-3 nm kan opnås.
Introduction
Omkring 1882 fandt Ernst Abbe, at løsningen af et synligt lys mikroskop er ~ λ / 2NA eller ~ 200 nm (hvor λ er bølgelængden og NA er den numeriske blænde) 1,2. Derfor ethvert objekt er mindre end denne dimension ville fremstå som en diffraktionsbegrænset stedet i et optisk mikroskop. Det er imidlertid muligt at bestemme centrum af stedet, det vil sige placeringen af objektet, med en meget højere præcision 3. Fluorescensimagografi med én-nanometer nøjagtighed (FIONA) er en enkel, men nyttig teknik til lokalisering enlige fluorforer med nanometer præcision i xy-planet 4. Præcisionen af lokalisering, σ μ (dvs. standardafvigelsen for gennemsnittet), afhænger af det samlede antal indsamlede fotoner, 
, Hvor N er fotontælling, s er standardafvigelsen af det fluorescerende plet, a erpixelstørrelse den billeddannende detektor, og b er standardafvigelsen af baggrunden 3,4. For en fluorofor udsender ~ 10.000 fotoner, kan FIONA opnå ~ 1 nm præcision 4.
FIONA kan anvendes til nøjagtigt at bestemme positionen af en stationær emitter eller en bevægende en (forudsat billeder kan tages hurtigt nok). FIONA kan anvendes sekventielt til rammerne for filmen og dermed spore bevægelsen af enkelt molekyle 4- 8. Foto-beskyttende reagenser kan være nødvendig for at sikre, at prøven ikke photodegrade. Desuden kan den fluorescerende objekt selv være af enhver størrelse, mindre eller større end diffraktion grænseværdi- f.eks, kan det bestå af en organel (~ 1 um) med mange fluorescerende proteiner dispergeret på dens membran. Brug FIONA kan stadig give en meget nøjagtig (nanometer) gennemsnittet af vedkommendes gennemsnitlige center-of-masse. Den store forbedring i lokalisering præcision af Fiona tillader løse nanometer-skala bevægelser over tid. Dette har skubbet mikroskopi i den molekylære længdeskala 4- 8.
Siden sin opfindelse, har varianter af FIONA blevet udviklet. For eksempel, lys-felt billeddannelse med en-nanometer nøjagtighed (bFIONA) 9, en lille variant af Fiona, billeder og lokaliserer tætte genstande såsom melanosomer in vivo (mørke objekter, der indeholder pigmentet melanin) med transmitteret lys. Desuden har FIONA blevet anvendt til at løse flere farvestoffer. For eksempel, single-molekyle høj opløsning billeddannelse med fotoblegning (rejer) 10,11 eller single-molekyle høj opløsning colokalisering (SHREC) 12 er blevet udviklet til at løse to farvestoffer inden for ca 10 nm. (Bemærk at dette er opløsning, dvs, hvor præcist man kan fortælle identiske farvestoffer fra hinanden.) På det seneste har FIONA analyse bidraget til lokalisering processen med visse super opløsning mikroskopi såsom stokastisk optisk reconstruction mikroskopi (STORM) 13- 15 og foto-aktiverede lokalisering mikroskopi (PALM) 16, hvor midlertidige mørke fluoroforer er begejstrede, og derefter fluorescens er lokaliseret. Ved gentagne spændende en forholdsvis lav tæthed af farvestoffer (mindre end én pr diffraktion begrænset stedet), og derefter indsamle fluorescens, analysere hver af dem af Fiona, kan man opbygge en høj opløsning kort. Resolutionen er så bare begrænset af antallet af fotoner hver farve lægger ud, samt ting som at holde prøven stationære (herunder f.eks mikroskopbordet) under overtagelsen.
I dette papir, en sammenfatning af FIONA teknik og kort beskrive eksempler på forskning, der er blevet udført ved hjælp af FIONA er rapporteret. Første, hvordan at oprette det nødvendige udstyr til FIONA eksperimenter, dvs en total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om indretning af optik, er beskrevet. Så hvordanforetage en simpel FIONA eksperiment på lokalisering immobiliseret Cy3-DNA enkelte molekyler ved hjælp af passende protokoller, er illustreret. Efter dette, at brugen af FIONA måle 36 nm trin størrelse med en enkelt afkortet myosin Va motor mærket med en kvantepunkt præsenteres. Myosin Va er en væsentlig bearbejdende motor protein, som bærer cellulær ladning mens translokere langs actinfilamenter. Her er en myosin Va konstruere afkortet bruges til at fjerne domæner er irrelevante for trinstørrelsen, og med en FLAG-mærke føjet til C-terminalen for at tillade let mærkning med kvantepunkter funktionaliseret med anti-FLAG-antistoffer. Dette forsøg udføres under lavt ATP at bremse myosin og tillade anvendelse af tilstrækkeligt lange eksponeringstider for at få en god fotontælling i hver ramme. Enhver tilstrækkeligt lyse fluorescerende mærke kunne erstattes i følgende protokol. Endelig er de seneste bestræbelser på at udvide anvendelsen af FIONA til tykke prøver rapporteret. Som en proof-of-principle blev kvantepunkter gennemblødti sol-geler og kanin øje hornhinder og derefter filmede og lokaliseret ved hjælp af FIONA. Til billeddannelse, en 60X nedsænkning i vand mål med NA = 1,2 blev anvendt, fordi dette mål har en længere arbejdstid afstand end tidligere anvendt 100X oliebestandighedsobjektet. For at kompensere for tabet i forstørrelse i målet, var en ekstra-forstørrelsesluppen (3,3x eller 4.0x) indsat i emissionen sti. Desuden epi-fluorescens (ikke TIR) mikroskopi skal bruges til at få adgang dybe områder i de tykke prøver. Det er vist, at kvantepunkter gennemvædet dybt i sol-geler og i kaninøje hornhinder (Z> 200 um) kan lokaliseres med 2-3 nm præcision.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiske retningslinjer: Hornhinden væv fra kaniner blev indsamlet i henhold til University of Illinois Institutional Animal Care og brug retningslinjer.
1. TIRFM Opsætning
BEMÆRK: Bær laser sikkerhedsbriller hele tiden.
- Sørg for, at alle nødvendige optiske komponenter, der er opført på listen over materialer er tilgængelige og klar til tilpasning. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge erstatninger med tilsvarende funktioner fra andre firmaer. Sørg for, at Spejle og linser bør have anti-reflekterende (AR) belægninger matcher laseren er i brug.
- Indstil højderne af alle de optiske komponenter til højden af midten af mikroskopet tilbage porten.
- Monter laser, laser lukker og ND-filter (s). Brug ND-filtre til at dæmpe lasereffekten ned så lavt som muligt og samtidig holde strålen synlig. Spænd skruerne med passende unbrakonøgler.
- Planlæg en strålegangen og markere det med tape eller markør på det optiske bord (dotted blå linier i figur 1). For overskuelighedens skyld, holder lige stier langs linjer af huller på den optiske bord.
- Placer spejl M1 (figur 1) ved den første rigtige vinkel tur. Anbring de to iris langs den anden lige sektion af den planlagte strålegangen. Juster både position og hældning M1, således at laseren går gennem iris.
- Sted spejl M2 (figur 1) ved den anden ret vinkel drejning. Placer 10X stråleudvider (L1 og L2, figur 1) langs den tredje lige del af stien. Justere sin hældning, således at strålen ekspanderen er parallel med både optisk bord og den planlagte strålegangen.
- Juster M1 og M2 iterativt, således at laseren går straightly gennem centrene af de to linser af strålen expander. Gentag dette trin, indtil strålen profil udvidede strålen er ikke klippet Gauss.
- Juster M1 at centrere strålen på L1 (Fifigur 1) og M2 for at centrere strålen L2 (figur 1) iterativt. En dårlig stråle profil betyder normalt laseren er klippet; bruge et stykke hvidt papir til at blokere strålen efter stråleudvider at kontrollere strålen profil med øjnene. For høj præcision analyse anvendes en optisk stråle profiler.
- Juster afstanden mellem L1 og L2, således at strålen er kollimeret. Gentag trin 1.8 og 1.9 hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Når strålen størrelse ikke ændrer sig med afstanden, strålen er kollimeret nok til en TIRFM opsætning. For yderligere at forbedre strålekollimation kunne værktøjer såsom en klipning interferometer anvendes. En typisk stråle størrelse efter ekspansion er ~ 20 mm. - Shutter laseren. Skru mikroskop mål, og skru en fluorescerende mål tilpasning. Sted spejle M3 og M4 (figur 1) til at lede den udvidede bjælke i mikroskop-port og på den dikroiske spejl inde i tårnet. Sørg for, at laserstrålen preller af than dichroic og mod loftet.
- Juster M3 at centrere den lyseste del af strålen på det fluorescerende mål, og M4 at justere strålen tilt at være lodret.
- Shutter laseren og skru det mål igen. Hvis justeringen i det foregående trin er gjort godt, bør der være en symmetrisk plet forlader mål. Finjustere hældninger i M3 og M4 at optimere laser magt og stråle-profil ud af målet.
- Monter en EMCCD kamera til mikroskopet og tilslutte kameraet til en computer. Start softwaren til kameraet.
- Monter en fluorescerende prøve (opløsning af fluoroforer) på mikroskopet. Kig på den lyse fluorescerende plet på kameraet. Kontroller, at stedet ikke forskubber på skærmen som fokus ændres.
- Placer TIR linse (L3, figur 1) på XYZ oversættelse fase i en afstand fra bagsiden brændplan af det mål, som er lig med brændvidden for L3 (~ 30 cm). Justere placeringen af L3sådan at laseren går gennem midten af linsen.
- Oversæt L3 langs strålegangen for at justere strålekollimation. Sørg for, at strålen stadig er centreret på skærmen, og symmetrisk form.
BEMÆRK: belysning område på prøveplanet stiger med faldende TIR-objektivets brændvidde. Generelt skal du bruge den mindste brændvidde, der kunne passe på set-up. - Oversæt L3 vinkelret på strålevejen at vippe stråle ud af målet. Hold oversætte TIR linse, således at TIR er opnået. En prøve af fluorescerende perler observere gennem EMCCD kamera, og finjustere L3 at få god SNR.
Figur 1. Optisk konfiguration for total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM).
2. FIONA på Cy3-DNA
- Clean objektglas og dækglas: Skyl objektglas og dækglas med Hedeselskabet 2 O og isopropanol og tørre dem med nitrogengas; placere dias og dækglas i plasmaet renere i 5 minutter under argon plasma.
- Construct prøvekamre (som skitseret i figur 2).
- Placer en væv på bænken og derefter sætte et stykke linsepapir på toppen af vævet. Anbring diaset på objektivet papiret. Sørg for, at den rene side af slæden er opad.
- Påfør to strimler af dobbeltklæbende tape på glider langs de lange kanter, hvilket efterlader et hul på 3-5 mm i centrum. Placer den rensede dækglas på toppen af dias. Sørg for, at den rene side af dækglasset vender diaset.
- Brug en pipettespids til at presse ned over dobbeltklæbende tape. Brug en skraber for at fjerne overskydende tape fra objektglasset, således at båndet forbliver kun under dækglasset.
BEMÆRK: De åbne ender af kammeret er åben og tjener som indløb og udlad. Volumen Kammeret er flere mikroliter.
Figur 2. Skitse af en typisk prøve kammer (a) ovenfra.; (B) Side view fra højre; (C) Side view from front.
- Immobilisere Cy3-DNA på indvendige overflader prøvekamrene.
- Forbered T-50-puffer (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 50 mM NaCI). Forbered BSA-biotin i T-50 ved en slutkoncentration på 1 mg / ml. Forbered T50-BSA-puffer ved opløsning af BSA i T-50 ved en slutkoncentration på 10 mg / ml.
- Forbered 0,5 mg / ml neutravidin i T50-BSA-buffer. Forbered biotinyleret Cy3 mærket DNA (Cy3-DNA) i T50-BSA ved en slutkoncentration på 5-10 pM.
- Afpipetteres 10 pi BSA-biotin (1 mg / ml) i prøven kammeret. Vent i 5 min.
- Vask kammeret med 40 ul T50-BSA. Pipette 20 pi Cy3-DNA i prøven kammeret. Inkuber i 5 minutter og derefter vaske kammeret med 80 ul T50-BSA.
- Billede Cy3-DNA enkelte molekyler under TIRFM.
- Forbered billeddannelse buffer (100 ul) ved at blande 1 pi protocatechuat-3,4-dioxygenase (PCD, 5 uM), 4 pi Protocatechuic syre (PSA, 62,5 mM), 50 ul 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylsyre (Trolox, 2 mM i T-50), og 45 pi T50-BSA.
- Pipette i 30 pi imaging buffer og vente 8-10 min.
- Monter prøven til billeddannelse på en TIRFM der er udstyret med en grøn laser (532 nm), en 100X oliebestandighedsobjektet (1,45 NA), og en EMCCD kamera.
- Indstil eksponeringen tid til 100 til 500 msek og EM gevinst til 25 til 100. erhverve en film af prøven til 1,000 rammer.
- Udfør FIONA dataanalyse på de optagede billeder af Cy3-DNA.
- Bestem den effektive pixelstørrelse (dvs. omregningsfaktor fra pixels til nanometer) ved at dividere det fysiske pixel-størrelse (læs fra specifikationen ark af EMCCD kamera) med den totale forstørrelse (forstørrelse af mikroskopet mål ganget med ekstra forstørrelser).
- Bestem omregningsfaktor fra pixel intensiteter for foton tal ved at dividere CCD følsomhed (dvs. elektroner pr A / D-tælle, læse fra specifikationen af CCD kamera) ved elektron multiplikator (EM) gevinst anvendes under billedet erhvervelse.
- Kompilere og køre FIONA.pro til FIONA analyse. Brug dette IDL program til at importere den erhvervede billedet, for at indtaste den effektive pixelstørrelse (fra trin 2.5.1) og omregningsfaktor fra intensitet til foton-nummer (fra trin 2.5.2) og til at vælge steder til FIONA analyse.
BEMÆRK: I slutningen, den program vil udlæse montering resultater med 2D Gauss-funktioner, såvel som de samlede foton numre og lokalisering præcision. Et typisk resultat er vist i den del af repræsentative resultater og 4c-4d. - Kompilere og køre phcount.pro at karakterisere fotontælling. Brug dette IDL program til at måle det gennemsnitlige antal fotoner, der udsendes af en fluorofor før fotoblegning at importere den erhvervede billede og indtaste omregningsfaktoren fra intensitet til foton-nummer (fra trin 2.5.2).
BEMÆRK: Programmet vil så opdage fluorescerende pletter automatisk (manuelt valg er en mulighed), beregne fotontælninger som funktion af ramme nummer, og output spor af fotontællinger.- Kassér dårlige spor og angiv ramme intervaller efter fotoblegning for basal korrektion. Ved afslutningen, vil programmet udsende en liste af de samlede foton numre for alle pletter ikke kasseres. Derefter plotte fordelingen af foton numre, og det passer til udlodningention med en eksponentiel henfald at få den gennemsnitlige foton nummer. Et typisk resultat er vist i den del af repræsentative resultater og figur 4e-4f.
3. FIONA Anvendt at kvantificere Motor (f.eks Myosin på actin) Dynamics på nanometerskala
- Polymerisere actin (dvs. forberede F-actin) en dag før FIONA eksperiment.
- Opløs G-actin-(monomer) og biotin G-actin-(monomer) til 10 mg / ml med den generelle actin puffer. Stir at sørge begge er helt opløst, og holde begge på is.
- Bland 10 pi G-actin-(monomer) med 1,7 pi biotin G-actin i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 100 pi iskold actinpolymerisation puffer.
- Lad blandingen natten over ved 4 ° C (F-actin-formet) og derefter tilføje Hedeselskabet 2 O til et samlet volumen på 1 ml.
- Opbevar actinfilamenter (F-actin) ved 4 ° C til senere brug i forsøg.
BEMÆRK: Filaments vil opløse og forkorte tiden, men kan anvendes i mindst to uger.
- Forbered prøven til billeddannelse.
- Lav en prøve kammer (som beskrevet i protokol 2.1 og 2.2). Pipetter i 20 pi biotinylerede BSA ved 1 mg / ml i Hedeselskabet 2 O. Inkuber i 10 minutter. Skyl med 30 ul Hedeselskabet 2 O.
BEMÆRK: Dette blokerer glasoverfladen og fastsætter biotin for binding af actinfilamenter. Biotinyleret poly-L-lysin - polyethylenglycol (PLL-PEG) kunne tjene samme funktion. - Afpipetteres i 0,5 mg / ml neutravidin. Inkuber i 2 min og derefter vaske kammeret med 30 ul M5 buffer.
- Afpipetteres i den forberedte F-actin-fortyndet 25 gange i almindelighed actin buffer, til slutkoncentration ~ 0,004 mg / ml. Vent 10 minutter, skyl kammeret med 30 ul buffer.
- Fortynd myosin Va med FLAG tags 30 gange i M5-buffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl2, 25 mM KCI, 1 mM EGTA) til en endelig koncentration aff 250 nM. Bland 1 gl myosin med 1 pi Anti-Flag-Qdot705 (~ 1 uM, konjugeret fra Anti-Flag antistoffer og Qdot705 hjælp af Qdot705 antistofkonjugation Kit ifølge brugsanvisningen fra producenten). Tilføj 8 pi M5 til at fylde til 10 gl. Pipette op og ned for at blande godt. Inkuberes i 10 minutter på is.
BEMÆRK: Dette giver en blanding af 1 motor til 4 kvantepunkter, på ~ 25 nM myosin koncentration.
- Lav en prøve kammer (som beskrevet i protokol 2.1 og 2.2). Pipetter i 20 pi biotinylerede BSA ved 1 mg / ml i Hedeselskabet 2 O. Inkuber i 10 minutter. Skyl med 30 ul Hedeselskabet 2 O.
- Billeddannelse af myosin gå på actin.
- Forbered imaging buffer (100 ul) ved at blande 84 pi M5-BSA (M5 buffer med 1 mg / ml BSA), 1 pi ATP (50 uM i Hedeselskabet 2 O), 2 pi DTT (500 mM i Hedeselskabet 2 O), 1 pi CK (500 U / ml), 5 pi CP (200 mM), 1 pi PCD, 4 pi PCA, 1 pi myosin-qdot efter fortyndet anden 10-fold til 2,5 nM myosin koncentration og 1 pi BME.
- Pipette i 20 pi imaging buffer til at prøve kammer og inkuberes i 8-10 min.
- Billede prøven på TIRF mikroskop ved 30 msek eksponering. Anskaf mindst 1.000 frames. Juster lydstyrken for myosin-qdot i trin 3.3.1 hvis det er nødvendigt.
- Udføre dataanalyse og finde trin-størrelse myosin gå.
- Åbn videofil i ImageJ 17 og beskære videoen omkring en bevægende plet. Beskære et stort nok område, at stedet får aldrig inden for 20 pixels kanten, og sørg for der er ingen andre steder i videoen. Sørg for, at denne stedet bevæger sig i en lineær bane.
- Spor stedet gennem videoen til at generere x og y-koordinater gennem tiden, i pixels, ved at anvende FIONA analyse (trin 2.5.3) til hver eneste frame af videoen.
- Konverter pixel til nanometer, som beskrevet i det foregående afsnit.
- Beregn forskydning fra den første stilling som en funktion af tiden.
- Kør t-test på forskydning til opnåelse trinnene myosin walking.
BEMÆRK: Programmet omfattede t-test (step_t_test.zip) kodes i IDL og konbestår af 14 subrutiner i mappen.- Åbn alle subrutiner i IDL og samler alle to gange. Derefter køre mtltyanalysis_ttest.pro og vælg en tekst-fil, der kun indeholder data distance i en enkelt kolonne. En udgang Excel-fil vil blive genereret, som indeholder de rå data, pasform og størrelsen af trinnet.
- Slet alle nul-værdier fra søjlen trinstørrelse. Plot fordelingen af trinstørrelser anvender Origin eller Matlab. Montér en gaussisk til histogrammet.
BEMÆRK: Step størrelser af nul-værdier skal slettes, fordi et trin på nul betyder, at ingen skridt er taget fra den foregående ramme. Beslaget giver en top omkring 36 nm (som vist i figur 5).
4. Tyk Sample Forberedelse til FIONA
- Forbered kvantepunkter indkapslet i sol-gel.
- Bland 4,5 ml TMOS 1 ml Hedeselskabet 2 O og 100 ul HCI (120 mm). Sonikeres blandingen på is i 30 minutter i ultralydsrenser specified i listen over stoffer (frekvens = 40 kHz, varmelegeme = OFF). Bland opløsningen hver 10 min.
- Fortynd 1,5 pi Qdot605 i 1,5 ml HEPES (50 mM pH 7,2). Bland opløsningen med 1,5 ml TMOS fra det foregående trin.
- Hæld blandingen i et glas bund fad. Forsegl glasbund fad med Parafilm og opbevares ved 4 ° C i 1. 5 timer.
- Der tilsættes 2 ml 1% BME i PBS til prøven skål og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter før billeddannelse.
- Forbered hornhinde prøve farves med kvantepunkter.
BEMÆRK: Rabbit-øjne var gaver fra Dr. Marina Marjanovic.- Adskil hornhinden fra øjnene, og skær den i 3 mm x 3 mm stykker.
- Fortynd 1 pi Qdot 605-streptavidin i 1 ml PBS. Inkubér hornhinden væv med 1 nM Qdots opløsning ved 4 * C i 1 time. Vask vævet med PBS.
- Tag en ren glasplade og en # 1,5 dækglas. Put 4 lag af dobbeltklæbende tape på objektglasset langs den lange side, ennd sætte yderligere 4 lag dobbeltklæbende tape parallel til den tidligere bånd og efterlade en kanal omkring 1 cm i mellem. Sæt væv fra det foregående trin i midten af kanalen, og dække det med et dækglas.
- Tryk forsigtigt på siderne af dækglasset for at gøre det holde til båndene. Fugt kanal med 50 gl PBS før billeddannelse.
- Billede kvantepunkter i sol-gel og hornhinden.
- For FIONA billeddannelse i tykke prøver, skal du bruge en 60X vand-immersionsobjektivet med arbejde afstand på 0,27 mm eller et 60X vand-immersionsobjektivet med arbejde afstand på 0,28 mm.
- Monter prøve på mikroskopet. Juster TIRF linsen, således at den når epi-fluorescens-tilstand (dvs. laserstrålen kommer ud af målet med en vinkel mod dækglasset). Indsæt et ekstra forstørrelsesluppen (3,3x eller 4.0x).
- Flyt brændplan af målet til en ønsket z position (f.eks> 200 um). Optag billeder af immobilekvantepunkter i prøven.
- Udfør FIONA analyse som beskrevet i afsnit 2.5 i denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et typisk mål-typen TIRFM opsætning er vist i figur 3. Først blev overflade-immobiliserede Cy3-DNA-prøve afbildes. Et typisk billede er vist i figur 4a. Billedet blev taget med eksponeringstid 0,5 sek, med EM gevinst = 50 og CCD følsomhed = 12.13 til kameraet. Pointen-spread funktion (PSF) med en enkelt Cy3-DNA-molekyle er vist i figur 4b (fra stedet angivet ved pilen i figur 4a), hvor farve-linjen viser omfanget af pixel intensitet. De faktiske fotontælninger kunne beregnes ved at gange de pixel intensiteter med en omregningsfaktor, α = CCD følsomhed / EM gevinst. Denne stedet indeholder cirka 14.000 fotoner (efter korrektion for baggrund).
PSF er derefter forsynet med en todimensional Gaussisk funktion f (x, y) = z 0 + A · exp (- (x-μ x) 2 / (2s x 2) - (y - & #181 y) 2 / (2s y 2)), som vist i figur 4c (med montering rester er vist i figur 4d). Præcision lokalisering beregnes derefter ved 
, Hvor i = x eller y, r jeg er standardafvigelsen af armaturet, N er det samlede foton nummer et er pixelstørrelsen, og b er standardafvigelsen for baggrunden. I dette specifikke eksempel N = 14.528, a = 106,67 nm, s x = 115,5 nm, S y = 109,4 nm, b = 18,9, hvilket resulterer i localization præciseringer af σ x = 1,3 nm og σ y = 1,2 nm. Lokaliseringen præcision af en fluorophor er tilnærmelsesvis proportional med 1 / √n, dvs de flere fotoner er, jo mere præcis lokalisering. Men i konkrete anvendelser af FIONA, varighed af eksperimentel observation er en anden overvejelse. Derfor er manbør generelt indse afvejning mellem lokalisering præcision og observation varighed og planlægge. I sådanne situationer er det som regel nyttigt at bestemme, hvor mange fotoner i alt en fluorofor er i stand til at udsende før fotoblegning. En typisk spor af fotontælling vs ramme er vist i figur 4e. En eksponentiel montering giver, at den gennemsnitlige foton antal ~ 1,4 x 10 6 (Figur 4f).
Dataanalyse proces myosin trinstørrelse måling er vist i figur 5. Først en videofil med godt signal-til-støj af en enkelt myosin, da det går langs en actin filament fanget. 5a viser tre billeder fra en video taget på 100 ms eksponering med 100X oliebestandighedsobjektet. Den bevægelige PSF derefter spores via den beskårne video-fil ved hjælp af en brugerdefineret kode skrevet i IDL at udtrække afstand versus tid oplysninger, der er lagt gennem en T-testfor trin. 5b viser med afstanden versus tid (rød) og trin-finder-udgang (hvid). Lokalisering af fejl i hver ramme tilslører trappe form af spor, så det er afgørende for at opnå en foton tæller i hver ramme, som svarer til en lokalisering fejl mindre end halvdelen af den teoretiske trin størrelse, man ønsker at se. Figur 5c viser trin fra flere spor sammen til én histogram, der er gaussisk fordelte om den sande myosin skridt størrelse. En Gaussisk pasform histogrammet siloer giver et sidste skridt størrelse måling af 35,8 ± 0,4 nm.
Fordi sol-gel og hornhinde prøver er gennemsigtige, kan excitation lasere trænge dybt ned i prøverne uden at blive spredt for meget. Desuden er auto-fluorescens fra prøven minimeres. Når mærket med lav koncentration af kvantepunkter, er det muligt at opsamle fluorescens fra Qdots dybt i prøven med højt signal-støj-forholdet. Denanvendelse af objektive vand giver os arbejdsafstand på 270 eller 280 um, hvilket betyder, at det er muligt at fokusere så langt som 280 um væk fra dækglasset. Dette giver os mulighed for at udføre FIONA analyse på kvantepunkter i tykke prøver. For kvantepunkter i en sol-gel-prøve, lokalisering præcision på 1-2 nm nær dækglasset og 2-3 nm ved 280 um dybt ind i prøven (6a-6b) er opnået. For quantum prikker i en biologisk prøve (del af en hornhinde fra et kaninøje, figur 6e), lokalisering nøjagtighed på 1-2 nm nær dækglasset og 2-3 nm ved ~ 223 um dybt ind i prøven (figur 6c-6d) er opnået. Det bemærkes, at lokalisering præcision forbedres ved anvendelse af den ekstra forstørrelse linse, uden hvilken en lokalisering præcision på 6-7 nm blev opnået. Dette er i overensstemmelse med tidligere numeriske undersøgelser viser, at lokalisering præcision kan forbedres ved at ændre den effektive pixelstørrelse fra ~ 200nm til ~ 50 nm, selv om det samlede antal indsamlede fotoner kan være lavere på grund af yderligere refleksioner / refraktioner 18.
Figur 3. Optisk konfiguration. Den optiske konfiguration af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. A) er et billede, når laseren er i TIRF tilstand og b), er strålen form af laseren på loftet, når laseren er i epi-belysning.
Figur 4. Lokalisering af immobiliseret Cy3-DNA. A) CCD-billede (256 x 256 pixels) af Cy3-DNA. B), CCD-billede af et enkelt Cy3-DNA-molekyle, der er angivet med yellav pil i). c) Montering punktspredningsfunktionen af den fælles Cy3-DNA-molekyle med en todimensional Gaussisk funktion. d) Montering restprodukter fra c). e) Photon tælle vs stelnummer. f) Fordeling af antal fotoner, der udsendes af Cy3 molekyle før fotoblegning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Myosin walking observeret af Fiona. a) Rammer fra eksempel datafil til t = 0 sek, 30 sek, og 60 sek. Myosin-qdot konstruktionen bevæger sig i langs en lige vej og har en god fotontælling (> 5.000) i hver ramme. B) Anvendelse af FIONA til hver ramme Yieninger afstand versus tid spor, som er afbildet i rødt. En trin-finding algoritme baseret på T-test anvendes til derefter udtrække enkelte trin, og output overlejres i hvidt. Trinstørrelser mærkes i hvid i enheder af nanometer. C) skridt fra flere spor er kombineret i et histogram. De målte trinstørrelser er Gauss-fordelt omkring 35,8 ± 0,4 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. FIONA analyse på kvantepunkter dybt i tykke prøver. A) Fluorescerende billede af QD 605 i sol-gel på Z = 280 um med 90X forstørrelse. B) punktspredningsfunktion QD mærket på en). σ x = 2.6 nm, σ y = 2,3 nm. Hver enhed i X og Y-aksen repræsenterer 266,7 nm. C) Fluorescerende billede af QD 655 i kanin hornhinden væv ved Z = 223 um med 360X forstørrelse. D) PSF af QD mærket i C). σ x = 2,2 nm, σ y = 3,6 nm. Hver enhed i X og Y-aksen repræsenterer 44,4 nm. E) Billeder af hornhinden væv monteret på et dækglas. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FIONA er en teknik til at lokalisere positionen af et fluorescerende emitter (organisk fluorophor eller kvantepunkt) med nanometer præcision og tidsmæssig opløsning ned til 1 ms 4- 8. Når nok fotoner indsamles, denne teknik gør det muligt at bestemme positionen af et fluorescerende emitter langt mere præcist end diffraktionsgrænsen (~ 200 nm), og dermed denne teknik åbner en måde at observere, hvad der ikke er blevet set med konventionel / traditionel optisk mikroskopi 4 - 8. Siden sin opfindelse, har FIONA blevet anvendt med succes til at observere gåafstand af mange molekylære motorer, såsom myosiner og kinesins. Mere for nylig, sammen med andet arbejde 3,19, bidrog til lokalisering processen med bestemte teknikker nye super-opløsning, såsom storm og PALM 13- 16.
Den kritiske skridt til at opnå FIONA ligger i antallet af indsamlede fotoner, der påvirkes af forskellige faktører. For eksempel bør den TIRFM opsætning bruges til FIONA eksperimenter være godt afstemt, således at en god polyesterfibre (dvs. ikke-strakt, ikke-stigmatiseret, etc.) er nået, samt en rimelig signal-til-støj-forhold opnås. Desuden bør et mål med en høj NA værdi anvendes til at samle så mange fotoner som muligt.
At indsamle flere fotoner og dermed øge lokalisering præcision, har forskellige oxygenoptagende metoder og reagenser blevet udforsket til at undertrykke fotoblegning og blinker 20- 22. To forskellige oxygenfjernende fremgangsmåder er blevet anvendt i vores laboratorium. Den ene er "gloxy" opløsning (glucoseoxidase og katalase) 20. Den anden er PCA / PCD beskrevet ovenfor 22. De tidligere værker umiddelbart efter blanding, men pH-værdien af opløsningen ændrer sig over tid. Sidstnævnte holder opløsningen kemisk uændret, men en inkubationstid på 8 til 10 min er påkrævet.
Ens vist her, er det også muligt at udvide FIONA for tykke prøver ved hjælp af en 60X nedsænkning i vand mål med NA = 1,2. Dette mål har en længere arbejdstid afstand (0,27 mm) end tidligere anvendt 100X oliebestandighedsobjektet (0,17 mm). For at arbejde med tykke prøver, epi-fluorescensmikroskopi skal bruges. Selvom fordel af lave baggrund af TIRFM ofres, nanometer lokalisering præcision er stadig opnåeligt, mens du bruger lyse kvantepunkter. Denne udvidelse vil være nyttig i tyk væv billedbehandling og medicinske anvendelser.
Anvendelsen af FIONA er begrænset i nogle få aspekter. Først og fremmest, som lokaliseringen præcision afhænger af det samlede antal indsamlede fotoner, den tidsmæssige opløsning af FIONA normalt kompromitteret. For det andet kan FIONA alene kun anvendes på tyndt mærkede prøver. Med andre ord vil FIONA mislykkes, hvis flere fluoroforer er tæt nok sådan deres vævede overlapper hinanden. Hertil kommer, at spredningen af emissionslyset begrænser apdelsen af FIONA i tyk-vævs-billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH Tilskud 068.625 NSF Tilskud 1063188 og på midten af fysik levende celler 0822613. En særlig tak til Dr. Marina Marjanovic i Beckman Institute for Advanced Science and Technology for den gave kaninøjne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-sided tape | 3M | ~75 µm thick | |
| EMCCD camera | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | |
| Fluorescence filter set | Chroma | 49016 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | |
| Biotin G-actin | Cytoskeleton | AB07 | |
| G-actin | Cytoskeleton | AKL95 | |
| General actin buffer | Cytoskeleton | BSA01 | |
| Laser shutter (with driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | ||
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm thick |
| Microscope slide | Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm thick |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Glass bottom dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio | |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Antibody Conjugation Kit | Invitrogen | Q22061MP | |
| MATLAB | MathWorks | ||
| Optical table | Newport Corp | RS4000 Series | |
| 60X Objective | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objective | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17 | |
| 60X Objective | Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71/IX70/IX81 | |
| Origin | OriginLab | ||
| Anti-FLAG antibody | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotin | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatine Phosphokinase from rabbit muscle |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Phosphocreatine di(tris) salt |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Protocatechuic acid |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatechuate-3,4-dioxygenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetramethyl orthosilicate |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| 1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantity: 2 |
| ½” diameter posts | Thorlabs | TR4 | Quantity ≥ 6 |
| 10X beam expander | Thorlabs | BE10M-A | |
| 2” diameter f = 300 mm lens with mount | Thorlabs | LA1256-A, LMR2 | TIR lens |
| Fluorescent alignment target | Thorlabs | VRC2SM1 | |
| Laser safety goggles | Thorlabs | LG3 | |
| ND filter(s) | Thorlabs | FW1AND | |
| Optical beam profiler | Thorlabs | BP209-VIS | |
| Post-mounted iris diaphragm | Thorlabs | ID25 | Quantity: 2 |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ translation stage, ½” travel | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
References
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope. Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued). Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).
- Thompson, R. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. Kinesin Walks Hand-Over-Hand. Science. 303 (5658), 676-678 (2004).
- Yildiz, A., et al. Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).
- Yildiz, A., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).
- Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. Why kinesin is so processive. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).
- Kural, C., et al. Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).
- Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).
- Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).
- Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).
- Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization. Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Zhuang, X., et al. A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding. Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
