Summary
Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.
Abstract
Fluorescentie beeldvorming met een-nanometer nauwkeurigheid (FIONA) is een eenvoudige, maar nuttige techniek voor het lokaliseren van enkele fluoroforen met nanometer precisie in het xy-vlak. Hier een overzicht van de FIONA techniek gemeld en voorbeelden van onderzoek dat is uitgevoerd met FIONA worden kort beschreven. Ten eerste, hoe het opzetten van de benodigde apparatuur voor FIONA experimenten, dat wil zeggen, een totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), met informatie over het uitlijnen van de optica, wordt beschreven. Dan hoe een simpele FIONA experiment uitvoeren aan lokaliseren geïmmobiliseerd Cy3-coderende enkelvoudige moleculen met geschikte protocols, gevolgd door de toepassing van FIONA de 36 nm stapgrootte van een afgeknotte myosine Va motor voorzien van een quantum dot meten geïllustreerd. Tenslotte wordt recente poging om de toepassing van FIONA breiden dikke monsters gerapporteerd. Het blijkt dat met behulp van een water immersie objectief en quantum dots gedrenkt diep in sol-gels en konijnenogen cornea (>200 urn), lokalisatie nauwkeurigheid van 2-3 nm worden bereikt.
Introduction
Rond 1882, Ernst Abbe vond dat de resolutie van een lichtmicroscoop zichtbaar is ~ λ / 2NA, of ~ 200 nm (waarbij λ is de golflengte en NA de numerieke lensopening) 1,2. Daarom geven object kleiner dan de afmeting lijkt als een buigingsbegrensde vlek in een optische microscoop. Het is echter mogelijk om te bepalen het midden van de spot, dat wil zeggen de locatie van het object, met een veel hogere precisie 3. Fluorescentie beeldvorming met een-nanometer nauwkeurigheid (FIONA) is een eenvoudige, maar nuttige techniek voor het lokaliseren van enkele fluoroforen met nanometer precisie in het xy-vlak 4. De nauwkeurigheid van de lokalisatie, σ μ (dwz, de standaardfout van het gemiddelde), afhankelijk van het totale aantal verzamelde fotonen, 
, Waarbij N het aantal fotonen, s is de standaardafwijking van de fluorescerende spot, ade pixelgrootte van de beeldvormende detector, en b de standaarddeviatie van de achtergrond 3,4. Voor een fluorofoor uitzendt ~ 10.000 fotonen, kan FIONA ~ 1 nm precisie 4 bereiken.
FIONA kunnen worden gebruikt om de positie van een stationaire zender of een bewegend on (uitgaande beelden kunnen snel genoeg worden genomen) nauwkeurig te bepalen. FIONA kunnen achtereenvolgens worden toegepast op de frames van de film en dus volgen de beweging van de enkel molecuul 4-8. Foto-beschermende reagentia moeten worden gezorgd dat het monster geen photodegrade. Bovendien kan het fluorescerende voorwerp zelf van elke grootte, kleiner of groter dan de diffractie limietsystemen bijvoorbeeld kan bestaan uit een organel (~ 1 pm) met veel fluorescerende eiwitten verspreid over de membraan. Met behulp van FIONA kan nog steeds leveren een zeer nauwkeurig (nanometer) gemiddelde van de gemiddelde midden-van-massa. De grote verbetering in lokalisatie precisie door Fiona laat oplossen nanometer-schaal bewegingen in de tijd. Dit heeft microscopie geduwd in de moleculaire lengte schaal 4-8.
Sinds de uitvinding, zijn varianten van FIONA ontwikkeld. Bijvoorbeeld, bright-field imaging met een-nanometer nauwkeurigheid (bFIONA) 9, een lichte variant van FIONA, afbeeldingen en lokaliseert dichte objecten zoals melanosomen in vivo (donkere voorwerpen die het pigment melanine) met doorvallend licht. Daarnaast is FIONA toegepast om meerdere kleurstoffen lossen. Bijvoorbeeld, single-molecule hoge resolutie beeldvorming met fotobleken (garnalen) 10,11 of single-molecule hoge resolutie colocalization (SHREC) 12 ontwikkeld twee kleurstoffen opgelost binnen ongeveer 10 nm. (Merk op dat dit besluit, dat wil zeggen hoe nauwkeurig een identieke kleurstoffen uit elkaar kunnen houden.) Meer recent heeft FIONA analyse bijgedragen aan de lokalisatie proces van bepaalde super-resolutie microscopie zoals stochastische optische reconstruction microscopie (STORM) 13-15 en foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) 16, waarin tijdelijke donkere fluoroforen zijn enthousiast, en vervolgens de fluorescentie is gelokaliseerd. Door herhaaldelijk opwindende relatief lage dichtheid van kleurstoffen (minder dan een per diffractie beperkte spot), en vervolgens het verzamelen van de fluorescentie, onderzoekt al hun door FIONA, kan men opbouwen van een hoge resolutie map. De resolutie wordt dan alleen beperkt door het aantal fotonen per kleurstof steekt, evenals zaken als het bijhouden van de steekproef stationaire (waaronder bijvoorbeeld de microscoop podium) tijdens de overname.
In dit artikel een samenvatting van de FIONA techniek en een korte beschrijving van voorbeelden van onderzoek dat is uitgevoerd met behulp van FIONA wordt gemeld. Ten eerste, hoe het opzetten van de benodigde apparatuur voor FIONA experimenten, dat wil zeggen, een totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), met informatie over het uitlijnen van de optica, wordt beschreven. Maar ook hoe uhet uitvoeren van een eenvoudige FIONA experiment op het lokaliseren van geïmmobiliseerd Cy3- DNA enkele moleculen met behulp van de juiste protocollen, wordt geïllustreerd. Daarna gebruik van FIONA de 36 nm stapgrootte van een afgeknotte myosine Va motor voorzien van een quantum dot meten gepresenteerd. Myosine Va is een essentieel processief motor eiwit dat cellulaire lading vervoert terwijl translocerende langs actine filamenten. Hier een myosine Va construct afgeknot wordt gebruikt domeinen irrelevant voor de stapgrootte te verwijderen, en met een FLAG tag toegevoegd aan het C-uiteinde tot eenvoudige labeling met quantum dots gefunctionaliseerd met anti-FLAG-antilichamen mogelijk. Dit experiment gebeurt onder lage ATP te vertragen myosine en maken het gebruik van lange belichtingstijden genoeg om een goede foton telling te krijgen in elk frame. Elke voldoende fel fluorescerend label kan worden vervangen in het volgende protocol. Ten slotte is de laatste poging van de uitbreiding van de toepassing van FIONA dikke monsters gemeld. Als principe proof-of-werden quantum dots geweektin sol-gel en konijn ogen hoornvliezen en vervolgens gescand en gelokaliseerd met behulp van FIONA. Voor beeldvorming, een 60X water immersie objectief met NA = 1.2 werd gebruikt, omdat deze doelstelling heeft een langere afstand dan voorheen 100x olie-immersie objectief. Om het verlies in de vergroting te compenseren in de doelstelling, een extra vergroting lens (3,3 maal of 4.0X) werd ingebracht in de emissie-pad. Bovendien epi-fluorescentie (niet TIR) microscopie moet worden gebruikt om diepe gebieden in de dikke monsters. Er wordt aangetoond dat quantum dots gedrenkt diep in sol-gels en in konijnenogen cornea (Z> 200 um) kan worden gelokaliseerd met 2-3 nm nauwkeurig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Het hoornvlies weefsel van konijnen werd verzameld in overeenstemming met de Universiteit van Illinois Institutional Animal Care en gebruik richtlijnen.
1 TIRFM Setup
OPMERKING: Draag laser-veiligheidsbril hele tijd.
- Zorg ervoor dat alle noodzakelijke in de lijst van materialen vermeld optische componenten zijn beschikbaar en klaar voor uitlijning. Indien nodig, gebruik maken van vervangers met vergelijkbare functies bij andere bedrijven. Zorg ervoor dat Spiegels en lenzen anti-reflecterende (AR) coating die overeenkomen met de laser in gebruik moeten hebben.
- Stel de hoogte van alle optische componenten op de hoogte van de as van de microscoop achterhaven.
- Monteer de laser, laser-shutter en ND-filter (s). Gebruik ND filters om het laservermogen dempen vaststelling zo laag mogelijk terwijl de bundel zichtbaar. Haal de bouten met de juiste inbussleutels.
- Plan een balk weg en markeer deze met tape of markering op de optische tafel (dotted blauwe lijnen in figuur 1). Eenvoudigheidshalve rechtdoor paden langs lijnen van gaten op de optische tafel.
- Plaats spiegel M1 (figuur 1) en het eerste rechte hoek bocht. Plaats de twee irissen langs de tweede rechte gedeelte van de geplande stralengang. Stel zowel de positie en de kanteling van M1 zodanig dat de laser gaat door de irissen.
- Plaats mirror M2 (figuur 1) en het tweede rechte hoek bocht. Plaats de 10X bundelexpander (L1 en L2, figuur 1) langs de derde rechte deel van het pad. Stel het kantelen zodat de bundelexpander parallel aan zowel de optische tafel en geplande stralengang.
- Pas M1 en M2 iteratief zodat de laser gaat regelrecht door de middelpunten van beide lenzen van de bundelverbreder. Herhaal deze stap tot de straal profiel van de uitgebreide bundel is niet geknipt Gauss.
- Pas M1 om de bundel op L1 te centreren (Fifiguur 1) en M2 de straal op L2 (Figuur 1) iteratief centreren. Een slechte liggerprofiel betekent meestal dat de laser wordt geknipt; gebruik maken van een stuk wit papier om de bundel te blokkeren nadat de bundel expander om de bundel profiel controleren met de ogen. Voor hoge precisie analyse, gebruik maken van een optische bundel profiler.
- Pas de afstand tussen L1 en L2, zodat de bundel gecollimeerd. Herhaal stap 1.8 en 1.9 indien nodig.
OPMERKING: Wanneer de bundel grootte verandert niet met de afstand, de straal gecollimeerd genoeg voor een TIRFM setup. Ter verbetering van de balk collimatie, kunnen instrumenten zoals een afschuifinterferometer gebruikt. Een typische bundelbreedte na expansie ~ 20 mm. - Shutter de laser. Schroef de microscoop objectief en schroef in een tl-uitlijning doel. Place spiegels M3 en M4 (figuur 1) de geëxpandeerde bundel direct in de microscoop haven en op de dichroïsche spiegel in de toren. Zorg ervoor dat de laserstraal weerkaatst thij Dichroic en naar het plafond.
- Stel M3 het helderste gedeelte van de bundel centreren op de fluorescerende doel en M4 de bundelkanteling passen verticaal worden.
- Shutter de laser en schroef het doel weer in. Als de aanpassing in de vorige stap is het goed gedaan moet er een symmetrische plek het doel verlaten zijn. Fine-tunen van de kantelingen van de M3 en M4 naar het laservermogen en balk profiel optimaliseren van de doelstelling.
- Monteer een EMCCD camera aan de microscoop en sluit de camera aan op een computer. Start de software voor de camera.
- Monteer een fluorescerende steekproef (oplossing van fluoroforen) op de microscoop. Kijk naar het felle fluorescerende vlek op de camera. Controleer dat de spot niet verschuift op het scherm als de focus is veranderd.
- Plaats de TIR lens (L3, figuur 1) op het XYZ translatietrap op afstand van de achterkant brandvlak van het doel gelijk aan de brandpuntsafstand van L3 (~ 30 cm) is. Pas de positie van L3zodat de laser gaat door het midden van de lens.
- Vertaling L3 langs de stralengang aan de balk collimatie passen. Zorg ervoor dat de bundel nog steeds is gericht op de monitor en symmetrisch van vorm.
OPMERKING: De verlichting gebied aan de steekproef vliegtuig toeneemt bij afnemende TIR brandpuntsafstand van het objectief. In het algemeen gebruik maken van de kleinste brandpuntsafstand die zou kunnen passen aan de set-up. - Vertaling L3 loodrecht op de bundel pad naar de bundelkanteling uit het doel. Houd het vertalen van de TIR lens zodanig dat TIR wordt bereikt. Observeer een steekproef van fluorescerende kraaltjes door de EMCCD camera, en fine-tunen van L3 naar goede SNR krijgen.
Figuur 1 optische configuratie voor totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM).
2 FIONA on Cy3-DNA
- Clean objectglaasjes en dekglaasjes: spoel objectglaasjes en dekglaasjes met DDH 2 O en isopropanol en droog ze af met stikstofgas; plaats de dia's en dekglaasjes in het plasma reiniger voor 5 min onder argon plasma.
- Construct monsterkamers (zoals geschetst in figuur 2).
- Leg een tissue op de bank en zet dan een stuk van de lens papier bovenop het weefsel. Plaats de dia op de lens papier. Zorg ervoor dat de schone kant van de glijbaan is naar boven.
- Breng twee stroken dubbelzijdig tape op de slede langs de lange randen, waardoor een spleet van 3-5 mm in het midden. Plaats de gereinigde dekglaasje bovenop de dia. Zorg ervoor dat de schone kant van het dekglaasje wordt geconfronteerd met de glijbaan.
- Gebruik een pipet tip om druk naar beneden over de dubbelzijdige tape. Gebruik een scheermesje om het overtollige tape van de dia te verwijderen, zodat de tape blijft alleen onder het dekglaasje.
OPMERKING: De open einden van de kamer worden opengelaten en dienen als inlaat en uitlaten. Het volume van de kamer is enkele microliter.
Figuur 2 Schets van een typisch monster kamer (a) Bovenaanzicht.; (B) Zij aanzicht van rechts; (C) Zij aanzicht vanaf de voorkant.
- Immobiliseer Cy3-DNA op binnenoppervlakken van de monsterkamers.
- Bereid T-50 buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Bereid BSA-biotine in T-50 met een eindconcentratie van 1 mg / ml. Bereid T50-BSA buffer door oplossen BSA in T-50 met een eindconcentratie van 10 mg / ml.
- Bereid 0,5 mg / ml neutravidine in T50-BSA buffer. Bereid gebiotinyleerd Cy3 gemerkte DNA (Cy3-DNA) in T50-BSA bij een uiteindelijke concentratie van 5-10 pM.
- Pipetteer 10 ul BSA-biotine (1 mg / ml) in de monsterkamer. Wacht 5 minuten.
- Was de kamer met 40 pi T50-BSA. Pipet 20 ul Cy3-DNA in het monster kamer. Incubeer gedurende 5 minuten en spoel daarna de kamer met 80 ul T50-BSA.
- Afbeelding Cy3- DNA enkelvoudige moleculen onder TIRFM.
- Bereid imaging buffer (100 pl) door mengen van 1 pl protocatechuaat 3,4-dioxygenase (PCD, 5 uM), 4 ui protocatechuidezuur zuur (PCA, 62,5 mM), 50 pl 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carbonzuur (Trolox, 2 mM in T-50) en 45 gl T50-BSA.
- Pipet in 30 ul beeldvorming buffer en wacht 8-10 minuten.
- Monteer de steekproef voor de beeldvorming op een TIRFM dat is uitgerust met een groene laser (532 nm), een 100x olie-immersie objectief (1.45 NA), en een EMCCD camera.
- Stel de belichtingstijd om 100 tot 500 msec en EM winst tot 25 tot 100 Acquire een filmpje van het monster voor 1,000 frames.
- Voeren FIONA data-analyse op de opgenomen beelden van Cy3-DNA.
- De effectieve pixelgrootte (dwz conversiefactor van pixels tot nanometer) door deling van het fysieke pixelgrootte (gelezen specificatie vel van de EMCCD camera) van de totale vergroting (de vergroting van het microscoopobjectief vermenigvuldigd met extra vergroting).
- Bepaal de omrekenfactor van pixel intensiteiten nummers foton door CCD-gevoeligheid (dwz elektronen per A / D tellen, lezen uit de technische fiche van de CCD-camera) van het elektron multiplier (EM) winst gebruikt tijdens beeldopname te delen.
- Compileren en uitvoeren FIONA.pro voor FIONA analyse. Gebruik dit IDL programma om de verworven beeld te importeren, het invoeren van de effectieve pixelgrootte (uit stap 2.5.1) en de omrekenfactor van intensiteit naar foton nummer (van stap 2.5.2), en plekken voor FIONA analyse kiezen.
OPMERKING: Op het einde, het program zal de output van de fitting resultaten met 2D Gaussische functies, evenals de totale foton nummers en lokalisatie precisie. Een typisch resultaat is weergegeven in de sectie van de vertegenwoordiger van de resultaten en de figuren 4c-4d. - Compileren en uitvoeren phcount.pro om foton tellen karakteriseren. Gebruik dit IDL programma om het gemiddelde aantal fotonen uitgezonden door een fluorofoor voor fotobleken meten de verkregen afbeelding en het invoeren van de omzettingsfactor importeren intensiteit foton nummer (uit stap 2.5.2).
Opmerking: Het programma wordt automatisch gevonden fluorescerende spots automatisch (handmatige selectie is een optie) berekenen fotontellingen als functie van framenummer, en output de sporen van fotontellingen.- Gooi slechte sporen en geef kader ranges na photobleaching voor baseline correctie. Op het einde, zal het programma een lijst produceren van in totaal foton nummers voor alle plekken niet weggegooid. Plot dan de verdeling van de foton-nummers en passen de distributietie met een exponentiële verval naar de gemiddelde foton nummer te verkrijgen. Een typisch resultaat is weergegeven in de sectie van de representatieve resultaten en cijfers 4e-4f.
3 FIONA Toegepast op Motor (bijvoorbeeld Myosin op actine) Dynamics Kwantificeren op nanometerschaal
- Polymeriseren actine (dwz bereiden F-actine) een dag voor FIONA experiment.
- Reconstitueren G-actine (monomeer) en biotine G-actine (monomeer) tot 10 mg / algemene actine ml buffer. Roer om ervoor te zorgen dat beide volledig zijn opgelost, en houdt zowel op ijs.
- Meng 10 ul G-actine (monomeer) met 1,7 ul biotine G-actine in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 100 ul ijskoude actine polymerisatie buffer.
- Laat het mengsel overnacht bij 4 ° C (F-actine gevormd) en voeg DDH 2 O tot een totaal volume van 1 ml.
- Bewaar de actine filamenten (F-actine) bij 4 ° C voor later gebruik in proeven.
OPMERKING: Filamenten desintegreren en verkort de tijd, maar kan gebruikt worden voor ten minste twee weken.
- Bereid monster voor beeldvorming.
- Maak een monster kamer (zoals beschreven in het protocol 2.1 en 2.2). Pipetteer 20 ul gebiotinyleerd BSA 1 mg / ml in DDH 2 O. Incubeer gedurende 10 minuten. Spoelen met 30 ul DDH 2 O.
OPMERKING: Dit blokkeert het glasoppervlak en stelt biotine voor het binden van de actine-filamenten. Gebiotinyleerde poly-L-lysine - polyethyleenglycol (PLL-PEG) kan dezelfde functie hebben. - Pipet in 0,5 mg / ml neutravidine. Incubeer gedurende 2 minuten en spoel daarna de kamer met 30 ul M5 buffer.
- Pipetteer de gevulde F-actine 25 keer verdund algemeen actine buffer tot een eindconcentratie ~ 0.004 mg / ml. Wacht 10 minuten, spoel de kamer met 30 ul buffer.
- Verdun myosine Va met FLAG-tags 30-voudig in M5 buffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) tot een eindconcentratie of 250 nM. Meng 1 ui myosine met 1 pl Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 uM, geconjugeerd van anti-FLAG antilichamen en Qdot705 behulp van de Qdot705 Antibody Vervoeging Kit volgens de handleiding van de fabrikant). Voeg in 8 ul M5 te vullen tot 10 pl. Pipet op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
Opmerking: Dit levert een mengsel van 1 motor 4 quantum dots, bij ~ 25 nM myosine concentratie.
- Maak een monster kamer (zoals beschreven in het protocol 2.1 en 2.2). Pipetteer 20 ul gebiotinyleerd BSA 1 mg / ml in DDH 2 O. Incubeer gedurende 10 minuten. Spoelen met 30 ul DDH 2 O.
- Beeldvorming van de myosine lopen op actine.
- Bereid imaging buffer (100 pl) door mengen 84 ul M5-BSA (M5 buffer met 1 mg / ml BSA), 1 ui ATP (50 pM in DDH 2 O), 2 pi DTT (500 mM in DDH 2 O), 1 CK gl (500 U / ml), 5 ui CP (200 mM), 1 ui PCD, 4 ui PCA, 1 ui myosine-Qdot na verdunning andere 10-voudig tot 2,5 nM myosine concentratie en 1 pl BME.
- Pipet in 20 ul beeldvorming buffer naar kamer proeven en incubeer gedurende 8-10 minuten.
- Beeld van het monster op TIRF microscoop bij 30 msec blootstelling. Verwerven van minstens 1.000 frames. Pas het volume van myosine-Qdot in stap 3.3.1 indien nodig.
- Voeren data-analyse en vind de stap-grootte van myosine wandelen.
- Open het videobestand in ImageJ 17 en gewas de video rond een bewegende spot. Gewas een groot genoeg gebied dat ter plaatse wordt nooit binnen 20 pixels van de rand, en zorg ervoor dat er geen andere plekken in de video. Zorg ervoor dat deze plek beweegt zich in een lineair pad.
- Volg ter plaatse door de video te genereren x en y-coördinaten door de tijd, in pixels, door het toepassen van FIONA analyse (stap 2.5.3) om elk frame van de video.
- Zet pixels naar nanometer, zoals beschreven in de vorige paragraaf.
- Bereken verplaatsing van de eerste positie als functie van de tijd.
- Run t-test de verplaatsing naar de trap van myosine lopen verkrijgen.
OPMERKING: Het programma voorzag t-test (step_t_test.zip) wordt gecodeerd in IDL en constaat uit 14 subroutines in de map.- Open alle subroutines in IDL en compileren al twee keer. Dan start mtltyanalysis_ttest.pro en kies een tekstbestand met alleen de data op afstand in een enkele kolom. Een uitgang Excel file wordt gegenereerd, die de ruwe gegevens, de pasvorm en de stapgrootte.
- Verwijder alle nul-waarden uit de kolom stapgrootte. Zet de verdeling van de stap maten met behulp van Origin of MATLAB. Monteer een Gauss om het histogram.
OPMERKING: Stap groottes van nul-waarden moeten worden verwijderd omdat een stap van nul betekent dat er geen stap uit het vorige frame. De fitting geeft een piek rond 36 nm (zie figuur 5).
4 Dikke Monstervoorbereiding voor FIONA
- Bereid quantum dots ingekapseld in sol-gel.
- Meng 4,5 ml TMOS, 1 ml DDH 2 O en 100 pl HCl (120 mM). Ultrasone trillingen het mengsel op ijs gedurende 30 minuten in het ultrasoon reiniger specified in de lijst van materialen (frequentie = 40 kHz, verwarming = uit). Meng de oplossing om de 10 minuten.
- Verdun 1,5 pi Qdot605 in 1,5 ml HEPES (50 mM pH 7,2). Meng oplossing 1,5 ml TMOS van de vorige stap.
- Giet het mengsel in een glazen onderste schaal. Dicht de glazen bodem schotel met Parafilm en bewaar bij 4 ° C voor 1 5 uur.
- Voeg 2 ml 1% BME in PBS om het monster schotel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor beeldvorming.
- Bereid hoornvlies monster gekleurd met quantum dots.
OPMERKING: Rabbit-ogen waren geschenken van Dr Marina Marjanovic.- Scheid het hoornvlies van de ogen en snijd hem in 3 mm x 3 mm stukken.
- Verdun 1 pl Qdot 605-streptavidine in 1 ml PBS. Incubeer de cornea weefsel met 1 nM Qdots oplossing bij 4 ° C gedurende 1 uur. Was het weefsel met PBS.
- Neem een schoon glasplaatje en een # 1.5 dekglaasje. Put 4 lagen dubbelzijdig tape op het glaasje langs de lange zijde eennd Met andere 4 lagen dubbelzijdig tape parallel aan de vorige band en een kanaal ongeveer 1 cm ertussen. Doe het materiaal uit de vorige stap in het midden van het kanaal, en bedek het met een dekglaasje.
- Druk zachtjes op de zijkanten van het dekglaasje om het plakken op de tapes. Bevochtig het kanaal met 50 ul PBS voor de beeldvorming.
- Afbeelding quantum dots in sol-gel en cornea.
- Voor FIONA beeldvorming in dikke monsters, gebruikt u een 60X water-immersie objectief met een werkafstand van 0,27 mm of een 60X water-immersie objectief met een werkafstand van 0,28 mm.
- Monteer het monster op de microscoop. Stel de TIRF lens zodanig dat de epi-fluorescentie stand bereikt (de laserstraal komt uit het doel met een hoek tegen de dekglaasje). Plaats een extra vergroting lens (3,3 maal of 4.0X).
- Verplaats het brandvlak van de doelstelling om een gewenste z positie (bijvoorbeeld> 200 pm). Record beelden van immobielequantum dots in het monster.
- Voeren FIONA analyse zoals beschreven in paragraaf 2.5 van dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typische doelstelling type TIRFM setup is getoond in figuur 3. Eerst werd het oppervlak geïmmobiliseerd Cy3-DNA sample afgebeeld. Een typisch beeld is weergegeven in figuur 4a. Het beeld werd genomen met een belichtingstijd van 0,5 sec, met EM gain = 50 en CCD gevoeligheid = 12.13 voor de camera. Het point-spread-functie (PSF) van een Cy3-DNA-molecuul wordt getoond in figuur 4b (van de plaats aangegeven door de pijl in figuur 4a), waarbij de kleur-toont de omvang van pixelintensiteiten. De werkelijke foton tellingen kon worden berekend door de pixel intensiteiten te vermenigvuldigen met een omrekeningsfactor, α = CCD gevoeligheid / EM gewin. Deze spot bevat ongeveer 14.000 fotonen (na correctie voor de achtergrond).
Het PSF wordt daarna voorzien van een tweedimensionale Gauss functie f (x, y) = z0 + A · exp (- (x-x μ) 2 / (2s x 2) - (y - & #181, y) 2 / (2s y2)), zoals weergegeven in figuur 4c (met fitting residuen in figuur 4d). De nauwkeurigheid van de lokalisatie wordt vervolgens berekend door 
, Waarbij i = x of y, i s de standaardafwijking van de fitting, N is het totale aantal fotonen, a de pixelgrootte en b de standaarddeviatie van de achtergrond. In dit specifieke voorbeeld, N = 14.528, a = 106,67 nm, s x = 115.5 nm, s y = 109,4 nm, b = 18,9, waardoor lokalisatie precisie van σ x = 1,3 nm en σ y = 1.2 nm. De lokalisatie precisie van een fluorofoor is ongeveer evenredig met 1 / √N, dat wil zeggen hoe meer fotonen, het nauwkeuriger te lokaliseren is. In concrete toepassingen van FIONA, duur van experimentele waarneming is een andere overweging. Daarom eenmoet in het algemeen bewust van de afruil tussen de lokalisatie precisie en observatie duur en plan vooruit. In dergelijke situaties is het meestal nuttig om te bepalen hoeveel fotonen in totaal een fluorofoor kan uitzenden voor fotobleken. Een typische curve van foton telling versus lijst is weergegeven in figuur 4e. Een exponentiële fitting geeft aan dat de gemiddelde foton aantal ~ 1,4 x 10 6 (figuur 4f).
De gegevens analyseproces van myosine stapgrootte meting wordt getoond in figuur 5. Eerst werd een videobestand met goede signaal-ruisverhouding van een myosine als het loopt langs een actine filament wordt ingenomen. Figuur 5a toont drie beelden van een video die 100 msec belichting met 100x olie-immersie objectief. De bewegende PSF wordt dan gevolgd door de bijgesneden video-bestand met behulp van een aangepaste code geschreven in IDL de afstand ten opzichte van de tijd informatie uit te halen, die wordt gebracht door middel van een T-toetsvoor de stappen. Figuur 5b toont met de afstand ten opzichte van de tijd (rood) en stap-finder-uitgang (wit). Lokalisatie fouten in elk frame verduistert de trap vorm van het spoor, dus is het essentieel om een foton telling in elk frame dat overeenkomt met een lokalisatiefout minder dan de helft van de theoretische stapgrootte men wil zien bereiken. Figuur 5c toont verschillende stappen van sporen gecombineerd in een histogram dat wordt Gauss-verdeling over de ware myosine stapgrootte. Een Gaussische fit aan de histogrambanden levert een laatste stap maat opmeten van 35,8 ± 0,4 nm.
Omdat de sol-gel en het hoornvlies monsters zijn transparant, kan excitatie lasers diep in de monsters te dringen zonder dat het te veel verspreid. Bovendien is de auto-fluorescentie van het monster geminimaliseerd. Wanneer gelabeld met lage concentratie quantum dots, is het mogelijk om de fluorescentie van Qdots verzamelen diep in het monster met een hoge signaal-ruisverhouding. Hetwatergebruik doel geeft de werkafstand van 270 of 280 urn, wat betekent dat het mogelijk is om zich zoveel 280 urn van het dekglaasje. Dit laat ons toe om FIONA analyses uit te voeren op de quantum dots in dikke monsters. Voor quantum dots in een sol-gel monster lokalisatie nauwkeurigheid van 1-2 nm bij dekglaasje en 2-3 nm bij 280 micrometer diep in het monster (Figuren 6a-6b) wordt bereikt. Voor quantum dots in een biologisch monster (deel van een hoornvlies van een konijnenogen figuur 6e), lokalisatienauwkeurigheid van 1-2 nm bij dekglaasje en 2-3 nm bij ~ 223 urn diep in het monster (Figuur 6c-6d) wordt bereikt. Opgemerkt wordt dat de lokalisatie nauwkeurigheid wordt verbeterd door de extra vergroting lens, zonder dat een nauwkeurige lokalisatie van 6-7 nm werd verkregen. Dit is consistent met eerdere numerieke studies blijkt dat de lokalisatie nauwkeurigheid kan worden verbeterd door de effectieve pixelgrootte van ~ 200nm tot ~ 50 nm, zelfs wanneer het totale aantal verzamelde fotonen lager kan zijn door extra reflecties / brekingen 18.
Figuur 3 Optische configuratie. De optische configuratie van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie een.) Is een foto wanneer de laser is in TIRF staat en b) is de lichtbundel van de laser op het plafond als laser is in epi-verlichting.
Figuur 4 Lokalisatie van geïmmobiliseerde Cy3-DNA. A) CCD (256 x 256 pixels) van Cy3-DNA. B) CCD beeld van een Cy3-DNA-molecuul, aangeduid met de yellage pijl in een). c) Montage van de punt spreiding functie van de interne Cy3- DNA-molecuul met een twee-dimensionale Gauss-functie. d) Montage restproducten van c). e) Photon tellen versus framenummer. f) Verdeling van de aantal fotonen uitgezonden door Cy3- molecuul vóór photobleaching. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Myosine lopen waargenomen door Fiona. a) Frames van bijvoorbeeld databestand overeenkomende met t = 0 sec, 30 sec en 60 sec. De myosine-Qdot constructie beweegt zich in een rechte pad en heeft een goede foton count (> 5000) in elk frame. B) Toepassing van FIONA aan elk frame yiedens een afstand versus tijddiagram is uitgezet in rood. Een-stap het vinden algoritme, gebaseerd op de T-test wordt vervolgens extraheren stappen, en de output wordt bedekt in wit. Stap maten worden gelabeld in het wit in eenheden van nanometer. C) stappen uit meerdere sporen worden gecombineerd in een histogram. De gemeten stap maten zijn Gauss-verdeling over 35,8 ± 0,4 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 FIONA analyse op quantum dots diep in dikke monsters. A) TL-beeld van QD 605 in sol-gel bij Z = 280 micrometer met 90X vergroting. B) De puntspreidingsfunctie van de QD gemarkeerd in een). σ x = 2.6 nm, σ y = 2,3 nm. Elke eenheid in de X-en Y-as vertegenwoordigt 266,7 nm. C) Fluorescent beeld van QD 655 in konijnen hoornvlies weefsel op Z = 223 urn bij 360X vergroting. D) De PSF van de QD gemarkeerd c). σ x = 2,2 nm, σ y = 3.6 nm. Elke eenheid in de X-en Y-as vertegenwoordigt 44,4 nm. E) Foto's van het hoornvlies weefsel, gemonteerd op een dekglaasje. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FIONA is een techniek om de positie van een fluorescent emitter (organische fluorofoor of quantum dot) met nanometer nauwkeurigheid en tijdsresolutie tot 1 msec 4-8 lokaliseren. Wanneer voldoende fotonen worden verzameld, deze techniek maakt het mogelijk de positie van een fluorescent emitter veel nauwkeuriger dan de diffractielimiet (~ 200 nm) te bepalen en dus deze techniek opent een manier te observeren wat niet gezien conventionele / traditionele optische microscopie 4 - 8. Sinds de uitvinding is FIONA succes toegepast op observeren lopen van vele moleculaire motoren zoals myosins en kinesins. Meer recent, het, samen met ander werk 3,19, bijgedragen aan de lokalisatie proces van bepaalde opkomende super-resolutie zoals STORM en PALM 13-16.
De kritische stap voor FIONA bereiken ligt in het aantal verzamelde fotonen, die wordt beïnvloed door verschillende facteurs. Zo moet de TIRFM opstart voor FIONA experimenten goed aansluit zodat een goede PSF (niet-uitgerekt, niet-stigma, etc.) wordt verkregen en een redelijke signaal-ruis-verhouding wordt bereikt. Bovendien moet een objectief met een hoge NA waarde worden gebruikt om zoveel fotonen te verzamelen.
Om meer fotonen te verzamelen en daarmee naar lokalisatie precisie te verhogen, hebben verschillende zuurstofbinder methoden en reagentia onderzocht te onderdrukken fotobleken en knippert 20 tot 22. Twee verschillende zuurstof wegvangen werkwijzen zijn gebruikt in ons lab. Een daarvan is "gloxy" oplossing (glucose-oxidase en katalase) 20. De andere is PCA / PCD hierboven 22 beschreven. Eerstgenoemde werkt direct na menging maar de pH van de oplossing verandert in de tijd. Deze houdt de oplossing chemisch ongewijzigd, maar een incubatietijd van 8 tot 10 minuten nodig.
Eens hier getoond, is het ook mogelijk om FIONA verlengen dikke monsters met een 60X water immersie objectief met NA = 1,2. Deze doelstelling heeft een langere werkafstand (0,27 mm) dan de eerder gebruikte 100x olie-immersie objectief (0,17 mm). Werken op dikke monsters, epi-fluorescentie microscopie moet worden gebruikt. Hoewel het voordeel van lage achtergrond van TIRFM opgeofferd, nanometer lokalisatie precisie nog haalbaar bij gebruik licht quantum dots. Deze uitbreiding zal nuttig zijn in dikke weefsel beeldvorming en medische toepassingen.
De toepassing van FIONA is beperkt in een aantal aspecten. Allereerst, als de lokalisatie precisie afhankelijk van het totale aantal verzamelde fotonen, de temporele resolutie van FIONA meestal aangetast. Tweede, FIONA alleen kan alleen worden toegepast op dun gelabelde monsters. Met andere woorden, FIONA mislukken als meerdere fluoroforen dicht genoeg is de PSF's overlappen. Bovendien, de verstrooiing van licht emissie beperkt de appassing van FIONA in dikke-weefsel-imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH Grants 068.625, NSF subsidies 1.063.188 en het centrum van de fysica van levende cellen 0822613. Speciale dank gaat uit naar Dr Marina Marjanovic in Beckman Institute for Advanced Science and Technology voor de gave van de ogen van konijnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-sided tape | 3M | ~75 µm thick | |
| EMCCD camera | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | |
| Fluorescence filter set | Chroma | 49016 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | |
| Biotin G-actin | Cytoskeleton | AB07 | |
| G-actin | Cytoskeleton | AKL95 | |
| General actin buffer | Cytoskeleton | BSA01 | |
| Laser shutter (with driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | ||
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm thick |
| Microscope slide | Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm thick |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Glass bottom dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio | |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Antibody Conjugation Kit | Invitrogen | Q22061MP | |
| MATLAB | MathWorks | ||
| Optical table | Newport Corp | RS4000 Series | |
| 60X Objective | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objective | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17 | |
| 60X Objective | Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71/IX70/IX81 | |
| Origin | OriginLab | ||
| Anti-FLAG antibody | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotin | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatine Phosphokinase from rabbit muscle |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Phosphocreatine di(tris) salt |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Protocatechuic acid |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatechuate-3,4-dioxygenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetramethyl orthosilicate |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| 1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantity: 2 |
| ½” diameter posts | Thorlabs | TR4 | Quantity ≥ 6 |
| 10X beam expander | Thorlabs | BE10M-A | |
| 2” diameter f = 300 mm lens with mount | Thorlabs | LA1256-A, LMR2 | TIR lens |
| Fluorescent alignment target | Thorlabs | VRC2SM1 | |
| Laser safety goggles | Thorlabs | LG3 | |
| ND filter(s) | Thorlabs | FW1AND | |
| Optical beam profiler | Thorlabs | BP209-VIS | |
| Post-mounted iris diaphragm | Thorlabs | ID25 | Quantity: 2 |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ translation stage, ½” travel | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
References
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope. Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued). Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).
- Thompson, R. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. Kinesin Walks Hand-Over-Hand. Science. 303 (5658), 676-678 (2004).
- Yildiz, A., et al. Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).
- Yildiz, A., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).
- Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. Why kinesin is so processive. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).
- Kural, C., et al. Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).
- Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).
- Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).
- Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).
- Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization. Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Zhuang, X., et al. A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding. Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
