Summary
단일 형광체는 피오나를 사용하여 나노 미터 정밀도로 지역화 할 수 있습니다. 여기에 FIONA 기술의 요약보고, 어떻게 FIONA 실험을 수행하는 기술이다.
Abstract
한 나노 미터 정밀도 (피오나)와 형광 이미징은 xy 평면에서 나노 미터 정밀도로 하나의 형광체 국산화에 대한 간단하지만 유용한 기술이다. 여기 피오나 기술의 요약보고되고 피오나를 사용하여 수행 한 연구의 예를 다음과 같이 간략하게 설명되어 있습니다. 먼저, 어떻게 광학 정렬을 안내해 즉 FIONA 실험, 전반사 형광 현미경 (TIRFM)에 필요한 장비를 설정하도록 설명된다. 다음 방법에 양자 도트로 표지 한 절두 미오신 버지니아 모터의 36 nm의 스텝 사이즈를 측정 FIONA 사용 하였다 적절한 프로토콜을 이용하여 고정화를 Cy3-DNA 단일 분자 국산화에 간단한 FIONA 실험을 수행하기 위해 도시되어있다. 마지막으로, 두꺼운 샘플 피오나의 응용 프로그램을 확장하기위한 최근의 노력이보고됩니다. > (이 침수 목표를 사용하여, 그 표시되고 양자점은 졸 - 겔 토끼 눈 각막에 깊이 배어200 μm의), 2 ~ 3 나노 미터의 현지화 정밀도는 달성 될 수있다.
Introduction
1882 년경 에른스트 아베는 가시광 현미경의 해상도가 있음을 발견 ~ λ / 2Na를, (λ는 파장이며, NA는 개구 수) 1.2 ~ 200 나노 미터 또는. 따라서이 치수보다 작은 물체는 광학 현미경의 회절 제한 된 점으로 나타납니다. 그러나, 훨씬 더 높은 정밀도로 3 인 스폿의 중심, 물체의 위치를 결정하는 것이 가능하다. 한 나노 미터 정밀도 (피오나)와 형광 이미징은 xy 평면 사에 나노 미터 정밀도로 하나의 형광체 국산화에 대한 간단하지만 유용한 기술이다. 위치 파악의 정밀도는, σ μ (즉, 평균의 표준 오차)는, 수집 된 광자의 전체 수에 의존 
N은 광자 개수이고, S는 형광 스폿의 표준 편차이며,는화소 촬상 검출기의 크기, b는 백그라운드 3,4의 표준 편차이다. ~ 10000 광자를 방출하는 형광의 경우, 피오나 ~ 1 nm의 정밀도 4를 얻을 수 있습니다.
FIONA 정확하게 고정 터의 위치, 또는 (충분히 빠르게 수행 할 수있는 이미지를 가정)의 이동을 결정하는데 사용될 수있다. FIONA는 동영상의 프레임에 순차적으로 적용함으로써 단일 분자 4-8의 움직임을 추적 할 수있다. 광 보호 시약은 샘플 photodegrade하지 않도록 할 필요가있다. 또한, 형광 물체 자체는 어떤 크기 일 수있다, 예를 들면 회절 LIMIT-보다 더 작거나 더 클, 그것의 막 상에 분산 많은 형광 단백질과 세포 소기관 (~ 1 μM)로 구성 될 수있다. 피오나는 여전히 평균 질량 중심의 매우 정확한 (나노 미터)의 평균을 산출 할 수 있습니다 사용. FIONA에 의해 현지화 정밀도의 큰 개선은 nanome를 해결 할 수 있습니다시간 경과 TER 스케일 움직임. 이 분자 길이 스케일 4-8로 현미경을 밀고있다.
의 발명 이후, 피오나의 변종이 개발되고있다. 예를 들어, 시야 한 나노 미터의 정확도 (bFIONA) 09 FIONA의 약간의 변형, 이미지 촬상하고 투과광과 같은 멜라노 생체 (멜라닌 색소를 함유하는 진한 개체)와 같은 고밀도 물체를 편재. 또한, 피오나는 여러 염료를 해결하기 위해 사용되어왔다. 예를 들어, 광표백 (새우)와 단일 분자 고해상도 영상 10,11 또는 단일 분자 고해상도 colocalization을 (SHREC)는 12 나노 미터에서 약 10 개의 염료를 해결하기 위해 개발되었다. (이 해상도는 것을 하나 떨어져 동일한 염료를 알 수있는 방법을 정확하게 즉, 알 수 있습니다.) 최근 피오나 분석은 특정 슈퍼 해상도 현미경의 현지화 과정에 기여하고있다 같은 확률 광 RECO로nstruction 현미경 (STORM) 13 - (15)과 임시 어두운 형광체가 흥분하고 형광 지역화 된 광 활성화 지역화 현미경 (PALM) 16. 반복적 흥미로운 상당히 낮은 염료의 밀도 (이하 당 회절 제한 스폿) 다음 FIONA 의해 각각 분석, 형광을 수집하여 하나의 고해상도 맵을 구축 할 수있다. 해상도는 다음 단지 각 염료 끈다 광자의 수뿐만 아니라, 취득시 (예를 포함하여, 현미경 스테이지) 샘플 고정 유지 같은 것들에 의해 제한된다.
본 논문에서는 피오나 기술의 요약 간단히 피오나가보고하여 수행 한 연구의 예를 설명합니다. 먼저, 어떻게 광학 정렬을 안내해 즉 FIONA 실험, 전반사 형광 현미경 (TIRFM)에 필요한 장비를 설정하도록 설명된다. 그런 방법적절한 프로토콜을 이용하여 고정화를 Cy3-DNA 단일 분자에 지역화 FIONA 간단한 실험을 수행, 도시된다. 그 후, FIONA의 사용은 양자 도트로 표지 한 절두 미오신 버지니아 모터의 36 nm의 스텝 크기를 측정하는 것이 제시된다. 마이 오신 버지니아는 액틴 필라멘트를 따라 전좌 동안 휴대화물을 운반 필수가 진행되는 모터 단백질이다. 여기서 버지니아 절두 구성 미오신은 스텝 사이즈에 무관 도메인을 제거하기 위해 사용되며, FLAG 태그가 C-말단에 첨가하여 항-FLAG 항체로 기능화 된 양자점과 라벨의 용이성을 허용하도록. 이 실험은 미오신을 느리게하고 프레임마다 좋은 광자 카운트를 얻기 위해 충분히 긴 노출 시간의 사용을 허용하는 낮은 ATP 하에서 수행된다. 모든 충분히 밝은 형광 라벨은 다음 프로토콜에 대입 할 수있다. 마지막으로, 두꺼운 샘플 FIONA의 애플리케이션을 확장하는 최근의 노력이보고된다. 원리 증명으로, 양자점은 침지졸 - 겔 토끼 눈의 각막에서 다음 몇 군데와 피오나를 사용하여 지역화. 영상의 경우, NA와 60X 침수 목적은이 목적은 이전에 사용 100X 오일 침지 목표보다 더 긴 작동 거리를 가지고 있기 때문에 1.2이 사용되었다 =. 객관적인 배율 손실을 보상하기 위해, 여분의 렌즈 배율 (3.3 배 또는 4.0X)는 배출 경로에 삽입 하였다. 또한, 에피 형광 (되지 TIR) 현미경 두꺼운 샘플에서 깊은 영역을 액세스하는 데 사용되어야한다. 그것은 졸 - 겔에 2-3 nm의 정밀도로 지역화 할 수 있습니다 토끼 눈의 각막 (Z> 200 μm의)에 깊이 배어 양자 도트를받습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
윤리 선언문 : 토끼의 각막 조직이 일리노이 기관 동물 관리 및 사용 지침의 대학에 따라 수집 하였다.
1 TIRFM 설정
주 : 레이저 안전 고글 모든 시간을 착용 할 것.
- 재료의 목록에 나열된 모든 필요한 광학 부품을 사용할 수 및 정렬에 대한 준비가되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 다른 회사에서 동일한 기능을 가진 대체를 사용합니다. 거울과 렌즈를 사용하고있는 레이저와 일치하는 반사 방지 (AR) 코팅이 있어야합니다 있는지 확인하십시오.
- 현미경 후면 포트의 중심의 높이를 모든 광학 요소의 높이를 설정한다.
- 레이저, 레이저 셔터와 ND 필터 (들)를 탑재. 가시 광선을 유지하면서 가능한 한 낮은 레이저 파워를 감쇠시키는 ND 필터를 사용한다. 적절한 진수 키 나사를 조입니다.
- 빔 경로를 계획하고 광학 테이블에 테이프 또는 마커 (점으로 표시그림 1의 테드 파란색 선). 단순화를 위해, 광학 테이블에 구멍의 라인을 따라 직선 경로를 유지합니다.
- 장소 거울 M1 첫번째 직각 턴에서 (그림 1). 계획 빔 경로의 두 번째 직선 섹션에있는 두 개의 홍채를 놓습니다. 위치 및 레이저 홍채 통과되도록 M1의 틸트를 모두 조정.
- 장소 거울 M2 초 직각 턴에서 (그림 1). 경로의 제 직선 섹션을 따라 10X 빔 익스팬더 (L1 및 L2,도 1)를 놓는다. 빔 확장기는 광학 테이블 및 계획된 빔 경로 모두에 평행 기울기는 조정.
- 레이저 빔 확장기의 두 렌즈의 중심을 똑바로가는 것을 M1 및 M2가 반복적으로 같은 조정합니다. 확장 된 빔의 빔 프로파일은 가우스 비립니다 때까지이 단계를 반복합니다.
- (L1에 빔을 가운데 인터넷을 M1을 조정gure 1) 및 M2 반복적으로 L2에 빔 (그림 1) 중앙에. 나쁜 빔 프로파일은 일반적으로 레이저 클립핑 수단; 눈으로 빔 프로파일을 확인하기 위해 빔 익스팬더 후에 광을 차단하는 흰 종이를 사용한다. 고정밀도의 분석을 위해, 광 빔의 프로파일을 사용한다.
- 빔 시준되도록 L1과 L2 사이의 거리를 조정한다. 단계를 반복하여 1.8 및 1.9 필요한 경우.
NOTE : 빔 크기가 거리에 따라 변화하지 않을 때, 빔 TIRFM 설정 충분히 평행하다. 상기 빔 시준을 향상시키기 위해, 이러한 밀림 간섭계 등의 도구를 사용할 수있다. 팽창 후의 전형적인 빔 크기는 ~ 20mm이다. - 레이저 셔터. 현미경 목표를 풀고 형광 정렬 대상에 조입니다. 찾는 M3 및 M4 (도 1) 현미경 포트 및 상기 터릿의 내부에 다이크로 익 미러 확장 된 빔을 지향하는 거울. 레이저 빔이 t을 바운스되는 것을 확인그는 이색과 천장을 향해.
- 형광 대상에 빔의 밝은 부분을 가운데 M3를 조정하고, M4는 빔의 경사를 수직 수 조정.
- 레이저 셔터가 다시 목표를 조입니다. 이전 단계에서 정렬이 완료되면 잘 목적을 종료 대칭 지점이 있어야합니다. 미세 조정 M3와 M4의 경사는 목적에서 레이저 파워 빔 프로파일을 최적화 할 수 있습니다.
- 현미경에 EMCCD 카메라를 탑재하고 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 카메라의 소프트웨어를 시작합니다.
- 현미경에 형광 샘플 (형광 용액)을 탑재합니다. 카메라에 밝은 형광 자리 봐. 포커스가 변경되는 바와 같이 스폿이 화면에 이동하지 않는 것을 확인한다.
- L3의 초점 길이 (~ 30cm)와 동일한 목적의 초점면으로부터 거리 XYZ 변환 스테이지 TIR 렌즈 (L3,도 1)를 놓는다. L3의 위치를 조정이러한 레이저는 렌즈의 중심을 통과하는 것이.
- 빔 시준을 조정하기 위해 빔 경로를 따라 L3 번역. 빔은 여전히 모니터를 중심으로 모양의 대칭되어 있는지 확인합니다.
NOTE : TIR 렌즈의 초점 거리가 감소 샘플 평면 증가에 조명 영역. 일반적으로, 셋업에 들어갈 수있는 최소의 초점 길이를 사용한다. - 목적에서 빔을 기울 빔 경로에 수직 L3 번역. TIR이 달성되도록 TIR 렌즈를 번역하는 것. 좋은 SNR을 얻기 위해 EMCCD 카메라 및 미세 조정 (L3)을 통해 형광 구슬의 샘플을 관찰한다.
전반사 형광 현미경 (TIRFM) 대 1 광학 구성도.
를 Cy3-DNA에 2 FIONA
- C린 현미경 슬라이드와 커버 슬립 : DDH 2 O 및 이소프로판올 현미경 슬라이드와 커버 슬립을 씻어 질소 가스로 건조; 아르곤 플라즈마에서 5 분 동안 플라즈마 청소기의 슬라이드와 커버 슬립을 배치합니다.
- (그림 2에서 스케치로) 샘플 챔버를 구축합니다.
- 벤치에 조직을 배치 한 다음 조직 위에 렌즈 종이 조각을 넣어. 렌즈 용지에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드의 깨끗한면이 위쪽으로되어 있는지 확인합니다.
- 중앙 3-5 mm의 간격을두고 긴 가장자리를 따라 슬라이드에 양면 테이프의 두 스트립을 적용합니다. 슬라이드의 상단에있는 청소 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립의 깨끗한면이 슬라이드에 직면하고 있는지 확인합니다.
- 양면 테이프를 통해 아래로 눌러 피펫 팁을 사용합니다. 테이프 만 커버 슬립하에 유지되도록 슬라이드 과도한 테이프를 제거하는 면도기를 사용한다.
참고 : 챔버의 개방 끝이 열려하고 입구와 끝낼 아르할 수 있습니다. 챔버 체적은 몇 마이크로 리터이다.
전형적인 샘플 챔버의 그림 2 스케치 () 상위 뷰입니다.; (b)는 오른쪽 측면보기; 전면에서 (C) 측면보기.
- 샘플 챔버의 내면 인 Cy3-DNA를 고정화.
- T-50 버퍼 (10 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 50 mM의 염화나트륨)을 준비합니다. 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 T-50에 BSA-비오틴을 준비한다. 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 T-50에 BSA를 용해한 T50-BSA 버퍼를 준비한다.
- 0.5 밀리그램 / T50-BSA 버퍼의 ML 비딘를 준비합니다. 5-10 (PM)의 최종 농도를 Cy3 바이오틴 표지 DNA T50-BSA에서 (Cy3가-DNA)를 준비한다.
- 샘플 챔버 내로 10 μL 피펫의 BSA-비오틴 (1 ㎎ / ㎖). 5 분 동안 기다립니다.
- 40 μL의 T50-BSA와 챔버를 씻으십시오. 샘플 챔버 피펫 20 μL를 Cy3-DNA. 5 분 동안 부화 후 80 μL의 T50-BSA와 챔버를 씻으십시오.
- 이미지를 Cy3-DNA TIRFM에서 단일 분자.
- 50 μL 6 히드 록시 2,5,7,8-, 1 μL Protocatechuate 3,4 - 디옥 시게나 제 (PCD, 5 μM), 4 ㎕의 프로토 산 (PCA, 62.5 ㎜)을 혼합하여 촬상 버퍼 (100 μL)를 준비 tetramethylchromane -2 - 카복실산 (T-50에서 트롤 록스, 2 mM)을, 45 μL T50-BSA.
- 30 μL 영상 버퍼에 피펫 8 ~ 10 분 동안 기다립니다.
- 녹색 레이저 (532 nm의)이 탑재되어 TIRFM에 영상에 대한 샘플을 탑재, 100X 오일 침지 목표 (1.45 NA) 및 EMCCD 카메라.
- 1,0위한 샘플 동영상을 취득 (100) 100-500 밀리 초 및 25 EM 이득 노광 시간을 설정00 프레임입니다.
- 를 Cy3-DNA의 녹화 된 영상에 FIONA 데이터 분석을 수행합니다.
- 유효 화소 크기를 결정한다 (즉, 나노 미터 화소로부터 변환율) 물리적 픽셀 크기 나누어 총 배율 (여분의 배율을 곱한 현미경 대물의 배율)를 기준 (EMCCD 카메라의 사양서로부터 판독).
- CCD 감도 이미지 획득 동안 사용 (즉, CCD 카메라의 사양서로부터 판독 A / D 카운트 당 전자) 전자 증 그래피 (EM) 이득을 나눈 숫자 포톤 픽셀 강도로부터 변환 계수를 결정한다.
- 컴파일하고 FIONA 분석 FIONA.pro을 실행합니다. 입력 (단계 2.5.1에서) 유효 픽셀 크기 (스텝 2.5.2부터) 광자의 수와 강도에서 변환 계수로, 획득 한 이미지를 가져 오려면이 IDL 프로그램을 사용하고, 피오나 분석을위한 장소를 선택합니다.
NOTE : 끝에서, 프로그래밍m가 출력 차원 가우스 함수뿐만 아니라 전체 광자 수와 지역화 정밀도 피팅 결과. 전형적인 결과는 대표적인 결과 및 통계 4C-4D의 섹션에 표시됩니다. - 컴파일 및 광자 수를 특성화하기 위해 phcount.pro 실행합니다. (단계 2.5.2에서) 광자 수와 강도로부터 취득 된 화상과 입력 변환율을 반입하기 전에 photobleaching에 형광 물질에 의해 방출되는 광자의 평균 수를 측정 IDL이 프로그램을 사용한다.
참고 :이 프로그램은 다음 (수동 선택 옵션입니다) 자동 형광 반점을 감지 프레임 번호의 기능, 출력으로 광자 계수의 흔적을 광자의 수를 계산합니다.- 나쁜 흔적을 버리고 기본 보정 photobleaching에 후 프레임 범위를 지정합니다. 마지막에, 프로그램은 출력 모든 반점의 전체 광자 수의 목록은 삭제하지 않습니다. 그런 광자 수의 분포를 플롯하고 distribu의 맞추기지수 함수 감쇠는 가진 기의 평균 광자 수를 얻었다. 전형적인 결과는 대표적인 결과의 절에 표시된와 4E-4F 피규어된다.
3 FIONA 응용은 나노 미터 스케일에서 모터 (예 : 액틴에 마이 오신) 스피커를 정량화하기
- 굴지 중합 FIONA 실험 전에 일일 (즉, F-액틴을 준비).
- 일반 굴지 버퍼 ML 10 밀리그램 /에 G-액틴 (모노머)과 비오틴 G-액틴 (단량체)를 복원합니다. 모두가 완전히 용해되어 있는지 확인하고, 얼음을 모두 유지하는 약동하십시오.
- 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 1.7 μL 비오틴 G-액틴 10 ㎕의 G-액틴 (단량체)를 섞는다. 100 ㎕의 차가운 얼음 액틴의 중합 버퍼를 추가합니다.
- 4 ℃에서 혼합물을 밤새 남기기 (F-액틴 형성)하고 1 ML의 총 부피에 DDH 2 O 추가합니다.
- 실험에서 나중에 사용하기 위해 4 ° C에서 액틴 필라멘트 (F-액틴)를 저장합니다.
참고: 필라멘트 붕해 시간 이상 단축되지만, 적어도 2 주 동안 사용할 수있는 것이다.
- 영상에 대한 샘플을 준비합니다.
- (프로토콜 2.1 및 2.2에 설명 된대로) 샘플 챔버를 확인합니다. DDH 2 O.에서 1 ㎎ / ㎖에서 BSA를 비오틴 20 μL에 피펫 10 분 동안 품어. 30 μL DDH 2 O. 린스
참고 :이 블록 유리 표면과 액틴 필라멘트의 결합에 비오틴을 낳는다. 비오틴 화 폴리-L-라이신 - 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-PLL)는 동일한 기능을 수행 할 수있다. - 0.5 ㎎ / ㎖ 비딘에서 피펫. 2 분 동안 부화 후 30 μL M5 버퍼와 챔버를 씻으십시오.
- 제조 된 F-액틴의 피펫 최종 농도 ~ 0.004 ㎎ / ㎖로, 일반 액틴 버퍼에 25 배 희석. 10 분을 기다려 30 μL 버퍼 챔버를 씻어.
- 최종 농도 오에 M5 버퍼 (20 mM의 HEPES (산도 7.6), 2 mM의 MgCl2를, 25 밀리미터의 KCl, 1 mM의 EGTA)에서 FLAG 태그로 30 배 버지니아 미오신 희석F 250 nm의. (제조업체의 사용 설명서에 따라 Qdot705 항체 활용 키트를 사용하여 안티-FLAG 항체 및 Qdot705에서 접합 ~ 1 μM) 1 μL 안티-FLAG-Qdot705으로 1 μL 마이 오신을 섞는다. 10 μL를 채우기 위해 8 ㎕의 M5에 추가합니다. 최대 피펫 아래로 잘 혼합 할 수 있습니다. 얼음에 10 분 동안 품어.
NOTE :이 ~ 25 nM의 미오신 농도에서 1 모터 (4)에 양자점의 혼합물을 산출한다.
- (프로토콜 2.1 및 2.2에 설명 된대로) 샘플 챔버를 확인합니다. DDH 2 O.에서 1 ㎎ / ㎖에서 BSA를 비오틴 20 μL에 피펫 10 분 동안 품어. 30 μL DDH 2 O. 린스
- 액틴에 산책 미오신의 이미지.
- 혼합하여 영상 버퍼 (100 μL)를 준비 84 μL M5-BSA (1 MG와 M5 버퍼 / ㎖ BSA), 1 μL의 ATP (DDH 2 O에서 50 μM), 2 ㎕의 DTT (500 mM의 DDH 2 O)에, 1 μL CK (500 U / ㎖), 5 μL의 CP (200 밀리미터), 1 μL의 PCD, 4 μL PCA, 1 ㎕의 마이 오신 - qdot 후 2.5 nM의 미오신 농도, 1 ㎕의 BME에 또 다른 10 배 희석.
- 20 μL 영상 버퍼에 피펫 챔버를 샘플링하고 8-10 분 동안 배양한다.
- 이미지 T에서 샘플30 밀리 초 노출에서 IRF 현미경. 적어도 1000 프레임을 획득. 필요한 경우 단계 3.3.1에서 마이 오신 - qdot의 볼륨을 조절합니다.
- 데이터 분석을 수행하고 마이 오신 산책의 스텝 크기를 찾을 수 있습니다.
- ImageJ에 17에서 비디오 파일을 열고 이동하는 장소의 주위에 비디오를 자릅니다. 그 자리는 결코 가장자리의 20 픽셀 내에서 얻을 수없는 충분한 영역을 자르기, 비디오의 다른 관광 명소가 없는지 확인합니다. 이 지점은 직선 경로에 이동되어 있는지 확인합니다.
- X를 생성하기 위해 비디오를 통해 스폿을 추적 및 y는 각각 비디오의 모든 프레임에 FIONA 분석 (단계 2.5.3)를 적용하여 픽셀 단위의 시간을 조정한다.
- 이전 섹션에서 설명한 바와 같이, 나노 미터 픽셀을 변환합니다.
- 시간의 함수로 초기 위치에서 변위를 계산합니다.
- 마이 오신 산책의 단계를 얻기 위해 변위에 t-테스트를 실행합니다.
참고 : t-테스트 (step_t_test.zip)에 제공된 프로그램은 IDL 양론에 코딩폴더 14의 서브 루틴 구성 되는 파일 확장자.- IDL에서 서브 루틴을 모두 열고 두 번 모두 컴파일합니다. 그런 mtltyanalysis_ttest.pro 실행 단일 열에 만 거리 데이터를 포함한 텍스트 파일을 선택한다. 출력 엑셀 파일은 원시 데이터, 착용감 및 스텝 사이즈를 포함하는, 생성된다.
- 스텝 크기 열에서 0 인 모든 값을 삭제합니다. 기원 또는 MATLAB을 사용 스텝 크기의 분포를 플롯. 히스토그램에 가우스를 장착한다.
참고 : 0의 단계가 더 단계는 이전 프레임에서 수행되지 않습니다 것을 의미하기 때문에 제로 값의 스텝 크기는 삭제해야합니다. (도 5에 도시 된 바와 같이) 피팅은 36 nm의 피크 주위를 준다.
피오나에 대한 4 두꺼운 샘플 준비
- 졸 - 겔 (sol-gel)에 캡슐화 양자점을 준비합니다.
- 믹스 4.5 ml의 TMOS, 1 ML의 DDH 2 O와 100 ㎕의 염산 (120 mm)입니다. 초음파 청소기 SP에서 30 분 동안 얼음 위에서 초음파 처리 액재료의 목록에 ecified (주파수 = 40 kHz에서, 히터 = 끄기). 솔루션마다 10 분을 섞는다.
- 1.5 ml의 HEPES (50 mM의 pH를 7.2)에 1.5 ㎕의 Qdot605을 희석. 이전 단계에서 1.5 ml의 TMOS와 솔루션을 섞는다.
- 유리 바닥 접시에 부어 준다. 1 5 시간 동안 4 ºC에서 유리 바닥 파라 필름으로 요리와 저장소를 밀봉합니다.
- 시료 접시에 2 ml의 PBS에 1 % BME를 추가하고 촬상 전에 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 양자점으로 염색 각막 샘플을 준비합니다.
참고 : 토끼 눈 박사 마리나 Marjanovic의 선물이었다.- 눈에서 각막을 분리하고 3mm X 3mm 조각으로 잘라.
- PBS 1 ㎖에 1 ㎕의 Qdot 605-스트렙 타비 딘을 희석. 사에서 1 nM의 Qdots 용액으로 각막 조직 배양 1 시간 동안 ºC. PBS와 조직을 씻으십시오.
- 깨끗한 유리 슬라이드와 # 1.5 coverslip을 가져 가라. , 긴 변을 따라 유리 슬라이드에 양면 테이프의 4 층을 넣어차 이전 테이프에 양면 테이프 평행의 또 다른 4 층을두고 그 사이에 1cm에 대해 채널을 둡니다. 채널의 중간에 이전 단계에서 조직을 넣고, 커버 슬립으로 커버.
- 부드럽게 커버 슬립의 측면에있는 버튼을 눌러이 테이프에 충실 확인합니다. 촬영 전에 50 ㎕의 PBS와 채널을 적 십니다.
- 졸 - 겔 (sol-gel) 및 각막의 이미지 양자점.
- 두꺼운 샘플 피오나 영상의 경우, 0.27 mm 또는 0.28 mm의 작동 거리와 60X 물 침지 목적의 작동 거리와 60X 물 침지 목표를 사용합니다.
- 현미경에서 샘플을 탑재합니다. 이 에피 형광 모드에 도달되도록 TIRF 렌즈를 조정 (즉, 레이저 빔은 커버 슬립에 대해 각도 대물 나온다). 추가 배율 렌즈 (3.3 배 또는 4.0X)를 삽입합니다.
- 원하는 Z 위치 (예> 200 μm의)에 목적의 초점면을 이동합니다. 부동의 기록 이미지샘플 양자 도트를 사용합니다.
- 이 프로토콜의 2.5 절에 설명 된대로 피오나 분석을 수행합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
일반적인 목적 형 TIRFM 설정은 그림 3과 같다. 첫째, 표면 고정화를 Cy3-DNA 샘플이 몇 군데 있었다. 일반적인 이미지는도 4a에 도시된다. 이미지는 EM 이득 = 50 및 CCD 감도 = 12.13 카메라로, 노출 시간 0.5 초를 촬영했다. 하나는 Cy3-DNA 분자의 점 - 확산 함수 (PSF)은도 4b에 도시되어 칼라 바 화소 강도의 척도를 나타낸다 (도 4a에서 화살표로 표시된 지점에서). 실제적인 광자 카운트는 변환율, α = CCD 감도 / EM 이득이 화소 강도를 곱함으로써 계산 될 수있다. 이 자리는 (배경에 대한 보정 후) 약 14,000 광자가 포함되어 있습니다.
(X-X를 μ) 2 / (2S × 2) - - (Y - & # PSF이어서 이차원 가우시안 함수 F (x, y) = 0 + Z · 경험치 (붙인다181, Y) 2 / (2S Y 2)),도 4d에 도시 된 피팅 잔차)와 (도 4C에 도시 된 바와 같이. 현지화의 정밀도는 다음에 의해 계산된다 
= I의 X 또는 Y, S 나 피팅의 표준 편차이고, N은 전체 광자 수는 화소의 크기이고, B는 배경의 표준 편차이다. 이 특정 예에서, N = 14,528, A = 106.67 nm의은, X = 115.5 nm의 S, S y는 109.4 nm의 =, B = 18.9, σ의 현지화 정밀도 X = 1.3 nm이고, σ Y = 1.2 nm의 결과. 형광의 현지화 정밀, 즉 1 / √N에 대략 비례한다, 더 많은 광자가 있으며, 더 정확한 현지화입니다. 그러나, 피오나의 실제 응용 프로그램에서, 실험 관찰의 기간은 또 다른 고려 사항이다. 따라서 한일반적으로 현지화 정밀도와 관찰 기간과 미리 계획 사이의 균형을 실현해야합니다. 이러한 상황에서는, 전체에 형광체가 photobleaching에 방출하기 전에 얼마나 많은 수의 광자 결정하는 것이 유용하다. 프레임 대 광자 카운트의 전형적인 트레이스는도 4E에 도시된다. 지수 피팅이 제공하는 평균 광자 수 ~ 1.4 × 10 6 (그림 4 층).
미오신 스텝 사이즈 측정 데이터 분석 과정은도 5에 도시된다. 먼저, 좋은 신호대가 산책으로 단일 미오신의과 비디오 파일을 액틴 필라멘트 캡처 따라.도 5a는 비디오에서 세 개의 프레임을 도시 100X 오일 침지 목적으로 100 밀리 초 노출로 촬영. 이동 PSF는 다음 T-테스트를 통해 넣어 거리 대 시간 정보를 추출하는 IDL로 작성된 사용자 지정 코드를 사용하여 자른 비디오 파일을 통해 추적단계는. 시간 (빨간색) 대 거리 (b) 프로그램을 그림과 출력 (흰색) - 파인더 단계. 이 지역화 오류가 덜 한 볼하고자하는 이론적 단계 크기의 절반 이상을 해당 각 프레임에서 광자의 수를 달성하는 것이 중요하므로 각 프레임 현지화 오류 추적의 계단 모양을 가린다. 5C 여러에서 단계를 보여줍니다 트레이스는 진정한 미오신 스텝 사이즈에 대해 가우시안 분포 한 히스토그램에 결합. 히스토그램 빈들에 맞는 가우시안은 35.8 ± 0.4 ㎚의 마지막 스텝 사이즈 측정을 산출한다.
졸 - 젤, 투명한 각막 샘플이므로, 여기 레이저가 너무 많이 분산되지 않고 시료 깊숙히 침투 할 수있다. 또한, 시료로부터 자동 형광이 최소화된다. 양자점의 저농도로 표지 할 때, 깊은 잡음비 높은 신호 샘플 Qdots에서 형광을 수집 할 수있다.물 목적의 사용은 멀리 coverslip에에서까지 280으로 μm의 초점을 할 수 있음을 의미하는 우리에게 270 또는 280 μM의 작동 거리를 제공합니다. 이것은 우리가 두꺼운 샘플 양자점 피오나 분석을 수행 할 수 있습니다. 졸겔 샘플 양자점, 커버 슬립 근처 1-2 내지 시료 (도 6A-6B)에 280 μm의 깊이에서 2-3 나노 미터의 위치 파악 정확성에 대해 달성된다. 생체 시료에서 양자점 (토끼 눈에서 각막의 일부, 그림 6E), coverslip에 가까운 1-2 nm의 2-3 나노의 현지화 정도에 대해서는 샘플에 깊은 ~ 223 μm의에서 (그림 6C-6D) 달성된다. 이것은 로컬 리 제이션 정밀도 6-7 ㎚의 현지화 정밀도시켰다없이 여분 배율 렌즈를 사용함으로써 향상된다 유의한다. 이것은 지역화 정밀도 ~ (200)로부터 유효 화소의 크기를 변화시킴으로써 향상 될 수 있다는 것을 보여주는 이전 연구와 일치하는 수치이다nm의 수집 ~ 광자의 총 수 인해 추가적인 반사 / 굴절 (18)에 하부있을지라도 50 내지.
레이저 TIRF 상태에 있고, 레이저 에피 조명에있을 때 b) 천장에 레이저 빔 형상 인 경우도 3 광학 구성. 전반사 형광 (TIRF) 현미경의 광학 구성.) 사진이다.
고정화를 Cy3-DNA의 그림 4 현지화.) CCD 이미지 YEL로 표시를 Cy3-DNA. b)는 하나를 Cy3-DNA 분자의 CCD 이미지의 (256 X 256 픽셀)이차원 가우시안 함수. D) C부터 피팅 잔차). 전자)과 단일 인 Cy3-DNA 분자의 점 분포 함수 피팅). C 낮은 화살표) 광자 프레임 번호 대 카운트.의 f)에 분배 photobleaching에 전에를 Cy3 분자에 의해 방출되는 광자의 수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 마이 오신은 피오나에 의해 관찰 산책. a) = 0 초, 30 초, 60 초 톤에 대응하는 예시적인 데이터 파일로부터 프레임. 마이 오신 - qdot 구조는 매 프레임마다 좋은 광자 수 (> 5000)를 직선 경로를 따라 이사와 가지고있다. b)는 피오나의 응용 프로그램을 각 프레임 yie에신분증 빨간색으로 그려집니다 거리 대 시간 추적. T-테스트에 기초하여 스텝 - 찾는 알고리즘은 다음 각 단계를 추출하기 위해 사용되며, 출력은 백색으로 중첩된다. 단계 크기는 나노 미터. c) 다중 흔적에서 단계 히스토그램 조합 단위로 흰색으로 표시되어 있습니다. 측정 단계 크기는 가우스 분포에 대한 35.8 ± 0.4 nm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 두꺼운 샘플에 깊은 양자점에 FIONA 분석. 졸 - 겔 (sol-gel)에서 QD 605의) 형광 이미지 Z 90X 확대.의 b = 280 μm의) QD의 포인트 확산 함수에서이)으로 표시. σ X = 2.6 nm의은, σ Y는 2.3 나노 미터 =. X 및 Y 축에있는 각 단위는 QD의 PSF)는 C에 표시 360X 확대. 라)와 Z = 223 μm의에서 토끼의 각막 조직 QD 655의 266.7 nm의. C) 형광 이미지를 나타냅니다. σ X = 2.2 nm의은, σ Y는 3.6 나노 미터 =. X 및 Y 축에있는 각 유닛은 커버 슬립에 장착 된 각막 조직의 44.4 nm의. 전자) 그림을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FIONA 1 밀리 4-8까지 나노 미터 정밀도와 시간 해상도와 형광 방출 (형광 또는 유기 양자점)의 위치를 로컬 화하는 기술이다. 충분한 광자가 수집되는 경우,이 기술은 훨씬 더 정확하게 회절 한계 (~ 200 나노 미터)보다 형광 터의 위치를 결정할 수 있으며, 따라서이 기술은 기존의 / 통상의 광학 현미경 (4)와 함께 볼되지 않은 어떤 관찰하는 방법은 열리고 - 8. 의 발명 이후, 피오나는 성공적으로 myosins 및 키네신 많은 분자 모터, 도보를 관찰에 적용되고있다. 더 최근에는, 서로 다른 작업 3,19와 같은 STORM 및 PALM 13 ~ 16와 같은 특정 신흥 초해 기술 현지화 프로세스에 기여했다.
FIONA을 달성하는 중요한 단계는 다양한 F에 의해 영향을 수집 광자의 수에 달려배우. 예를 들어, FIONA 실험에 사용 TIRFM 설정 잘 좋은 PSF (즉 등되지-낙인, 연신하지 않음) 달성과 합리적인 신호 - 대 - 잡음 비가 수득되도록 정렬되어야한다. 또한, 높은 NA 값을 가진 목표는 가능한 한 많은 광자를 수집하기 위해 사용되어야한다.
현지화 정밀도를 증가하는 것이 더 많은 광자를 수집하기 위해 다른 산소 제거제 방법과 시약 photobleaching에와 20 ~ 22 깜박 억제하기 위해 탐구하고있다. 두 개의 서로 다른 산소 청소 방법은 우리의 실험실에서 사용되어왔다. 하나는 "gloxy"용액 (포도당 산화 효소와 카탈라제) 20입니다. 다른 PCA / PCD 22 상술이다. 작동 전 즉시 혼합하지만 용액의 pH를 경시 변화 후의. 후자는 화학적 용액을 그대로 유지하지만, 8 내지 10 분의 배양 시간이 필요하다.
여기에 표시된 S, 그것은 NA = 1.2 60X 침수 목표를 사용하여 두꺼운 샘플 피오나을 확장 할 수도 있습니다. 이 목적은 이전에 사용 100X 오일 침지 목적 (0.17 mm)보다 더 긴 작동 거리 (0.27 mm)가 있습니다. 두꺼운 샘플에서 작동하도록, 에피 형광 현미경을 이용해야한다. TIRFM 낮은 배경의 이점이 희생되지만 밝은 양자점을 사용하면서, 나노 미터 지역화 정밀도는 여전히 달성 가능하다. 이 확장은 두꺼운 조직 이미징 및 의료 애플리케이션에서 유용 할 것이다.
피오나의 응용 프로그램은 몇 가지 측면에서 제한된다. 현지화 정밀도가 수집 광자의 수에 따라 달라집니다로 우선, 피오나의 시간 해상도는 일반적으로 손상된다. 둘째, 단독 FIONA은 띄엄 표지 샘플에 적용될 수있다. 여러 형광 물질이 충분히 근접 할 경우 즉, 피오나가 실패 등 자신의 PSFs이 겹칩니다. 또한, 출사 광의 산란을 제한 AP두꺼운 조직 이미징 피오나의 수 직.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 068625, NSF 보조금 1,063,188 및 0822613. 특별 감사가 토끼 눈의 선물 첨단 과학 기술에 대한 베크만 연구소에서 박사 마리나 Marjanovic로 이동 살아있는 세포의 물리 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-sided tape | 3M | ~75 µm thick | |
| EMCCD camera | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | |
| Fluorescence filter set | Chroma | 49016 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | |
| Biotin G-actin | Cytoskeleton | AB07 | |
| G-actin | Cytoskeleton | AKL95 | |
| General actin buffer | Cytoskeleton | BSA01 | |
| Laser shutter (with driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | ||
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm thick |
| Microscope slide | Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm thick |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Glass bottom dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio | |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Antibody Conjugation Kit | Invitrogen | Q22061MP | |
| MATLAB | MathWorks | ||
| Optical table | Newport Corp | RS4000 Series | |
| 60X Objective | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objective | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17 | |
| 60X Objective | Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71/IX70/IX81 | |
| Origin | OriginLab | ||
| Anti-FLAG antibody | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotin | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatine Phosphokinase from rabbit muscle |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Phosphocreatine di(tris) salt |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Protocatechuic acid |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatechuate-3,4-dioxygenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetramethyl orthosilicate |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| 1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantity: 2 |
| ½” diameter posts | Thorlabs | TR4 | Quantity ≥ 6 |
| 10X beam expander | Thorlabs | BE10M-A | |
| 2” diameter f = 300 mm lens with mount | Thorlabs | LA1256-A, LMR2 | TIR lens |
| Fluorescent alignment target | Thorlabs | VRC2SM1 | |
| Laser safety goggles | Thorlabs | LG3 | |
| ND filter(s) | Thorlabs | FW1AND | |
| Optical beam profiler | Thorlabs | BP209-VIS | |
| Post-mounted iris diaphragm | Thorlabs | ID25 | Quantity: 2 |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ translation stage, ½” travel | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
References
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope. Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).
- Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued). Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).
- Thompson, R. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. Kinesin Walks Hand-Over-Hand. Science. 303 (5658), 676-678 (2004).
- Yildiz, A., et al. Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).
- Yildiz, A., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).
- Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. Why kinesin is so processive. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).
- Kural, C., et al. Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).
- Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).
- Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).
- Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).
- Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization. Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Zhuang, X., et al. A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding. Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
