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Medicine

组织鬼怪模拟,以评估乳癌手术潜在的近红外荧光成像中的应用

doi: 10.3791/51776 Published: September 19, 2014

Abstract

不准确的术中肿瘤的定位及手术切缘状态结果在保乳手术(BCS)的次优结果的评价。光学成像,特别是近红外荧光(NIRF)成像,可以通过提供的外科医生用在实时前和术中肿瘤的定位工具降低阳性手术切缘的下面BCS的频率。在目前的研究中,NIRF引导BCS的潜在利用组织模拟乳房假体的标准化和培训的原因进行了评价。

乳房假体与媲美正常乳腺组织的光学特性来模拟乳腺癌保乳手术。肿瘤模拟含有荧光染料吲哚菁绿(ICG)的夹杂物被结合在体模在预定的位置和成像前和术中肿瘤的定位,实时NIRF引导肿瘤切除术,NIRF制导评估手术的程度,以及手术切缘术后评估。定制的NIRF相机作为一种临床原型成像的目的。

含肿瘤模拟夹杂物的乳房假体提供了一个简单,价格低廉,用途广泛的工具来模拟并评估术中肿瘤成像。凝胶状幻影具有类似于人体组织的弹性属性,并且可以使用常规的外科手术器械进行切割。此外,该模体含有血红蛋白和脂肪乳用于模仿吸收的光子和散射,分别建立类似于人类乳腺组织均匀的光学特性。 NIRF成像的主要缺点是有限的穿透深度的光子穿过组织,从而阻碍深层肿瘤(非侵袭性)成像反射照明策略传播时。

Introduction

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保乳手术(BCS),其次是放射治疗是乳腺癌患者的标准治疗为T 1-T 2乳腺癌1,2。不准确的手术结果的阳性手术切缘在20至40%的谁接受BCS,因此需要附加的外科手术或放射治疗3,4,5病人的程度术评估。虽然广泛切除邻近健康乳房组织可能会降低手术切缘阳性的频率,这也将阻碍美容效果,并增加合并症6,7。因此,需要新的技术,提供了对原发肿瘤的位置和手术的程度术的反馈。光学成像,特别是近红外荧光(NIRF)成像,可以通过提供的外科医生用的r中前和术中肿瘤的定位工具减少以下BCS阳性手术切缘的频率EAL时间。最近,我们小组汇报了卵巢癌患者先在人类试验的肿瘤靶向荧光成像,显示出这项技术来检测原发肿瘤及腹腔转移癌具有较高的敏感性8的可行性。在继续到临床研究中的乳腺癌患者,但是,各种肿瘤靶向NIRF成像应用中的BCS的可行性已经可以使用临床前体模进行评价。

下面的研究方案介绍含有荧光肿瘤模拟夹杂9组织模拟乳房假体的使用NIRF成像。幽灵提供了一个廉价和灵活的工具来模拟前和术中肿瘤定位,实时NIRF引导肿瘤切除术,对手术切缘状况进行评估,并检测残留病灶。凝胶状幻影具有类似于人体组织的弹性属性,并且可以使用常规s中被切urgical仪器。在模拟的手术过程中,外科医生通过触觉信息(在可触知的夹杂物的情况下)和手术区域的视觉检查指导。此外,NIRF成像应用,以提供对手术的程度实时术中反馈的外科医生。

但是应当强调的是,NIRF成像需要使用的荧光染料。理想地,荧光染料,应使用能发出在近红外光谱范围内的光子(650 - 900纳米),以尽量减少由分子在组织生理学上丰富的吸收的光子和散射( 例如 ,血红蛋白,脂质,弹性蛋白,胶原,和水) 10,11。而且,自体荧光( 即,在由于在活细胞中的生化反应组织中的固有荧光活性)被最小化,在近红外光谱范围内,产生最佳的肿瘤-背景比11。由共轭NIRF染料肿瘤精华素泰德部分( 例如,单克隆抗体),可用于术中成像应用而获得的靶向递送的荧光染料。

由于人的眼睛是不敏感的,在近红外光谱范围内点亮,高灵敏度的摄像机装置所需的NIRF成像。已经开发了几个NIRF成像系统,术中使用迄今12。在当前的研究中,我们使用一个自定义的构建是在术中的合作与应用慕尼黑工业大学开发NIRF成像系统。该系统允许同时获取彩色图像和荧光图像。以提高荧光图像的精度,校正方案为光强变化的组织实施。详细描述通过Themelis 等人提供的。13

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Protocol

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1,创建模具硅胶用于肿瘤模拟夹杂物

  1. 收集所希望的形状和尺寸可以作为肿瘤模拟夹杂物, 珠子或弹子模型的固体物品。
  2. 彻底清洁肿瘤模型。以确保容易地移除从硅酮模具中,肿瘤模型可喷施抗粘附喷涂或覆盖有一层薄薄的凡士林或蜂蜡的。
  3. 放置在一个单独的薄壁方(塑料)中的每个模型表面光滑。如果需要的话,注视模型到盒子的底部以保持其位置。用一个框,比肿瘤模型本身,以避免浪费硅过量稍大。
  4. 倒入所需的有机硅组分A的量在搅拌碗,并在10加有机硅组分B:1的比例(重量)。彻底混合这两种成分。任选地,真空泵可用于从硅氧烷混合物中除去气泡。
  5. 轻轻婆乌尔在塑料盒中硅的混合物,防止截留气泡。聚硅氧烷混合物应在45分钟进行处理,以获得最佳结果。
  6. 让切割模具,除去肿瘤模型之前硅氧烷混合物固化为至少6小时。任选地,所述有机硅模具可切割以Z字形图案,以允许它适合背部一起干净。 3天之后,得到的聚硅氧烷的最大强度。

2创建的Tris-缓冲盐溶液

  1. 创建Tris缓冲盐水(TBS)加入6.1克(50毫摩尔)的Tris和8.8克(150毫摩尔)氯化钠800毫升去离子水的溶液。
  2. 加入将1.0g(15毫摩尔)的NaN 3的方框血红蛋白(步骤3.3和4.4)的氧化和抑制细菌生长。注意:NaN 3的是一种严重的毒。这可能是致命的皮肤或吞食接触。该化合物的毒性与可溶性碱金属氰化物和致死剂量的对于成人是约0.7g。始终遵循安全指示由制造商提供。
  3. 将pH调节到7.4,并把该卷到1000毫升去离子水。

3,建立荧光包裹

  1. 添加2克琼脂糖至50ml TBS从步骤2琼脂糖的较高熔点相比明胶(步骤4.2)将防止夹杂物的溶解和当放置在熔化明胶漏出荧光染料。任选地,加入的琼脂糖的量可以被改变为1或3克,得到较软的或可触知的肿瘤的夹杂物,分别。
  2. 加热使用微波,直到沸点达到琼脂糖​​浆。彻底搅拌直到琼脂糖完全溶解。
  3. 添加1.1克(17微摩尔)的血红蛋白和5ml脂肪乳20%溶解在50毫升的TBS的琼脂糖混合物在不断搅拌下,以类似的周围乳房假体组织(步骤4)的光学特性。
  4. 加入20.0毫克(250.8微摩尔的荧光色素吲哚花青绿83.8毫升去离子水)。确保染料完全溶解。
  5. 吸管5.0毫升从该溶液中,并把它添加到琼脂糖混合物以获得14微米的最终浓度。任选地,可以使用其他荧光染料相比ICG如果需要的话用自己的最佳浓度。
  6. 轻轻地填充在步骤1与使用注射器( 图1A)的热琼脂糖混合物中创建的硅氧烷模具。重复这个过程,直到所有的模具都充满。
  7. 让荧光夹杂物固化在室温约1小时。由覆盖有铝箔的整个模具保护从光的夹杂物。
  8. 凝固后,轻轻地打开模具和压出的夹杂物( 图1B)。或者,使用注射器的针尖对夹杂物的表面上应用小水珠融化的琼脂糖混合物。通过重复此过程数次的同一位置上,小督铁道部马刺可以创建模拟浸润性肿瘤。
  9. 避光和脱水琼脂糖夹杂物通过它们包装在铝箔和它们在潮湿的储存容器储存于4℃。
    注:较低或较高的荧光染料浓度比使用已知浓度的优化都将会导致减少的荧光信号强度。看似有悖常理降低信号强度随上述最佳荧光染料浓度的染料浓度是由于这种现象称为淬火。当评估在幻影的荧光染料的最大深度渗透,用最适浓度是必要的。

4,创建乳房幻影

  1. 获取一个杯形的模具制造所需的尺寸和体积, 玻璃或塑料碗的乳房假体。模具应具有平滑的表面,以防止凝胶的形式附着于模具。的模具VOLUM电子500毫升将创建一个具有相当规模的乳房假体。
  2. 要创建一个乳房假体与500毫升的体积,加入50克明胶250开花至500ml的TBS(步骤2)。加热在不断搅拌下将明胶浆液至50℃。
  3. 一旦明胶完全溶解后,让明胶混合物逐渐冷却并在35℃的恒定温度下用热水浴维持它。
  4. 在恒定搅拌下,加入5.5克(85毫摩尔),牛血红蛋白和25ml脂肪乳20%,分别模拟吸收的光子和散射在组织。
  5. 预冷的杯形模具中在4℃下至少1小时。接着,倒入模具中的凝胶混合物以对应于琼脂糖肿瘤模拟夹杂物( 图1C)的预定深度的水平。让明胶混合物固化在4℃下进行30分钟至1小时。
  6. 凝固后,放置一个肿瘤模拟荧光琼脂糖夹杂物的表面上幻影暂时注视列入用小针。最多3肿瘤模拟荧光灯的夹杂物可以在一个单一的乳房假体被引入。足够的空间(至少5厘米)应保持个人肿瘤模拟夹杂物( 图1D)之间。
  7. 在剩下的模具量倒入温热的明胶混合的其余部分,允许两层的坚持而不产生折射文物。标记在模具上的荧光肿瘤模拟夹杂物的位置。让幻影凝固在o / n 4℃。
  8. 一旦固化,取出用于夹杂物临时固定的针头,轻轻将其从模具中( 图1E)的乳房假体。通过将其包装在铝箔避光和脱水的乳房假体,它在湿润的储存容器储存于4℃。

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图1的序列的步骤创建一个包含荧光肿瘤模拟夹杂乳房假体的。创建所需的形状和尺寸的模具硅胶后,将模具填充有使用注射器(A)的熔化琼脂糖混合物。不同大小和形状的肿瘤模拟夹杂物产生的在目前的研究(B)。接着,薄薄的一层熔胶的混合物倒入一个定制的涂木乳腺模具(C)。凝固后,将肿瘤模拟夹杂物被定位时,暂时固着,并覆盖着熔化明胶混合物(D)的另一个层。凝固后,乳房假体是轻轻地从模具中(E)中删除。幻像然后可以应用用于模拟各种NIRF成像应用(F)。REF =“/文件/ ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg”目标=“_ blank将”>请点击这里查看该图的放大版本。

5,设置NIRF摄像系统

  1. 需要术中应用程序中的NIRF摄像系统,模拟针对性NIRF成像在乳腺癌手术。目前可用于研究几个NIRF成像系统进行实时术NIRF成像。虽然这些设备之间的一些差异存在,它们都包含一个激励光源(用于荧光肿瘤夹杂物的激发)和用于检测发射的光子的高度敏感的成像装置。
  2. 请务必使用足够的波长的激发光源。对于含有ICG肿瘤模拟夹杂物,使用的激励光源( 激光),其发射750和800纳米之间的光子。如果一个备选的荧光染料的情况下,激发波长应调整符合的毫安生产商产生的说明。
  3. 若NIRF相机系统包含一个发射滤波器滤除不需要的背景信号,确保正确的过滤器使用。对于含有ICG肿瘤模拟夹杂物,用800和850纳米之间的发射滤波器。替代性的荧光染料,可能需要不同的发射器,根据不同的制造商的说明进行操作。
    注意:请确保有激发和发射波长,以防止过饱和的图像之间的零重叠。此外,该图像捕获时间可能要进行调整,以获得最佳的荧光图像。在深层次的荧光夹杂物或弱荧光信号的情况下,图像采集时间可以增加多达几秒钟到最小。在浅的夹杂物或强的荧光信号的情况下,采集时间可以降低到几毫秒,以允许在实时视频速率荧光成像。
E“> 6。仿真技术在乳腺癌手术NIRF成像中的应用

  1. 以从容器中组织模拟乳房假体,并将其放置在平坦的非荧光面。接着,放置上述的乳房假体的NIRF成像装置中,留下了足够的工作距离为肿瘤模拟夹杂物的切除。
  2. 利用本地化NIRF成像和/或幻象乳房触诊肿瘤模拟荧光包容。万一没有荧光信号可被检测,则夹杂物或者定位在假想的检测或图像采集时间应增加太深。
  3. 一旦列入本地化​​,切开假体丰胸和消除肿瘤,包括模拟实时NIRF指导下,采用传统的手术器械。可选地,包含可切下单独引导通过目视检查和乳房假体的触诊来模拟的护理标准。
  4. 拆除后直接的肿瘤模拟夹杂物,像术腔的任何剩余的荧光活性指示切除不充分的。
  5. 在任何情况下,剩余的荧光活动,消费NIRF直接指导下,纳入剩余直到没有荧光信号离开了。
  6. 形象切除假体片段,模拟NIRF引导宏观边缘状态的评估。至此,切片3幽灵组织 - 5毫米斑和图像的斑块相应。荧光信号到达入手术切缘表示手术切缘阳性的存在。

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Representative Results

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从本研究结果已经预先别处9报告。

我们的数据表明,NIRF成像可应用于检测荧光肿瘤模拟夹杂物在组织模拟乳房假体,模拟NIRF制导保乳手术的乳腺癌患者。使用我们的幻象模型,我们发现术中肿瘤的定位,NIRF引导肿瘤切除术,手术腔边缘的术评估,并检测残留病是可行的(图2)。简单地说,一共有4乳房假体的制作,都包含两个荧光夹杂有明显的尺寸和/或形态(表1)。

除去荧光肿瘤模拟夹杂手术从用常规的外科手术器械的第一和第二乳房假体。包裹体切除术是通过触诊和OPERAT目视检查指导香港专业教育学院现场。外科医生被要求的乳房假体进行操作,直至肿瘤模拟夹杂物被完全除去。接着,将定制的荧光照相机施加到扫描术腔的任何剩余的荧光信号。在一个不完整的切除,通过强烈的剩余荧光信号所表示的情况下,被要求的外科医生切除下的实时NIRF指导列入残余。在这两种假体#1和#2,切除二分之一的肿瘤模拟夹杂物是不完整的,就证明了强烈的剩余荧光信号从术腔起源。在不完全切除的第一外科尝试之后的情况下,外科医生检测和相同的(所谓的治疗诊断)过程中,切下的残余夹杂NIRF指导下进行。 NIRF直接指导下Reexcision导致在第二次手​​术企图在所有情况下完全去除夹杂物残留,而没有必要切除大VOLUM幻影组织上课。

在第三和第四的乳房假体,NIRF引导定位和手术切除的荧光夹杂在第一外科企图进行。而接近肿瘤模拟荧光包裹,外科医生有一个监视器在他的处置上的荧光信号,预计在实时。在第四乳房假体,一种肿瘤模拟定位包含3.0厘米深是切开假体组织约1cm后才能检测到。在第三个乳房假体,既肿瘤模拟夹杂物在第一外科试图彻底除去,而除去一个浸润列入第四假想的被认为是不完整的。直接NIRF指导下Reexcision导致了这种幻象的完整切除肿瘤残。

术后,切下幻象组织片段被切成3毫米幻灯片和使用NIRF相机SYS成像的TEM模拟的手术切缘状态体外宏观评价。在所有的情况下,术后NIRF成像清晰描绘的肿瘤模拟夹杂物的边界,并表示肿瘤残余是否存在于手术切缘(图2C)。

图2
图2 NIRF成像仿真乳房假体。含有荧光肿瘤模拟夹杂物组织模拟乳房假体采用了仿真术肿瘤的定位(一),NIRF引导下肿瘤切除(B),并且NIRF引导手术切缘的评估状态(C)。 修改:Pleijhuis等,EJSO(2011) 排位轻松点击这里查看该图的放大版本。

表1概述幻象组成。 表1
共有4幻影制造,含有两个肿瘤模拟荧光夹杂物的每一个不同的大小和形状。

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Discussion

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我们通过使用乳房形幻影集成肿瘤模拟夹杂模拟NIRF制导BCS的潜在的临床应用。术中肿瘤的定位,NIRF引导下肿瘤切除术,手术的程度的评估,以及手术切缘术后评估中使用自定义构建NIRF摄像系统中的所有可行的。非侵入性的检测荧光肿瘤模拟夹杂物仅是为夹杂物定位在虚线组织在2厘米或更小的深度是可行的。术,但是,在有限的信号的穿透深度在很大程度上解决了由BCS手术的性质,其中,所述外科医生将带来所关注的组织更接近表面通过切开叠置组织。

术中NIRF成像具有一些重要的优点,包括缺乏电离辐射,该技术的一般安全性和高的分辨率9,14。此外,techniqUE提供实时反馈关于手术范围的外科医生,并允许荧光图像与手术视野的彩色图像直接集成的荧光信号13的更准确的定位。

如前所述,NIRF成像的一个重要的缺点是有限的组织穿透深度的光信号,由于吸收和光子的散射由某些组织成分10,11。以匹配正常的乳房组织的光学特性,血红蛋白和脂肪乳剂加入到我们的幻影吸收光子,分别10,15和散射。术中NIRF成像的第二个缺点是无法进行两维成像时,量化荧光信号由于信号强度和荧光染料10的浓度之间的非线性关系。

在当前的研究中,我们使用一个定制的NIRF相机术中使用。该系统获取的手术视野的两者的二维彩色图像和荧光图像。其他术中NIRF成像设备也可提供略有不同的成像策略12。不幸的是,在多中心临床试验,使用不同的成像系统和设置可能会影响结果的机构之间获得。使用假体与已知量的荧光染料可以帮助提供一个工具来校准不同的成像系统解决了这个问题。此外,该模体可用于NIRF引导外科手术培训和标准化的目的。

如前所述,荧光染料是NIRF成像的先决条件。我们选择使用ICG为肿瘤模拟夹杂物,因为它是唯一的临床级的近红外荧光染料目前可用。新的荧光团( 例如 ,IRDye 800CW)目前正在开发中,并有望获得approva升在不久的将来临床用途。不同于ICG,而不能在其临床批准的形式进行缀合,新的荧光像800CW,可以很容易地缀合于生物分子。这些新的荧光团对肿瘤靶向配体或单克隆抗体偶联使荧光染料的特异性递送到肿瘤细胞。事实上,临床前和临床研究已经表明荧光团标记的肿瘤的NIRF成像的可行性,并表示NIRF引导手术,以改善手术结果8,13,17,18,19,20。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine hemoglobin Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands H2500 Simulates absorption of photons in tissue 
Intralipid 20% Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands I141 Simulates scattering of photons in tissue
Silicone A translucent 40 (2-components poly-addition silicone) NedForm, Geleen, The Netherlands Package consists of components A and B, that should be mixed one on one (A:B=10:1).  Link to manufacturers page: http://tinyurl.com/ncjq7jx
Gelatine 250 Bloom Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands 48724 Construction of breast-shaped phantoms
Agarose Hispanagar, Burgos, Spain Construction of tumor-simulating inclusions
Tris Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands T1503 
HCl Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands 258148
NaCl Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands S9888
NaN3 Merck, Darmstadt, Germany 822335 CAUTION: severe poison. The toxicity of this compound is comparable to that of soluble alkali cyanides and the lethal dose for an adult human is about 0.7 grams.
Examples of NIRF imaging devices for intraoperative application:
T2 NIRF imaging platform  SurgVision BV, Heerenveen, The Netherlands Customized NIRF imaging system used in the current study. More details available at www.surgvision.com
Photodynamic Eye Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, Germany PC6100 www.iht-ltd.com
FLARE imaging system kit The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, USA www.theflarefoundation.org
Fluobeam Fluoptics, Grenoble, France www.fluoptics.com
Artemis handheld camera Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, the Netherlands www.quest-mi.com
Examples of NIRF fluorescent dyes for intraoperative application:
Indocyanine green ICG-PULSION,  Feldkirchen, Germany PICG0025DE   Clinical grade fluorescent dye for NIRF imaging used in the current study. More details available at www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA 929-70021 www.licor.com

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References

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Pleijhuis, R., Timmermans, A., De Jong, J., De Boer, E., Ntziachristos, V., Van Dam, G. Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery. J. Vis. Exp. (91), e51776, doi:10.3791/51776 (2014).More

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