Introduction
Выделение РНК с высокой целостности требуется для обычных экспериментов молекулярной биологии, таких как северной блоттинга 9 Qrt-ПЦР 1 или экспрессии генов профилирования 5. Большинство современных методов выделения РНК основаны на модификаций тиоцианата гуанидина протоколов 2, 3. Гуанидин тиоцианат является сильным белок денатурирующего и эффективно разрушают активность рибонуклеазы при большинстве условий. Популярный метод Chomczynski и Сакки 3 в сочетании фенола в гуанидинтиоцианата лизирующим раствором, сокращая время изоляции около 4 часов. Многие коммерчески доступные реагенты экстракции РНК основаны на Chomczynski и Sacchi метода 3.
Рибонуклеазы богатые ткани, такие как человека или мыши поджелудочной железы представляет собой дополнительную проблему для выделения РНК. Мышь поджелудочной железы может содержать до 75 мг рибонуклеазы 6 некоторые из которых выйдет Даринаг разрушение ткани поджелудочной железы, что приводит к ткани автолиза. Модификации протоколов гуанидинтиоцианата успешно используются для изоляции РНК из поджелудочной железы с высокой целостности 2, 4, 7, 10. Настой РНК стабилизации реагента в мышь поджелудочной железы способствовало изоляции РНК с высокой целостности 4, 7, 10, однако настой решения в поджелудочную железу требует большого мастерства, может потребоваться специализированные инструменты, такие как вскрытии микроскопом и нарушая архитектуру ткани во время процедуры может привести к лизису клеток. Перфузии ткани со стабилизацией РНК реагента может помешать с другими приложениями, включая изоляции белка и гистологического окрашивания. Кроме того, этот метод не подходит для выделения РНК из поджелудочной железы человека. Другие протоколы требуют подготовки конкретных решений следователем 2.
Мы сообщаем протокол для изоляции РНК с высокой целостности от мыши поджелудочной железы. Чтэ протокол использует элементы ранее опубликованных методов и в значительной степени основаны на стандартных фенол / гуанидинтиоцианата основе лизиса протоколов реагентов. Она не требует подготовки специализированных решений и не требует вливания реагентов в поджелудочную железу. Критические шаги для успешного выделения РНК включают высокую фенол / гуанидина на основе лизиса реагента соотношение тканей, удаления непереваренной ткани предварительного разделения фаз и включение ингибитора рибонуклеазы к полученному раствора РНК. Используя эти и другие модификации, мы обычно изолировать РНК с RIN больше, чем 7, который будет использоваться для рутинного анализа экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
Следующие примеры из практики придерживаться политики, описанных уходу и использованию животных комитета Учреждения (IACUC) на.
- Рекомендуется изолировать не более 6 поджелудочная железа мыши в любой день. Есть все хирургические инструменты чистые и автоклавного, один комплект на одно животное.
- Этикетка все микроцентрифужных пробирок. Четыре 2 мл трубки на животное.
- Поместите 8 мл лизирующего реагента в 50 мл центрифужные пробирки на льду. Примечание: В то время как набор для очистки поставляется с гуанидин тиоцианат фенола реагентом, который подходит для изоляции поджелудочной железы, лизис Реагент используют из-за больших объемов, которые необходимы в изоляции.
- Внесите около 10 мл следующих растворов в 15 мл центрифужные пробирки для очистки лезвия гомогенизатор в. Этанол, 70% (2 трубки), ВЭЖХ воды (1 туба) и ВЭЖХ вода, содержащая около 200 мкл РНКазы далеко или эквивалентную инактиватор рибонуклеазы. 2. Хирургия, поджелудочная железа Вскрытие и усреднении
- Поместите 1-2 мл изофлураном в банку, содержащей хлопок марлевые или бумажные полотенца. Мышей помещали на платформе, которая не позволяет им достичь источник изофлураном. Добавить свежий изофлурана в банку до обезболивающее каждой мыши.
- Аккуратно поместите мышь в банку, содержащую изофлурана. Закройте банку и мониторинг последствий наркоза, осторожно вращая банку и обратно. Животное находится под наркозом, когда он будет в состоянии стоять в его 'самостоятельно.
- Для подтверждения анестезии, удалить животное из банки и применять твердую ног щепотку. Если мышь не реагирует на носочной крайнем случае, перейдите к шагу 2.5.
- Если мышь реагирует на носок крайнем случае, повторите шаги 2,2 до 2,3.
- Поместите наркозом животного на скамейке верхней в положении лежа. Вывихнуть шейки матки мышки по плотно размещения левую руку на шейку матки мыши. НамING правая рука понять хвост мыши и быстро потянуть вверх примерно под углом 45 ° вывихнуть шейку матки.
- Закрепите каркас к поверхности (уровень кусок пенопласта покрыты бумажными полотенцами), прокалывая каждый из четырех лапах животного в плоской поверхности с помощью 25 калибра иглы для подкожных инъекций.
- Использование стерильных хирургических инструментов, сократить животик мыши открытым и быстро удалить поджелудочную железу от мыши. Используйте пинцет, чтобы удерживать поджелудочную железу и сократить его из селезенки и тонкой кишки с помощью пружинных ножниц. Будьте осторожны, чтобы не растянуть поджелудочную железу при снятии с помощью мыши. Срыв ткани могли выпустить рибонуклеазу. Примечание: Время, необходимое для удаления поджелудочной железы от мыши имеет решающее значение. Специалист должен уметь анализировать поджелудочную железу в 1 мин или менее.
- Поместите целые поджелудочной железы в 50 мл пробирку, содержащую 8 мл охлажденного льдом лизиса реагента. Закройте пробирку крышкой и кратко встряхнуть, чтобы погружать тиы п в реагент и перейти к следующей стадии без задержки. Отношение лизиса реагента в ткани имеет решающее значение. См. раздел Результаты для сравнения целостности РНК, выделенной с помощью различных объемов реактива для лизиса.
- Гомогенизации в течение 5 сек. Важно, чтобы нажать лопасти гомогенизатора в нижней части центрифужную пробирку, чтобы позволить ткани втягиваться в лопастей для эффективного гомогенизации.
- Передача 2 мл реактива для лизиса, содержащие лизированных поджелудочной железы в 2 мл трубки микроцентрифужных. Соберите два микроцентрифужных трубки гомогената на изоляции. Откажитесь от оставшегося гомогената или хранить при температуре -80 ° С для будущих исследований.
- Центrifuge при 4 ° С, 12 000 × г в течение 5 мин для осаждения непереваренной ткани. Это очень важный шаг, так как переносу непереваренной ткани в последующих решений РНК, скорее всего, загрязнять образец рибонуклеазой (шаг 5,13).
- Передача 1 мл супернатанта в 2 мл микроцентрифужных трубки. Перейдите с изоляцией сразу и хранить репликации трубку при -80 ° С для дальнейшего использования. Поместите все пробирки, содержащие гомогената на льду в то время как перейти к следующему шагу.
- Утилизацию оставшегося реактива для лизиса в соответствующую емкость химических отходов.
- Прежде чем перейти к следующему изоляции, очистить лопасти гомогенизатора, помещая их в 10 мл 70% этанола. Активируйте гомогенизатора для о в течение 20 сек, чтобы удалить любые куски ткани, которые могут быть захвачены ножами.
- Используйте наконечника 200 мкл пипетки, чтобы удалить любые части, которые остаются в лезвий гомогенизатора. Повторите шаг 4.1 в воде, генеральный РНКазы инактиватора и 70% этанола. Высушите гомогенизатор вал с чистой Ким протрите.
- Повторите шаг 2.1 для выделения поджелудочной железы оставшихся животных, сохраняя РНК, выделенной из каждого животного отдельно, а не объединения РНК.
- При использовании замороженного раствора гомогената оттаивать на льду и выдержать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить 200 мкл хлороформа, колпачок трубки и энергично встряхивают вручную в течение 15 сек. Оставьте пробирку при комнатной температуре в течение 2-3 мин.
- Центрифуга в течение 15 мин при 12000 х г, 4 ° С.
- Передача верхний водный слой в микроцентрифужных трубки. Добавить 1,5 объемы изопропанола и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Трансфер до 700 мкл образца в колонке спина, который помещен в 2 мл пробирку. Закройте крышку и центрифуги при 8000 мкг в течение 15 сек при комнатной температуре.
- Откажитесь от проточные.
- Повторите этапы 5,5-5,6, используя оставшуюся часть образца.
- Добавить 700 мкл буфера RWT к колонке спина. Центрифуга в течение 15 сек при 8000 х г. Откажитесь от проточные.
- Внесите 500 мкл буфера НПП в колонну спина. Центрифуга в течение 15 сек при 8000 мкг в мыть столбец. Откажитесь от проточные.
- Добавить 500 мкл буфера RPE в колонну спина. Центрифуга течение 2 мин при 8000 х г в сухой колонки.
- Передача столбец отжима в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Внесите 80 мкл рибонуклеазы без воды непосредственно на спин колонки мембраны. Центрифуга течение 1 мин при 8000 х г дл элюировани РНК.
- Добавить ингибитора РНКазы 1 мкл РНК в растворе. Хранить при температуре -80 ° С или перейти к 5,13.
- Для проверки целостности РНК, сначала вычислить РНК Concentration и 260/280 соотношение помощью спектрофотометра.
- Развести часть раствора РНК приблизительно 500 нг / мкл с помощью биологически очищенной воды.
- Определите РНК целостности (то есть, Рин) с помощью капиллярного электрофореза анализа. Примерно 5 мкл раствора РНК является достаточным для анализа.
- Алиготе РНК решение (см. рисунок 2) и хранить при температуре -80 ° С.
3. Удаление непереваренной ткани
Примечание: После гомогенизации, небольшие кусочки ткани будет оставаться в реактива для лизиса. Это более важно, чтобы быстро лизировать ткани, оставляя некоторые ткани непереваренной, а не по гомогенизации и деградации риска РНК.
4. Очистка Гомогенизатор Лезвия
5. Выделение РНК
В следующем разделе идентичен протоколу набора для очистки. Преимущество набора для очистки является то, что он будет изолировать общей РНК в том числе малых РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий выход РНК из 1 мл лизирующего гомогената составляет 20-40 мкг. OD 260/280 отношения, как правило, вокруг 2.0 и РИН последовательно превышает 7,0. Если Рин ≤ 6, изоляция нужно будет повторить. Иногда RIN, что выше, чем 8,0 достигается.
Два наиболее часто используемые методы эвтаназии мышей перед удалением поджелудочной железы являются CO 2 удушья или вдыхание изофлураном. Оба метода с последующим смещением шейных позвонков. Поскольку не исключено, что химическое вещество и / или процедуры время может повлиять на целостность РНК, в RIN мышиного поджелудочной РНК, выделенной с помощью обоих методов сравнивали. Мышей наркозом с помощью СО 2 удушье или ИФ ингаляции; Вслед за цервикальной дислокации оба метода. Время обезболивающее животных до смещения шейных позвонков был приблизительно от 1 до 2 мин дольше CO 2 удушья сравнению с isoflurane. РНК, выделенной после ингаляции изофлураном произвел RIN 7,5 ± 0,31 по сравнению с RIN 2,2 ± 0,3 (р <10 -4, среднее ± стандартное отклонение, тройные обособления) для CO 2 удушья. Метод эвтаназии имеет сильное влияние на целостность РНК и техника изофлурана ингаляции предпочтительно CO 2 удушье.
Целостность РНК, выделенной из поджелудочной железы мыши, которые гомогенизировали в 2, 4 и 8 мл лизирующего реагента были сопоставлены. Мы предположили, что увеличение объема реагента для лизиса приведет к большей степени инактивации рибонуклеазы. Кроме объема реагента для лизиса, все условия были идентичны тем, которые указаны в протоколе. Был прямая корреляция между объемом использованию реактива для лизиса в гомогенизации и целостности РНК (рис. 1). РИН РНК выделяли с использованием 2, 4 и 8 мл реактива для лизиса составил 4,2, 6,5 и 7,4 соответственно (в среднем, трех экземплярах являетсяolations). Поэтому 8 мл лизирующего реагента следует использовать в данном протоколе.
Для некоторых экспериментах, это может быть необходимо собрать как РНК и белка из той же поджелудочной железы. Например, РНК могут быть использованы для QRT-PCR и белок может быть визуализированы с помощью иммуногистохимии. Если это так, то рекомендуется сократить поджелудочную железу в половине от головы до хвоста. Это важно, поскольку поджелудочная железа анатомически отличается от головы до хвоста. Чтобы продемонстрировать, если какие-либо различия в целостности РНК существует между РНК, выделенной из любой половины поджелудочной железы, следующий эксперимент был проведен. РНК выделяли из первой половины поджелудочной железы. RIN определяется из этой РНК по сравнению с РНК, выделенной из второй половины поджелудочной железы после того, как СБ при КТ в течение примерно 30 секунд при обработкой исходного наполовину. RIN для первоначальной половине поджелудочной железы составила 7,4 ± 0,20 по сравнению с 6,9 RIN ± 0,55 для последующей половины. При резке поджелудочную железу вэта манера не появляется выпустить рибонуклеазу и пищеварение РНК, если поджелудочная железа должна быть секционного, рекомендуется использовать первую половину для анализа РНК и во второй половине для белка.
Лизис реагент нарушает структуру белка и, следовательно, снижает рибонуклеазную деятельность. Из-за большого количества рибонуклеазы, который присутствует в поджелудочной железе, вполне возможно, что некоторые активной рибонуклеазы остается в лизиса гомогената и это будет рибонуклеазы в равновесие в водной фазе. Любой рибонуклеазы, что остается в прошлом РНК решения будет препятствовать целостности. Чтобы преодолеть это, мы добавили ингибитор рибонуклеазы в водном растворе РНК. Целостность РНК по сравнению с РНК раствора, содержащего ингибитор рибонуклеазы против одного, что сделал не так. По одной замораживания оттепели, РИН для решения РНК с ингибитором составила 7,3 ± 0,15 против 2,9 ± 0,65 (рис. 2, р <0,001, среднее ± стандартное отклонение, тройные обособления) длярешение, которое не содержит ингибитор. Еще одной проблемой является возможность того, что повторяется замораживания оттаивания будет денатурации рибонуклеазы ингибитор делает его неэффективным. Чтобы исследовать эту возможность, раствор ингибитора рибонуклеазы, содержащего РНК неоднократно замораживали и оттаивали. РНК решения, которые были замораживать и оттаивать до 5 раз по-прежнему производится в RIN 7 или выше, а те решения, которые были замораживать и оттаивать 6 раз или более высокие произвел RIN ниже 7 (рис. 2). Рекомендуется аликвоту РНК раствор перед замораживанием и ограничить количество циклов замораживания оттаивания.
Чтобы продемонстрировать полезность этого метода, мы провели QRT-PCR на выделенной РНК. Средний РИН от трех экземплярах РНК выделений составила 7,4 ± 0,20 (среднее ± SD). Случайное загрунтованную кДНК синтезировали из РНК и экспрессии трех генов домашнего хозяйства измеряли количественной ПЦР с использованием стандартных методик. Данные, приведенные на рисунке 3 Проверяетнаша способность успешно использовать мыши поджелудочной РНК в стандартной методике молекулярной биологии.
Рисунок 1. High лизис реагент в соотношении ткани улучшает целостность РНК. Целостность РНК, выделенной из поджелудочной железы мыши, которые гомогенизировали в 2 (A, D), 4 (В, Е) или 8 (C, F) мл лизирующего реагента по сравнению. Кроме объема реагента для лизиса, все условия были идентичны тем, которые в описано в протоколе здесь. Существует прямая связь между объемом использованию реактива для лизиса в гомогенизации и РНК целостности. (G) Среднее ± SD, тройные изоляция. р <0,05, ** р <0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенноеэтой фигуры.
Рисунок 2. РНК в конечном счете ухудшает при повторном сублимационной оттаивания. РНК, выделенной из поджелудочной железы мыши неоднократно замораживали и оттаивали в присутствии или в отсутствие ингибитора рибонуклеазы (РНКазы I). Среднее ± SEM, ** р <0,001.
Рисунок 3. Qrt-PCR из мыши поджелудочной РНК. РНК выделяли из трех поджелудочной железы мыши с помощью оптимизированный протокол. Выражение 18S рРНК, β-2-микроглобулина и snoRNA251 определяли с помощью Qrt-ПЦР (среднее ± SD).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изоляция РНК из тканей, которые рибонуклеазы богатых представляет собой серьезную проблему для экспериментов молекулярной биологии. Различные Реагенты и наборы, которые коммерчески доступны, которые в основном основано на методе фенол гуанидин тиоцианат экстракции РНК. Гуанидин тиоцианат денатурации белка и, следовательно, снижает активность рибонуклеазы. Тем не менее, сами масштабы рибонуклеазы в поджелудочной железе требует дополнительных изменений в стандартных протоколов выделения РНК. Протокол сообщается здесь, который основан на стандартном методе гуанидин тиоцианат еще содержит несколько важных модификаций, а также подсказки для успешного выделения РНК из рибонуклеазы богатых тканей, таких как поджелудочной железы.
Стандартные рекомендации по выделения РНК можно было бы отметить. Эти методы имеют решающее значение для успешного выделения РНК, даже из образцов, которые являются менее рибонуклеазу богатых, чем поджелудочной железы. Некоторые примеры включают помощью биологически очищенной ватер, рибонуклеазы без расходных материалов и одноразовой пластиковой посуды, а не стекла. Рекомендуется изменить перчатки после каждого изоляции. Для тех, кто не имеет опыта с выделения РНК, рекомендуется, что они приобретают опыт с выделения РНК из образцов рибонуклеазных бедных, таких как печень или из клеточных культур, до начала работы на работу, требующую выделения РНК из поджелудочной железы. Отлично протоколы существуют, которые предлагают разнообразные баллов за успешно работает с РНК 8.
Несколько важных факторов для выделения РНК с высокой целостности от мыши поджелудочной железы, как сообщается здесь. Они включают в себя объем лизирующего реагента, используемого в процессе гомогенизации и включение ингибитора рибонуклеазы в растворе РНК. Метод включая ингибитор рибонуклеазы работает хорошо, однако повторяющиеся циклы замораживания и оттаивания в конечном итоге уменьшить RIN, вероятно, из-за денатурации ингибитор рибонуклеазы. Следует отметить, что все решения и РНКСЭД в данном исследовании пошел через один замораживания оттепели до определения RIN. Другой способ снижения деградации по замораживания-размораживания для хранения РНК раствор при -20 ° С в осажденной форме 2. Это дает некоторые неудобства, а именно удаления этанола и повторно растворения осадка перед использованием РНК. По сравнению с фенол / тиоцианата гуанидина реагентов протоколов 2, преимущества протокола сообщалось здесь является простота работы с реактива для лизиса и набор для очистки, которые не требуют подготовки специальных растворов и буферов. Следует также отметить, что этот протокол был успешно использован для изоляции малые РНК из поджелудочной железы мыши.
Дополнительные советы включают скорость поджелудочной железы рассечение и метод анестезии до эвтаназии (ИФ ингаляции предпочтительно CO 2 удушье). Несколько попыток практиковать поджелудочной железы хирургии рекомендуется перед предвидя высокую качествти РНК. Адаптация этой протокола к рибонуклеазных богатых тканях, таких как селезенка или легких должны быть легко достижимы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Цзяньхуа Линг, Раймонд Макдоналд, Galvin Свифт, Мишель Гриффин, Пол Grippo и Сатьянараяна Rachagani за их полезные комментарии, предложения и обмена протоколов к ним. Эта работа была поддержана грантом U01CA111294 и премию развития идея с Программой Государственного Университета Огайо Интрамурального Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
