Introduction
Se requiere Aislamiento de ARN con una alta integridad para los experimentos de biología molecular de rutina, como el norte de borrones 9, QRT-PCR 1 o perfiles de expresión genética 5. La mayoría de los métodos contemporáneos de aislamiento de ARN se basan en modificaciones de los protocolos de tiocianato de guanidina 2, 3. Tiocianato de guanidina es un fuerte desnaturalizante de proteínas y se interrumpir efectivamente la actividad de la ribonucleasa bajo la mayoría de condiciones. El método popular de Chomczynski y Sacchi 3 combinó fenol a la solución de tiocianato de guanidina de lisis, lo que reduce el tiempo de aislamiento a aproximadamente 4 horas. Muchos reactivos de extracción de ARN comercialmente disponibles se basan en el método de Chomczynski y Sacchi 3.
Ribonucleasa tejidos ricos como humano o de ratón páncreas presenta un desafío adicional para el aislamiento de ARN. Ratón páncreas puede contener hasta 75 mg de ribonucleasa 6 algunos de los cuales se dará a conocer During interrupción del tejido pancreático que resulta en la autolisis de los tejidos. Las modificaciones de los protocolos de tiocianato de guanidina se han utilizado con éxito para aislar ARN a partir de páncreas con alta integridad 2, 4, 7, 10. Infusión de ARN de estabilización reactivo en páncreas de ratón aislamiento facilitado de ARN con alta integridad 4, 7, 10, sin embargo infusión de soluciones en el páncreas requiere una gran habilidad, pueden requerir instrumentos especializados tales como un microscopio de disección y alterar la arquitectura del tejido durante el procedimiento puede resultar en la lisis celular. Perfusión tisular con el reactivo de estabilización de ARN podría interferir con otras aplicaciones como el aislamiento de proteínas y la tinción histológica. Además, esta técnica no es adecuada para el aislamiento de ARN a partir de páncreas humano. Otros protocolos requieren la preparación de soluciones específicas del investigador 2.
Se presenta un protocolo para aislar ARN con una alta integridad de páncreas de ratón. Thprotocolo de correo utiliza elementos de los métodos publicados anteriormente y se basa en gran parte de los protocolos de reactivo de lisis estándar de fenol / guanidina basado en tiocianato. No requiere la preparación de soluciones especializados ni requiere la infusión de los reactivos en el páncreas. Los pasos críticos para el aislamiento de ARN éxito incluyen un fenol alta / a base de guanidina lisis reactivo proporción de tejidos, extracción de tejido no digerido antes de la separación de fases y la inclusión de un inhibidor de ribonucleasa a la solución de ARN resultante. El uso de estas y otras modificaciones, que típicamente aislar el ARN con Rin mayor que 7 para ser utilizado para el análisis de la expresión génica de rutina.
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Protocol
1. Preparación
Las siguientes prácticas se adhieren a las políticas establecidas por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Institución (IACUC).
- Se recomienda aislar a no más de 6 páncreas de ratón en un día determinado. Tener todos los instrumentos quirúrgicos limpios y esterilizados en autoclave, un juego por animal.
- Marque todos los tubos de microcentrífuga. Cuatro tubos de 2 ml por animal.
- Coloque 8 ml de reactivo de lisis en 50 ml tubos de centrífuga en hielo. Nota: Mientras que el kit de purificación viene con un reactivo de fenol de tiocianato de guanidina que es adecuado para el aislamiento páncreas, reactivo de lisis se utiliza debido a los grandes volúmenes que son necesarios por el aislamiento.
- Vierta aproximadamente 10 ml de las siguientes soluciones en 15 ml tubos de centrífuga para la limpieza de las cuchillas del homogeneizador. Etanol, 70% (2 tubos), agua de calidad HPLC (1 tubo) y agua de grado HPLC que contiene aproximadamente 200 l de RNasa visitante o inactivador ribonucleasa equivalente. 2. Cirugía, Dissection Páncreas y homogeneización
- Coloque 1.2 ml de isoflurano en un frasco que contiene gasa de algodón o toallas de papel. Los ratones se colocan en una plataforma que les impide alcanzar la fuente de la isoflurano. Añadir isoflurano fresca en la jarra antes de anestesiar cada ratón.
- Con cuidado, coloque el ratón en el frasco que contiene el isoflurano. Tapar el frasco y controlar los efectos de la anestesia, girando suavemente el frasco de un lado a otro. El animal se anestesia una vez que está en incapaz de soportar en su 'propia.
- Para la confirmación de la anestesia, retire al animal del frasco y aplicar una pizca dedo del pie firme. Si el ratón no reacciona a la pizca dedo del pie, siga en el paso 2.5.
- Si el ratón reacciona a la pizca dedo del pie, a continuación, repita los pasos 2.2 hasta 2.3.
- Colocar el animal anestesiado en la mesa de trabajo en la posición prona. Dislocar el cuello uterino de ratón por fuerza colocando la mano izquierda sobre el cuello uterino de ratón. Nosotrosción de la mano derecha agarre la cola del ratón y tire hacia arriba de forma rápida a un ángulo aproximado de 45 ° para dislocar el cuello del útero.
- Fije la carcasa a una superficie (una pieza nivel de espuma de poliestireno cubierta con toallas de papel) por la perforación de cada uno de cuatro patas de los animales en la superficie plana usando calibre 25 agujas hipodérmicas.
- El uso de instrumentos quirúrgicos estériles, cortar la sección media del ratón abierta y rápidamente extirpar el páncreas del ratón. Utilice las pinzas para sujetar el páncreas y cortarlo del bazo y el intestino delgado utilizando tijeras de primavera. Tenga cuidado de no estirar el páncreas durante la eliminación del uso del ratón. La alteración del tejido podría liberar ribonucleasa. Nota: El tiempo que se necesita para extirpar el páncreas del ratón es crítica. Un experto en la materia debe ser capaz de diseccionar el páncreas en aproximadamente 1 min o menos.
- Coloque todo el páncreas en un tubo de 50 ml que contiene 8 ml de hielo reactivo de lisis frío. Tapar el tubo y agitar brevemente para sumergir el tiN ú mero en el reactivo y proceder a la siguiente etapa sin demora. La proporción de reactivo de lisis a los tejidos es crítico. Ver la sección de resultados para una comparación de la integridad del ARN aislado usando diferentes volúmenes de reactivo de lisis.
- Homogeneizar durante 5 seg. Es importante presionar las cuchillas homogeneizador para la parte inferior del tubo de centrífuga para permitir que el tejido sea arrastrado hacia las cuchillas para la homogeneización eficiente.
- Transferencia de 2 ml de reactivo de lisis que contiene el páncreas lisadas a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Recoge dos tubos de microcentrífuga de homogeneizado por el aislamiento. Deseche el material homogeneizado restante o almacenar a -80 ° C para futuros estudios.
- Centavorifuge a 4 º C, 12000 × g durante 5 min para sedimentar el tejido no digerido. Este es un paso crítico como el arrastre de tejido no digerido en soluciones posteriores de ARN probablemente contamine la muestra con ribonucleasa (paso 5,13).
- Transferencia de 1 ml del sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Proceda con el aislamiento inmediato y guarde el tubo de réplica a -80 ° C para su uso futuro. Coloque todos los tubos que contienen homogeneizado en hielo húmedo mientras se procede al siguiente paso.
- Deseche el reactivo de lisis restante en un recipiente para desechos químicos apropiados.
- Antes de proceder a la siguiente aislamiento, limpiar las cuchillas homogeneizador colocándolos en 10 ml de etanol al 70%. Active el homogeneizador por alrededor de 20 segundos para quitar cualquier pedazo de tejido que pueden estar atrapados en las cuchillas.
- Utilice una punta de pipeta de 200 l para eliminar las piezas que permanecen en las cuchillas homogeneizador. Repita el paso 4.1 en el agua, en general inactivador Rnase y etanol al 70%. Secar el eje homogeneizador con una toallita limpia Kim.
- Repita el paso 2.1 para el aislamiento del páncreas de los animales restantes, manteniendo ARN aislado de cada animal por separado en lugar de puesta en común de la ARN.
- Si se utiliza la solución homogeneizado congelado, descongelar en hielo húmedo y dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 200 l de cloroformo, tapar el tubo y agitar enérgicamente a mano durante 15 segundos. Deje reposar el tubo a temperatura ambiente durante 2-3 min.
- Centrifugar durante 15 minutos a 12.000 xg, 4 º C
- Transferir la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga. Añadir 1,5 volúmenes de isopropanol y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
- Traslado hasta el 700 l de la muestra en una columna de centrifugación que se coloca en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a 8000 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente.
- Deseche el flujo directo.
- Repetir los pasos 5.5 a 5.6, utilizando el resto de la muestra.
- Añadir 700 l Buffer TAR a la columna de centrifugación. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Deseche el flujo directo.
- Pipetear 500 l de tampón RPE en la columna de centrifugación. Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 x g para lavar la columna. Deseche el flujo directo.
- Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación. Centrifugar durante 2 min a 8000 xg para secar la columna.
- Transferir la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetear 80 l de agua libre de ribonucleasa directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación. Centrifugar durante 1 min a 8000 xg para eluir el ARN.
- Añadir 1 l inhibidor de RNasa a la solución de ARN. Almacenar a -80 ° C o proceder a 5.13.
- Para validar la integridad del ARN, primero calcular la conce ARNntration y 260/280 escala utilizando un espectrofotómetro.
- Diluir una porción de la solución de ARN a aproximadamente 500 ng / l con agua de grado de biología molecular.
- Determinar el ARN integridad (es decir, RIN) utilizando el análisis de electroforesis capilar. Aproximadamente 5 l de solución de ARN es suficiente para el análisis.
- Alícuota de la solución de ARN (véase la Figura 2) y se almacena a -80 ° C.
3. Eliminación de tejido no digerido
Nota: Después de la homogeneización, pequeños trozos de tejido se mantendrán en el reactivo de lisis. Es más importante para lisar rápidamente el tejido dejando algo de tejido sin digerir en lugar de sobre la homogeneización y la degradación riesgo de ARN.
4. Limpieza de las cuchillas Homogeneizador
5. Aislamiento de ARN
La siguiente sección es idéntica a el protocolo del kit de purificación. La ventaja de el kit de purificación es que va a aislar el ARN total, incluyendo pequeños RNAs.
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Representative Results
El rendimiento total de ARN a partir de 1 ml de homogeneizado de lisis es 20-40 mg. OD 260/280 ratios son típicamente alrededor de 2.0 y el RIN son consistentemente superior a 7,0. Si el RIN es ≤ 6, será necesario repetir el aislamiento. De vez en cuando, se consigue un RIN que es mayor que 8,0.
Los dos métodos más utilizados de la eutanasia de los ratones antes de la extracción del páncreas son asfixia de CO 2 o la inhalación de isoflurano. Ambas técnicas son seguidos por dislocación cervical. Dado que es posible que el tiempo de agente y / o procedimiento químico podría influir en la integridad del ARN, el RIN de ARN de páncreas de ratón aislado utilizando ambas técnicas se comparó. Los ratones fueron anestesiados utilizando asfixia de CO 2 o la inhalación de isoflurano; ambas técnicas fueron seguidos por dislocación cervical. El tiempo de anestesiar a los animales antes de la dislocación cervical fue de aproximadamente 1 a 2 minutos más largo para asfixia de CO 2 en comparación con isoflUrane. ARN aislado tras la inhalación de isoflurano produce una RIN de 7,5 ± 0,31 en comparación con un RIN de 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, media ± DE, por triplicado aislamientos) por asfixia de CO 2. El método de la eutanasia tiene un impacto dramático en la integridad del ARN y se prefiere la técnica de inhalación de isoflurano a CO 2 asfixia.
La integridad del ARN aislado de páncreas de ratón que se homogeneizaron en 2, 4 y 8 ml de reactivo de lisis se compararon. La hipótesis de que el aumento del volumen de reactivo de lisis dará lugar a un mayor grado de inactivación de ribonucleasa. Otros que el volumen de reactivo de lisis, todas las condiciones fueron idénticas a las enumeradas en el protocolo. Hubo una correlación directa entre el volumen de reactivo de lisis utilizado en la homogeneización y la integridad del ARN (Figura 1). El RIN de ARN aislado utilizando 2, 4 y 8 ml de reactivo de lisis era 4.2, 6.5 y 7.4, respectivamente (media, es triplicadoolations). Por lo tanto 8 ml de reactivo de lisis deben ser utilizados en este protocolo.
Para algunos experimentos, puede ser necesario para recoger tanto el ARN y la proteína de la misma páncreas. Por ejemplo, el ARN puede ser utilizado para QRT-PCR y la proteína puede ser visualizada mediante inmunohistoquímica. Si este es el caso, se recomienda para cortar el páncreas en medio de la cabeza a la cola. Esto es importante ya que el páncreas se diferencia anatómica de la cabeza a la cola. Para demostrar si las diferencias en la integridad del ARN existe entre el ARN aislado de cualquier mitad del páncreas, se realizó el siguiente experimento. Se aisló el ARN de la primera mitad de los páncreas. El RIN determina a partir de este ARN se comparó con la de ARN aislado a partir de la segunda mitad del páncreas después de que se sentó a ta durante aproximadamente 30 segundos durante el estudio diagnóstico de la media inicial. La RIN para el medio inicial de páncreas fue de 7,4 ± 0,20 en comparación con un RIN de 6,9 ± 0,55 para la posterior media. Si bien el corte del páncreas en elesta manera no aparece para liberar ribonucleasa y la digestión de ARN, si el páncreas es a ser seccionados, se recomienda utilizar la primera media para el análisis de ARN y el segundo medio para la proteína.
Reactivo de lisis interrumpe estructura de la proteína y por lo tanto reduce la actividad de ribonucleasa. Debido a la gran cantidad de ribonucleasa que está presente en el páncreas, es posible que algunos ribonucleasa activa permanece en el homogeneizado de lisis y esta ribonucleasa se equilibrará a la fase acuosa. Cualquier ribonucleasa que permanece en la última solución de ARN impedirá integridad. Para superar esto, se añadió un inhibidor de la ribonucleasa de la solución acuosa de ARN. La integridad del ARN se comparó a partir de una solución de ARN que contenía inhibidor de ribonucleasa a uno que no lo hizo. Tras una congelación y descongelación, la RIN para la solución de ARN con inhibidor fue de 7,3 ± 0,15 en comparación con 2,9 ± 0,65 (Figura 2, p <0,001, media ± DE, por triplicado aislamientos) para elsolución que no contiene inhibidor. Otra cuestión es la posibilidad de que repite congelación descongelación será desnaturalizar la ribonucleasa inhibidor haciéndolo ineficaz. Para examinar esta posibilidad, una solución de ARN que contiene inhibidor de la ribonucleasa se congeló y se descongeló en repetidas ocasiones. Las soluciones de ARN que fueron congelados y descongelados hasta 5 veces todavía producen un RIN de 7 o más alto, mientras que las soluciones que fueron congelados y descongelados 6 veces o más altas producen un RIN por debajo de 7 (Figura 2). Se recomienda alícuota de la solución de ARN antes de la congelación y limitar el número de ciclos de congelación y descongelación.
Para demostrar la utilidad de este método, se realizó QRT-PCR en el ARN aislado. La media RIN de ARN aislamientos triplicados fue de 7.4 ± 0.20 (media ± DE). ADNc cebado al azar se sintetizó a partir del ARN y la expresión de tres genes de limpieza se midió por qPCR utilizando técnicas estándar. Los datos mostrados en la Figura 3 validanuestra capacidad para utilizar con éxito ARN de páncreas de ratón en una técnica de biología molecular estándar.
Figura 1. Alta lisis reactivo a la proporción de tejido mejora la integridad del ARN. La integridad de ARN aislado a partir de páncreas de ratón que se homogeneizó en 2 (A, D), 4 (B, E) o 8 (c, f) ml de reactivo de lisis se en comparación. Otros que el volumen de reactivo de lisis, todas las condiciones fueron idénticas a las del descrito en el protocolo en el presente documento. Existe una correlación directa entre el volumen de reactivo de lisis utilizado en la integridad de homogeneización y el ARN. (G) Media ± SD, aislamientos triplicado. p <0,05, ** p <0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grandede esta cifra.
Figura 2. ARN se degrada eventualmente repetida de congelación descongelación. ARN aislado a partir de páncreas de ratón fue congelado y descongelado en presencia o ausencia de inhibidor de ribonucleasa (RNasa I) repetidamente. Media ± SEM, ** p <0,001.
Figura 3. QRT-PCR de ARN de páncreas de ratón. RNA fue aislado de tres páncreas de ratón utilizando el protocolo optimizado. La expresión del 18S rRNA, β-2 microglobulina y snoRNA251 se determinó a través de QRT-PCR (media ± DE).
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Discussion
Aislar ARN de tejidos que se ribonucleasa rico representa un gran reto para los experimentos de biología molecular. Varios reactivos y kits están disponibles en el mercado que se basan principalmente en el método de tiocianato de guanidina fenol de la extracción de RNA. Tiocianato de guanidina desnaturaliza la proteína y por lo tanto reduce la actividad de la ribonucleasa. Sin embargo, la magnitud de la ribonucleasa en el páncreas requiere modificaciones adicionales a los protocolos estándar de aislamiento de ARN. Un protocolo se informa aquí que se basa en el método de tiocianato de guanidina estándar todavía contiene varias modificaciones críticos, así como consejos para el aislamiento exitoso de ARN a partir de ribonucleasa tejidos ricos tales como el páncreas.
Directrices estándar para el aislamiento de ARN son de señalar. Estas técnicas son críticos para el aislamiento exitoso de ARN, incluso a partir de muestras que son menos ribonucleasa-rica de páncreas. Algunos ejemplos incluyen el uso de la biología molecular wa gradoter, consumibles-ribonucleasa libre y artículos de plástico desechables en lugar de vidrio. Se recomienda cambiar los guantes entre cada aislamiento. Para alguien que no tiene experiencia con el aislamiento de ARN, se recomienda que ganen experiencia con el aislamiento de ARN de las muestras-ribonucleasa pobres, como el hígado o en cultivos celulares antes de embarcarse en el trabajo que requiere el aislamiento de ARN a partir de páncreas. Existen protocolos excelentes que ofrecen una variedad de puntos para trabajar con éxito con RNA 8.
Varios factores importantes para el aislamiento de ARN con una alta integridad de páncreas de ratón se reportan aquí. Estos incluyen el volumen de reactivo de lisis utilizado durante la homogeneización y la inclusión de un inhibidor de la ribonucleasa de la solución de ARN. El método de incluir el inhibidor de la ribonucleasa funciona bien, ciclos de congelación y descongelación repetidas sin embargo eventualmente reducir la RIN, probablemente debido a la desnaturalización del inhibidor de la ribonucleasa. Cabe señalar que todas las soluciones de ARN used en este estudio fue a través de una congelación y descongelación antes de la determinación RIN. Otro método de reducir la degradación a congelación-descongelación es para almacenar la solución de ARN a -20 ° C en una forma precipitada 2. Esto ofrece algunos inconvenientes a saber, la eliminación de los etanol y volver a disolver el sedimento antes de usar el ARN. En comparación con las de fenol / guanidina tiocianato de protocolos de reactivos 2, ventajas del protocolo informaron aquí es la simplicidad de trabajo con el reactivo de lisis y el kit de purificación que no requieren preparación de soluciones especializadas y tampones. También hay que señalar que este protocolo ha sido utilizado con éxito para aislar ARN pequeños de páncreas de ratón.
Consejos adicionales incluyen la velocidad de la disección páncreas y el método de la anestesia antes de la eutanasia (se prefiere la inhalación de isoflurano a asfixia de CO 2). Varios intentos de practicar la cirugía de páncreas se recomiendan antes de anticipar alta caliARN ty. La adaptación de este protocolo a los tejidos ribonucleasa rico como el bazo o los pulmones debe ser fácilmente alcanzable.
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Acknowledgments
Agradecemos Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo y Satyanarayana Rachagani por sus útiles comentarios, sugerencias y compartir sus protocolos. Este trabajo fue apoyado por U01CA111294 subvención y un premio de desarrollo de la idea del Programa de Investigación Intramural la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
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