Introduction
Isolement de l'ARN avec une haute intégrité est nécessaire pour des expériences de biologie moléculaire de routine telles que le nord-blot 9, qRT-PCR 1 ou profils d'expression génique 5. La plupart des méthodes contemporaines de l'isolement de l'ARN sont fondées sur des modifications des protocoles de thiocyanate de guanidine 2, 3. Guanidine thiocyanate est un dénaturant de protéines forte et efficace de perturber l'activité de la ribonucléase dans la plupart des conditions. La méthode populaire de Chomczynski et Sacchi 3 phénol combiné à la solution de thiocyanate de guanidine de lyse, ce qui réduit le temps d'isolement à environ 4 heures. Disponibles dans le commerce de nombreux réactifs d'extraction d'ARN sont basées sur la méthode de Chomczynski et Sacchi 3.
Ribonucléase tissus riches comme humain ou de souris pancréas présente un défi supplémentaire pour isoler l'ARN. Pancréas de souris peut contenir jusqu'à 75 mg de ribonucléase 6 dont certains seront publiés During perturbation du tissu pancréatique résultant en l'autolyse des tissus. Des modifications des protocoles guanidine thiocyanate ont été utilisés avec succès pour isoler l'ARN à partir du pancréas avec une grande intégrité de 2, 4, 7, 10. Infusion d'ARN réactif de stabilisation dans le pancréas de souris isolement facilité de l'ARN avec une haute intégrité 4, 7, 10, cependant infusion de solutions dans le pancréas nécessite une grande habileté, peuvent nécessiter des instruments spécialisés, tels que un microscope à dissection et une rupture de l'architecture des tissus au cours de la procédure peut se traduire par la lyse cellulaire. Tissu perfusion avec le réactif de stabilisation de l'ARN pourrait interférer avec d'autres applications, y compris l'isolement des protéines et coloration histologique. De plus, cette technique n'est pas adaptée pour isoler l'ARN à partir de pancréas humain. D'autres protocoles nécessitent la préparation de solutions spécifiques par l'enquêteur 2.
Nous rapportons un protocole pour isoler l'ARN avec une haute intégrité du pancréas de souris. Thprotocole e utilise des éléments de méthodes déjà publiées et repose en grande partie sur les protocoles réactifs standards phénol / guanidine thiocyanate base-lyse. Il ne nécessite pas la préparation de solutions spécialisées et ne nécessite pas la perfusion de réactifs dans le pancréas. Les étapes critiques pour l'isolement de l'ARN avec succès comprennent un phénol / à base de guanidine réactif de lyse rapport élevé de tissu, des prélèvements de tissus non digérée avant la séparation de phase et l'inclusion d'un inhibiteur de ribonucléase à la solution d'ARN résultant. Utilisation de ceux-ci et d'autres modifications, on isole l'ARN avec RIN typiquement supérieur à 7 à utiliser en routine analyse de l'expression génique.
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Protocol
1. Préparation
Les pratiques suivantes adhèrent aux politiques établies par soin et l'utilisation des animaux Comité de l'institution (IACUC).
- Il est recommandé d'isoler pas plus de 6 pancréas de souris en un jour donné. Vous avez tous les instruments chirurgicaux propres et autoclave, un jeu par animal.
- Étiqueter tous les microtubes. Quatre tubes de 2 ml par animal.
- Placer 8 ml de réactif de lyse dans 50 ml tubes de centrifugation sur la glace. Remarque: Bien que le kit de purification est livré avec un réactif au phénol de thiocyanate de guanidine qui est approprié pour l'isolement du pancréas, le réactif de lyse est employé en raison de l'importance des volumes qui sont nécessaires pour l'isolation.
- Distribuer environ 10 ml des solutions suivantes dans 15 ml tubes de centrifugation pour nettoyer les pales de l'homogénéisateur. L'éthanol, 70% (2 tubes), de l'eau de qualité HPLC (1 tube) et de l'eau de qualité HPLC contenant environ 200 pi de RNase extérieur ou ribonucléase inactivator équivalent. 2. Chirurgie, Pancréas Dissection et homogénéisation
- Placez 1-2 ml d'isoflurane dans un bocal contenant gaze de coton ou du papier absorbant. Les souris sont placées sur une plate-forme qui les empêche d'atteindre la source de l'isoflurane. Ajouter isoflurane frais dans le pot avant d'anesthésier chaque souris.
- Placez délicatement la souris dans le bocal contenant la isoflurane. Boucher le pot et surveiller les effets de l'anesthésie en tournant doucement le pot avant et en arrière. L'animal est anesthésié une fois qu'il est dans l'incapacité de se tenir dans sa 'propre.
- Pour confirmation de l'anesthésie, enlever l'animal de la jarre et appliquer un pincement de l'orteil entreprise. Si la souris ne réagit pas au pincement de l'orteil, passez à l'étape 2.5.
- Si la souris réagit au pincement de l'orteil, puis répétez les étapes 2.2 à 2.3.
- Placez l'animal anesthésié sur la paillasse en position couchée. Disloquer le col de la souris en plaçant bien la main gauche sur le col de la souris. Noustion de la main droite saisir la queue de la souris et rapidement tirer vers le haut à un angle d'environ 45 ° à disloquer le col de l'utérus.
- Fixer la carcasse à une surface (un morceau de mousse de polystyrène recouvert de niveau avec des serviettes en papier) en perçant chacun des quatre pattes de l'animal dans la surface plane en utilisant jauge 25 aiguilles hypodermiques.
- Utilisation d'instruments chirurgicaux stériles, couper la partie centrale de la souris et retirez le pancréas de la souris rapidement. Utilisez la pince pour tenir le pancréas et le couper de la rate et l'intestin grêle avec des ciseaux à ressort. Veillez à ne pas étirer le pancréas lors de l'enlèvement de la souris. Perturbation des tissus pourrait libérer ribonucléase. Remarque: Le temps qu'il faut pour éliminer le pancréas de la souris est indispensable. Un homme du métier devrait être capable de disséquer le pancréas en environ 1 min ou moins.
- Placer l'ensemble du pancréas dans un tube de 50 ml contenant 8 ml de glace froid réactif de lyse. Boucher le tube et agiter brièvement à plonger le tiuestion dans le réactif et passer à l'étape suivante sans retard. Le rapport de réactif de lyse de tissu est critique. Voir la section des résultats d'une comparaison de l'intégrité de l'ARN isolé en utilisant différents volumes de réactif de lyse.
- Homogénéiser pendant 5 sec. Il est important de presser les lames d'homogénéisation au fond du tube de centrifugation pour permettre au tissu d'être tiré dans les pales d'homogénéisation efficace.
- Transférer 2 ml de réactif de lyse contenant du pancréas lysées à un tube de microcentrifugation de 2 ml. Recueillir deux microtubes d'homogénat par l'isolement. Jeter le broyat ou magasin restant à -80 ° C pour de futures études.
- Centrifuge à 4 ° C, 12 000 g pendant 5 min pour sédimenter les tissus non digérés. Il s'agit d'une étape essentielle dans le report des tissus non digérés dans les solutions suivantes de l'ARN sera probablement contaminer l'échantillon avec la ribonucléase (étape 5.13).
- Transfert 1 ml du surnageant dans un tube de 2 ml à centrifuger. Procéder à l'isolement immédiatement et stocker le tube répliqué à -80 ° C pour une utilisation future. Placer tous les tubes contenant homogénat sur de la glace tout en procédant à l'étape suivante.
- Éliminer le réactif de lyse restant dans un réceptacle de déchets chimique approprié.
- Avant de passer à la prochaine isolement, nettoyer les pales du homogénéisation en les plaçant dans 10 ml d'éthanol à 70%. Activez l'homogénéisation pendant environ 20 secondes pour enlever les morceaux de tissu qui peut être pris dans les pales.
- Utiliser un embout de pipette 200 ul à enlever tous les morceaux qui restent dans les lames de homogénéisation. Répétez l'étape 4.1 dans l'eau, inactivator général RNase et 70% d'éthanol. Sécher l'arbre d'homogénéisation avec un chiffon propre Kim.
- Répétez l'étape 2.1 pour l'isolement du pancréas des animaux restants, ARN garder isolés les uns séparés des animaux plutôt que la mise en commun de l'ARN.
- Si vous utilisez une solution de broyât congelé, décongeler sur la glace humide et laisser reposer à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 200 ul de chloroforme, boucher le tube et agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 2-3 min.
- Centrifuger pendant 15 min à 12 000 xg, 4 ° C.
- Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube à centrifuger. Ajouter 1,5 volume d'isopropanol et mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
- Transférer jusqu'à 700 ul de l'échantillon dans une colonne de centrifugation qui est placé dans un tube de collecte de 2 ml. Fermez le couvercle et centrifuger à 8000 g pendant 15 sec à température ambiante.
- Jeter l'effluent à travers.
- Répéter les étapes 5.5 à 5.6, en utilisant le reste de l'échantillon.
- Ajouter 700 ul de tampon RTT à la colonne. Centrifuger pendant 15 s à 8000 x g. Jeter l'effluent à travers.
- Déposer 500 pi de tampon RPE dans la colonne. Centrifuger pendant 15 secondes à 8000 x g pour laver la colonne. Jeter l'effluent à travers.
- Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne. Centrifuger pendant 2 min à 8000 xg pour sécher la colonne.
- Transférer la colonne de centrifugation dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Pipette 80 pi d'eau libre ribonucléase directement sur la membrane de la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 8000 x g pour éluer l'ARN.
- Ajouter un inhibiteur de la RNase 1 ul de la solution d'ARN. Stocker à -80 ° C ou procéder à 5.13.
- Pour valider l'intégrité de l'ARN, d'abord calculer la conce ARNntration et 260/280 taux à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Diluer une partie de la solution d'ARN à environ 500 ng / ul avec de l'eau de qualité biologie moléculaire.
- Déterminer l'ARN intégrité (c'est-à-RIN) en utilisant une analyse par électrophorèse capillaire. Environ 5 ul de solution d'ARN est suffisante pour l'analyse.
- Aliquoter la solution d'ARN (voir la figure 2) et conserver à -80 ° C.
3. L'élimination des tissus non digérés
Note: Après l'homogénéisation, de petits morceaux de tissu restent dans le réactif de lyse. Il est plus important pour lyser rapidement le tissu en laissant un peu de tissu non digéré plutôt que sur l'homogénéisation et la dégradation des risques de l'ARN.
4. Nettoyage des lames Homogénéisateur
5. RNA
La section suivante est identique au protocole de la trousse de purification. L'avantage du kit de purification, c'est qu'il va isoler l'ARN total, y compris les petits ARN.
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Representative Results
Le rendement total de l'ARN à partir de 1 ml d'homogénat de lyse est de 20 à 40 ug. DO 260/280 ratios sont généralement autour de 2,0 et le RIN sont constamment supérieur à 7,0. Si le RIN est ≤ 6, l'isolement devra être répétée. De temps en temps, un RIN qui est supérieure à 8,0 est atteint.
Les deux méthodes les plus couramment utilisées pour euthanasier les souris avant le retrait du pancréas sont le CO 2 asphyxie ou par inhalation d'isoflurane. Les deux techniques sont suivies par dislocation cervicale. Comme il est possible que le temps de l'agent et / ou de la procédure chimique peut influencer l'intégrité de l'ARN, le RIN d'ARN pancréatique de souris isolés en utilisant les deux techniques ont été comparées. Les souris ont été anesthésiés en utilisant du CO 2 asphyxie ou par inhalation d'isoflurane; les deux techniques ont été suivis par dislocation cervicale. La durée de l'anesthésie de l'animal avant la dislocation cervicale a été d'environ 1 à 2 min plus pour le CO 2 par rapport à l'asphyxie isoflurane. ARN isolé suite à l'inhalation d'isoflurane produit un RIN de 7,5 ± 0,31 par rapport à un RIN de 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, moyenne ± écart-type, en triple isolements) pour le CO 2 asphyxie. La méthode d'euthanasie a un impact dramatique sur l'intégrité de l'ARN et la technique d'inhalation isoflurane est préférable de CO 2 asphyxie.
L'intégrité de l'ARN isolé à partir de pancréas de souris qui ont été homogénéisés dans 2, 4 et 8 ml de réactif de lyse ont été comparés. Nous émettons l'hypothèse que l'augmentation du volume de réactif de lyse va conduire à un plus grand degré d'inactivation de la ribonucléase. Autre que le volume de réactif de lyse, toutes les conditions étaient identiques à celles figurant dans le protocole. Il existe une corrélation directe entre le volume de réactif de lyse utilisé dans l'homogénéisation et l'intégrité de l'ARN (Figure 1). Le RIN de l'ARN isolé en utilisant 2, 4 et 8 ml de réactif de lyse était de 4,2, 6,5 et 7,4, respectivement (moyenne, trois exemplaires estolations). Par conséquent 8 ml de réactif de lyse doivent être utilisés dans ce protocole.
Pour certaines expériences, il peut être nécessaire de collecter à la fois l'ARN et de protéines à partir de la même pancréas. Par exemple, l'ARN peut être utilisé pour la qRT-PCR et la protéine peut être visualisée par immunohistochimie. Si tel est le cas, il est recommandé de couper le pancréas dans la moitié de la tête à la queue. Ceci est important car le pancréas diffère anatomiquement de la tête à la queue. Pour démontrer si des différences dans l'intégrité de l'ARN existe entre l'ARN isolé à partir de chaque moitié du pancréas, l'expérience suivante a été effectuée. L'ARN a été isolé à partir de la première moitié du pancréas. Le RIN déterminée à partir de cet ARN a été comparée à celle de l'ARN isolé à partir de la seconde moitié du pancréas après qu'il s'est assis à température ambiante pendant environ 30 secondes lors du bilan de la moitié initiale. Le RIN pour la moitié initiale de pancréas était de 7,4 ± 0,20 par rapport à un RIN de 6,9 ± 0,55 pour la moitié postérieure. Tout en réduisant le pancréas dans lede cette manière ne semble pas relâcher la ribonucléase et la digestion de l'ARN, si le pancréas doit être sectionné, il est recommandé d'utiliser la première moitié pour l'analyse de l'ARN et de la seconde moitié de la protéine.
réactif de lyse perturbe la structure des protéines et réduit par conséquent l'activité de la ribonucléase. En raison de la grande quantité de ribonucléase qui est présente dans le pancréas, il est possible que certains ribonucléase actif reste dans l'homogénat de lyse et cette ribonucléase va s'équilibrer à la phase aqueuse. Toute ribonucléase qui reste dans la dernière solution d'ARN va entraver l'intégrité. Pour surmonter ce problème, nous avons ajouté un inhibiteur de la ribonucléase dans la solution aqueuse de l'ARN. L'intégrité de l'ARN a été comparé à partir d'une solution d'ARN qui contient un inhibiteur de ribonucléase à celui qui ne l'a pas. Après un dégel de gel, le RIN pour la solution de l'ARN avec un inhibiteur était de 7,3 ± 0,15 contre 2,9 ± 0,65 (Figure 2, p <0,001, moyenne ± écart-type, en triple isolements) pour lasolution qui ne contient pas d'inhibiteur. Un autre problème est la possibilité que répète la décongélation sera dénaturer la ribonucléase inhibiteur rendre inefficace. Pour examiner cette possibilité, une solution d'inhibiteur de ribonucléase de l'ARN contenant a été congelé et décongelé plusieurs fois. Les solutions d'ARN qui ont été congelés et décongelés jusqu'à 5 fois produites encore un RIN de 7 ou plus tandis que les solutions qui ont été congelés et décongelés 6 fois ou plus ont produit un RIN inférieur à 7 (figure 2). Il est recommandé d'aliquoter la solution d'ARN avant la congélation et de limiter le nombre de cycles de gel-dégel.
Pour démontrer l'utilité de cette méthode, nous avons effectué qRT-PCR sur l'ARN isolé. La moyenne de RIN isolations d'ARN triple était de 7,4 ± 0,20 (moyenne ± écart-type). ADNc à amorçage aléatoire a été synthétisé à partir de l'ARN et l'expression de trois gènes domestiques a été mesurée par PCR quantitative en utilisant des techniques standard. Les données présentées dans la figure 3 Validenotre capacité à utiliser avec succès l'ARN du pancréas de la souris dans une technique de biologie moléculaire standard.
Figure 1. Haute lyse réactif ratio du tissu améliore l'intégrité de l'ARN. L'intégrité de l'ARN isolé à partir de pancréas de souris qui a été homogénéisé en deux (A, D), 4 (B, E) ou 8 (C, F) ml de réactif de lyse était comparaison. Autre que le volume de réactif de lyse, toutes les conditions sont identiques à celles dans le protocole décrit dans le présent mémoire. Une corrélation directe existe entre le volume de réactif de lyse utilisé dans l'intégrité de l'homogénéisation et de l'ARN. (G) Moyenne ± SD, les isolations en triple. p <0,05, ** p <0,001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandede ce chiffre.
Figure 2. Dégrade l'ARN par la suite lors de la décongélation répétées de congélation. L'ARN isolé à partir de pancréas de souris a été congelé et décongelé plusieurs fois en présence ou en absence d'inhibiteur de la ribonucléase (RNase I). Moyenne ± SEM, ** p <0,001.
Figure 3. QRT-PCR de l'ARN du pancréas de souris. ARN a été isolé à partir de trois de pancréas de souris en utilisant le protocole optimisé. L'expression de l'ARNr 18S, β-2 microglobuline et snoRNA251 été déterminée en utilisant la qRT-PCR (moyenne ± SD).
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Discussion
Isolement de l'ARN à partir de tissus qui sont ribonucléase riche représente un grand défi pour les expériences de biologie moléculaire. Différents réactifs et des kits sont disponibles dans le commerce qui sont principalement basées sur la méthode phénol thiocyanate de guanidine de l'extraction de l'ARN. Le thiocyanate de guanidine dénature les protéines et réduit l'activité de la ribonucléase ainsi. Toutefois, l'ampleur de la ribonucléase dans le pancréas nécessite des modifications supplémentaires à des protocoles standard de l'isolement de l'ARN. Un protocole est rapporté ici qui est basé sur la méthode de thiocyanate de guanidine norme contient encore plusieurs modifications essentielles ainsi que des conseils pour l'isolement succès de l'ARN à partir de tissus ribonucléase riches tels que le pancréas.
Les directives standard pour isoler l'ARN sont à noter. Ces techniques sont essentielles à l'isolement de l'ARN succès, même à partir d'échantillons qui sont moins riches que la ribonucléase pancréas. Quelques exemples incluent l'utilisation de wa de qualité de biologie moléculaireter, consommables libre ribonucléase-et articles en plastique jetable plutôt que le verre. Il est recommandé de changer de gants entre chaque isolement. Pour quelqu'un qui est inexpérimenté avec isolement de l'ARN, il est recommandé qu'ils acquièrent de l'expérience avec isolement de l'ARN à partir d'échantillons de ribonucléase pauvres tels que le foie ou de cultures cellulaires avant de se lancer dans un travail qui nécessite l'isolement de l'ARN à partir de pancréas. Excellents protocoles existent qui offrent une variété de points pour travailler efficacement avec les ARN 8.
Plusieurs facteurs importants pour isoler l'ARN avec une haute intégrité du pancréas de souris sont rapportés ici. Ceux-ci comprennent le volume de réactif de lyse utilisé au cours de l'homogénéisation et l'inclusion d'un inhibiteur de la ribonucléase dans la solution d'ARN. La méthode d'inclure l'inhibiteur de ribonucléase fonctionne bien, mais les cycles répétés de congélation décongélation finiront par réduire le RIN, probablement due à la dénaturation de l'inhibiteur de la ribonucléase. Il convient de noter que toutes les solutions d'ARN used dans cette étude est passé par un dégel du gel avant la détermination du RIN. Un autre procédé de réduction de la dégradation sur gel dégel est de stocker la solution d'ARN à -20 ° C sous une forme précipitée 2. Ceci offre des inconvénients à savoir la suppression de l'éthanol et re-dissolution du culot avant l'utilisation de l'ARN. Par rapport aux protocoles de réactif thiocyanate de phénol / 2 de la guanidine, les avantages du protocole rapporté ici est la simplicité de travailler avec le réactif de lyse et le kit de purification qui ne nécessite pas de préparation des solutions et des tampons spécialisés. Il convient également de noter que ce protocole a été utilisé avec succès pour isoler des petits ARN à partir du pancréas de souris.
Conseils supplémentaires comprennent la vitesse de pancréas dissection et la méthode d'anesthésie avant l'euthanasie (isoflurane inhalation est préférable de CO 2 asphyxie). Plusieurs tentatives de pratiquer la chirurgie du pancréas sont recommandées avant l'anticipation de haute quality ARN. Adaptation de ce protocole de tissus ribonucléase riches tels que la rate ou les poumons devrait être facilement réalisable.
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Acknowledgments
Nous remercions Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo et Satyanarayana Rachagani pour leurs commentaires utiles, des suggestions et le partage de leurs protocoles. Ce travail a été soutenu par U01CA111294 de subvention et un prix Idée de développement du Programme de recherche intra-muros Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
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