Introduction
उच्च निष्ठा के साथ शाही सेना के अलगाव ऐसे उत्तरी सोख्ता 9, QRT-पीसीआर 1 या 5 रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति के रूप में नियमित आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए आवश्यक है. शाही सेना अलगाव की सबसे समकालीन तरीकों guanidine thiocyanate प्रोटोकॉल 2, के संशोधनों पर आधारित हैं 3. Guanidine thiocyanate एक मजबूत प्रोटीन विकृतिकरण करने वाला साधन है और प्रभावी रूप से सबसे परिस्थितियों में ribonuclease की गतिविधि को बाधित करेगा. Chomczynski और Sacchi 3 की लोकप्रिय विधि के बारे में 4 घंटे के लिए अलगाव समय को कम करने, guanidine thiocyanate lysis समाधान के लिए फिनोल संयुक्त. कई वाणिज्यिक उपलब्ध शाही सेना निकासी अभिकर्मकों Chomczynski और Sacchi विधि 3 पर आधारित हैं.
ऐसे मानव या माउस अग्न्याशय के रूप में ribonuclease अमीर ऊतकों शाही सेना को अलग करने के लिए एक अतिरिक्त चुनौती प्रस्तुत करता है. माउस अग्न्याशय, जिनमें से कुछ ड्यूरिन जारी किया जाएगा ribonuclease 6 की 75 मिलीग्राम शामिल कर सकते हैंजी ऊतक आत्म - विनाश में जिसके परिणामस्वरूप अग्नाशय के ऊतकों के विघटन. Guanidine thiocyanate प्रोटोकॉल के संशोधन सफलतापूर्वक उच्च अखंडता 2, 4, 7, 10 उच्च अखंडता 4, 7, 10 के साथ शाही सेना के माउस अग्न्याशय में मदद की अलगाव में शाही सेना स्थिरीकरण अभिकर्मक की. आसव, हालांकि निषेचन के साथ अग्न्याशय से शाही सेना को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है अग्न्याशय में समाधान, महान कौशल की आवश्यकता है इस तरह के एक विदारक माइक्रोस्कोप और प्रक्रिया के दौरान ऊतक वास्तुकला में खलल न डालें सेल में हो सकता है के रूप में विशेष उपकरणों की आवश्यकता हो सकती. आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्मक के साथ ऊतक perfusing प्रोटीन अलगाव और ऊतकीय धुंधला सहित अन्य अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक को मानव अग्न्याशय से शाही सेना को अलग करने के लिए उपयुक्त नहीं है. अन्य प्रोटोकॉल अन्वेषक 2 द्वारा विशिष्ट समाधान की तैयारी की आवश्यकता होती है.
हम माउस अग्न्याशय से उच्च निष्ठा के साथ शाही सेना को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट. गुई प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तरीकों के तत्वों का उपयोग करता है और बड़े पैमाने पर मानक फिनोल / guanidine thiocyanate आधारित सेल अभिकर्मक प्रोटोकॉल पर आधारित है. यह विशेष समाधान की तैयारी की आवश्यकता नहीं है और न ही यह अग्न्याशय में अभिकर्मकों के अर्क की आवश्यकता होती है. सफल शाही सेना अलगाव के लिए महत्वपूर्ण कदम ऊतक अनुपात, जिसके परिणामस्वरूप आरएनए समाधान के लिए जुदाई और एक ribonuclease अवरोध करनेवाला के शामिल किए जाने के चरण से पहले पचाया नहीं ऊतक को हटाने के लिए एक उच्च फिनोल / guanidine आधारित सेल अभिकर्मक शामिल हैं. इन और अन्य संशोधनों का उपयोग करना, हम आम तौर पर 7 से अधिक दिनचर्या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए प्रयोग की जाने वाली Rin के साथ शाही सेना को अलग.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. तैयारी
निम्नलिखित प्रथाओं इंस्टीट्यूशन पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा निर्धारित नीतियों का पालन करना.
- यह किसी भी दिन में कोई अधिक से अधिक 6 माउस pancreases को अलग करने की सिफारिश की है. स्वच्छ और autoclaved सभी शल्य चिकित्सा उपकरण, पशु प्रति एक सेट है.
- सभी microcentrifuge ट्यूबों लेबल. पशु प्रति चार 2 मिलीलीटर ट्यूबों.
- बर्फ पर 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सेल अभिकर्मक के 8 एमएल रखें. नोट: शुद्धि किट अग्न्याशय अलगाव के लिए उपयुक्त है कि एक guanidine thiocyanate फिनोल अभिकर्मक के साथ आता है, lysis अभिकर्मक क्योंकि अलगाव प्रति आवश्यक हैं कि बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है.
- Homogenizer के ब्लेड की सफाई के लिए 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में निम्नलिखित समाधान के बारे में 10 मिलीलीटर बांटना. इथेनॉल, 70% (2 ट्यूब), HPLC ग्रेड पानी (1 ट्यूब) और लगभग 200 RNase के μl दूर या समकक्ष ribonuclease निष्क्रियकर युक्त HPLC ग्रेड पानी. 2. सर्जरी, अग्न्याशय विच्छेदन और Homogenization
- कपास धुंध या कागज तौलिए से युक्त एक जार में isoflurane के 1-2 एमएल रखें. चूहे isoflurane के स्रोत तक पहुंचने से रोकता है कि एक मंच पर रखा जाता है. पहले प्रत्येक माउस anesthetizing को जार करने के लिए नए सिरे से isoflurane जोड़ें.
- धीरे isoflurane युक्त जार में माउस जगह. जार कैप और धीरे आगे पीछे जार घूर्णन द्वारा संज्ञाहरण के प्रभाव की निगरानी. यह 'अपने दम में खड़ा करने में असमर्थ है एक बार पशु anesthetized है.
- संज्ञाहरण की पुष्टि के लिए, जार से पशु हटाने और एक फर्म पैर के अंगूठे चुटकी लागू होते हैं. माउस पैर के अंगूठे चुटकी पर प्रतिक्रिया नहीं करता है, 2.5 कदम आगे बढ़ना.
- माउस पैर के अंगूठे चुटकी के प्रति प्रतिक्रिया करता है, तो कदम 2.2-2.3 दोहराएँ.
- प्रवण स्थिति में बेंच शीर्ष पर anesthetized पशु रखें. कसकर माउस के गर्भाशय ग्रीवा पर बाएं हाथ रखकर माउस के गर्भाशय ग्रीवा हटाना. हमेंदाहिने हाथ माउस पूंछ समझ और जल्दी से ग्रीवा भंग करने पर लगभग ऊपर की तरफ एक 45 डिग्री के कोण खींच रही है.
- 25 गेज चमड़े के नीचे सुई का उपयोग सपाट सतह में जानवर की चार पंजे का प्रत्येक भेदी द्वारा एक सतह (कागज तौलिये के साथ कवर स्टायरोफोम के एक स्तर टुकड़ा) के लिए शव को सुरक्षित करो.
- खुले माउस के midsection में कटौती और जल्दी से माउस से अग्न्याशय हटाने, बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करना. अग्न्याशय पकड़ और वसंत कैंची का उपयोग तिल्ली और छोटी आंत से यह कटौती संदंश का प्रयोग करें. माउस से हटाने के दौरान अग्न्याशय फैलाने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. ऊतक के विघटन ribonuclease जारी कर सकता. नोट: यह माउस से अग्न्याशय को दूर करने के लिए लगने वाले समय महत्वपूर्ण है. एक कुशल व्यक्ति के बारे में 1 मिनट या उससे कम समय में अग्न्याशय काटना करने में सक्षम होना चाहिए.
- बर्फ के ठंडे सेल अभिकर्मक के 8 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पूरे अग्न्याशय रखें. ट्यूब टोपी और संक्षेप में तिवारी को विसर्जित करने के लिए हिलाअभिकर्मक में ssue और बिना किसी देरी के अगले चरण पर जाएँ. ऊतक को सेल अभिकर्मक के अनुपात महत्वपूर्ण है. सेल अभिकर्मक के विभिन्न संस्करणों का उपयोग कर अलग आरएनए अखंडता की तुलना के लिए परिणाम अनुभाग देखें.
- 5 सेकंड के लिए homogenize. यह ऊतक कुशल homogenization के लिए ब्लेड में खींच लिया जा करने की अनुमति के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे homogenizer ब्लेड प्रेस करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- स्थानांतरण एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब lysed अग्न्याशय युक्त lysis अभिकर्मक के 2 मिलीलीटर. अलगाव प्रति homogenate के दो microcentrifuge ट्यूबों लीजिए. भविष्य के अध्ययन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष homogenate या दुकान त्यागें.
- शत4 डिग्री सेल्सियस, पचाया नहीं ऊतक गोली 5 मिनट के लिए 12,000 × छ पर rifuge. यह संभावना ribonuclease (कदम 5.13) के साथ नमूना दूषित होगा आरएनए के बाद समाधान में पचाया नहीं ऊतक का भार के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम है.
- एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर. तुरंत अलगाव के साथ आगे बढ़ें और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दोहराने ट्यूब की दुकान. अगले कदम के लिए आगे बढ़ने जबकि गीला बर्फ पर homogenate युक्त ट्यूबों रखें.
- एक उपयुक्त रासायनिक कचरे के गोदाम में शेष सेल अभिकर्मक के निपटान के.
- अगले अलगाव के लिए आगे बढ़ने से पहले, 70% इथेनॉल के 10 एमएल में उन्हें रखने के द्वारा homogenizer ब्लेड साफ. ब्लेड में पकड़ा जा सकता है कि ऊतक के किसी भी मात्रा को दूर करने के लिए 20 सेकंड के लिए के बारे में के लिए homogenizer सक्रिय करें.
- Homogenizer ब्लेड में रहते हैं कि किसी भी टुकड़े को दूर करने के लिए एक 200 μl pipet टिप का उपयोग करें. पानी, सामान्य Rnase निष्क्रियकर और 70% इथेनॉल में कदम दोहराएँ 4.1. एक स्वच्छ किम के साथ homogenizer शाफ्ट मिटा सूखी.
- शेष जानवरों के अग्न्याशय अलगाव के लिए दोहराएँ कदम 2.1, बल्कि शाही सेना पूलिंग से प्रत्येक जानवर अलग से अलग रखते हुए आरएनए.
- जमे हुए homogenate समाधान का उपयोग करते हैं, तो 5 मिनट के लिए आरटी पर खड़े गीला बर्फ पर पिघलना और चलो.
- क्लोरोफॉर्म की 200 μl जोड़ें, ट्यूब टोपी और 15 सेकंड के लिए हाथ से सख्ती से हिला. ट्यूब 2-3 मिनट के लिए आरटी पर खड़े हैं.
- 12,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
- एक microcentrifuge ट्यूब में ऊपरी जलीय परत स्थानांतरण. Isopropanol के 1.5 मात्रा में जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting कई बार से अच्छी तरह मिक्स.
- 70 से ऊपर स्थानांतरणएक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा गया है कि एक स्पिन स्तंभ में नमूना के 0 μl. आरटी पर 15 सेकंड के लिए 8000 XG पर ढक्कन और अपकेंद्रित्र बंद करें.
- प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- दोहराएँ नमूना के शेष का उपयोग कर, 5.5-5.6 कदम.
- स्पिन स्तंभ के लिए 700 μl बफर RWT जोड़ें. 8000 x जी पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र. प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- स्पिन स्तंभ में pipet 500 μl बफर RPE. स्तंभ धोने के लिए 8000 XG पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र. प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- स्पिन स्तंभ के लिए 500 μl बफर RPE जोड़ें. स्तंभ सूखे के लिए 8000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्पिन स्तंभ स्थानांतरण. सीधे स्पिन स्तंभ झिल्ली पर pipet 80 μl ribonuclease मुक्त पानी. शाही सेना elute करने के लिए 8000 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- शाही सेना के समाधान के लिए 1 μl Rnase अवरोध करनेवाला जोड़ें. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या 5.13 के लिए आगे बढ़ें.
- शाही सेना की अखंडता को मान्य करने के लिए, पहली बार शाही सेना conce की गणनाएक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग ntration और 260/280 अनुपात.
- आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी के साथ लगभग 500 एनजी / μl को शाही सेना के समाधान के एक हिस्से को पतला.
- केशिका विश्लेषण का उपयोग आरएनए अखंडता (यानी, Rin) निर्धारित करते हैं. शाही सेना के समाधान के लगभग 5 μl विश्लेषण के लिए पर्याप्त है.
- सी. ° -80 में शाही सेना समाधान (देखें चित्र 2) और दुकान विभाज्य
पचाया नहीं ऊतक के 3. निकालना
नोट: homogenization के बाद, ऊतक के छोटे टुकड़े सेल अभिकर्मक में रहेगा. यह जल्दी homogenizing और आरएनए का खतरा गिरावट से अधिक के बजाय पचाया कुछ ऊतक छोड़ने ऊतक lyse करने के लिए अधिक महत्वपूर्ण है.
Homogenizer ब्लेड के 4. सफाई
5. शाही सेना अलगाव
निम्न खंड शुद्धि किट प्रोटोकॉल के समान है. शुद्धि किट का फायदा यह छोटे RNAs सहित कुल शाही सेना को अलग होगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सेल homogenate के 1 मिलीलीटर से कुल शाही सेना उपज 20-40 ग्राम है. आयुध डिपो 260/280 के अनुपात आम तौर पर लगभग 2.0 हैं और RIN 7.0 से लगातार अधिक से अधिक कर रहे हैं. RIN 6 ≤ जाता है, तो अलगाव दोहराया जा करने की आवश्यकता होगी. कभी कभी, 8.0 से अधिक है कि एक RIN हासिल की है.
पूर्व अग्न्याशय को हटाने के लिए चूहों euthanizing के दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों सीओ 2 asphyxiation या isoflurane की साँस लेना हैं. दोनों तकनीकों ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा कर रहे हैं. यह रासायनिक एजेंट और / या प्रक्रिया समय आरएनए अखंडता, दोनों तकनीकों की तुलना में था का उपयोग कर अलग माउस अग्नाशय शाही सेना के RIN प्रभावित हो सकता है कि संभव है के बाद से. चूहे सीओ 2 asphyxiation या isoflurane साँस लेना का उपयोग anesthetized थे; दोनों तकनीकों ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया गया था. पूर्व ग्रीवा अव्यवस्था के लिए जानवरों anesthetizing के समय isofl की तुलना में सीओ 2 asphyxiation के लिए लगभग 1-2 मिनट रह गया थाurane. Isoflurane की साँस लेना निम्नलिखित पृथक शाही सेना सीओ 2 asphyxiation के लिए 2.2 ± 0.3 का एक RIN (पी <10 -4, isolations तीसरीप्रति, एसडी ± मतलब है) की तुलना में 7.5 ± 0.31 की एक RIN उत्पादन किया. इच्छामृत्यु की विधि आरएनए अखंडता पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ता है और isoflurane साँस लेना की तकनीक 2 asphyxiation सीओ पसंद किया जाता है.
सेल अभिकर्मक के 2, 4 और 8 मिलीग्राम में homogenized गया कि माउस pancreases से अलग शाही सेना की अखंडता की तुलना में थे. हम सेल अभिकर्मक की मात्रा बढ़ रही है ribonuclease निष्क्रियता का एक बड़ा डिग्री करने के लिए नेतृत्व करेंगे धारणा है कि. सेल अभिकर्मक की मात्रा के अलावा, सभी शर्तों प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध उन लोगों के लिए समान थे. Homogenization और आरएनए अखंडता (चित्रा 1) में इस्तेमाल सेल अभिकर्मक की मात्रा के बीच एक सीधा संबंध था. शाही सेना के RIN सेल अभिकर्मक के 2, 4 और 8 मिलीग्राम क्रमश: 4.2, 6.5 और 7.4, (मतलब था, तीन प्रतियों है का उपयोग कर अलगolations). इसलिए सेल अभिकर्मक के 8 एमएल इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
कुछ प्रयोगों के लिए, यह एक ही अग्न्याशय से शाही सेना और प्रोटीन दोनों को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हो सकता है. उदाहरण के लिए, आरएनए QRT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रोटीन immunohistochemistry का उपयोग कल्पना की जा सकती है. यदि यह मामला है, यह पूंछ को सिर से आधे में अग्न्याशय में कटौती करने की सिफारिश की है. अग्न्याशय सिर से पूंछ के anatomically अलग है क्योंकि यह महत्वपूर्ण है. शाही सेना अखंडता में कोई मतभेद अग्न्याशय के आधे या तो से अलग शाही सेना के बीच मौजूद है को प्रदर्शित करने के लिए निम्न प्रयोग किया गया था. शाही सेना अग्न्याशय की पहली छमाही से अलग किया गया था. RIN इस शाही सेना से निर्धारित यह प्रारंभिक छमाही के workup के दौरान के बारे में 30 सेकंड के लिए आरटी पर बैठ जाने के बाद अग्न्याशय की दूसरी छमाही से अलग शाही सेना की तुलना में किया गया था. अग्न्याशय के प्रारंभिक छमाही के लिए RIN बाद आधे के लिए 6.9 ± 0.55 की एक RIN की तुलना में 7.4 ± 0.20 था. में अग्न्याशय जबकि काटनेइस तरह से अग्न्याशय sectioned किया जा रहा है, यह आरएनए विश्लेषण और प्रोटीन के लिए दूसरी छमाही के लिए पहली छमाही के इस्तेमाल की सिफारिश की है, ribonuclease और शाही सेना के पाचन जारी करने के लिए प्रकट नहीं होता.
Lysis अभिकर्मक प्रोटीन संरचना को बाधित और इसलिए ribonuclease गतिविधि कम कर देता है. कारण अग्न्याशय में मौजूद है कि ribonuclease की बड़ी राशि के लिए, यह कुछ सक्रिय ribonuclease सेल homogenate में बनी हुई है और इस ribonuclease जलीय चरण को संतुलित करना होगा कि संभव है. आखिरी शाही सेना समाधान में रहता है कि किसी भी ribonuclease अखंडता रोकना होगा. इस पर काबू पाने के लिए, हम शाही सेना के जलीय घोल को एक ribonuclease अवरोध करनेवाला गयी. शाही सेना अखंडता नहीं किया था कि एक को ribonuclease अवरोध करनेवाला निहित है कि एक शाही सेना समाधान से तुलना की गई. एक फ्रीज पिघलना पर, अवरोध करनेवाला के साथ शाही सेना के समाधान के लिए RIN के लिए (चित्रा 2, पी <0.001, isolations तीसरीप्रति, एसडी मतलब ±) 2.9 ± 0.65 की तुलना में 7.3 ± 0.15 थाअवरोध करनेवाला शामिल नहीं किया था कि समाधान. एक और मुद्दा फ्रीज विगलन अप्रभावी प्रतिपादन यह अवरोध करनेवाला ribonuclease denature जाएगा दोहराया कि संभावना है. इस संभावना की जांच करने के लिए, आरएनए युक्त ribonuclease अवरोध करनेवाला का एक समाधान के लिए बार बार जमे हुए और thawed किया गया था. जमे हुए और 6 बार या उच्च thawed थे कि उन समाधानों 7 नीचे एक RIN (चित्रा 2) का उत्पादन किया, जबकि जमे हुए और 5 गुना तक thawed गया है कि शाही सेना समाधान अभी भी 7 या उच्चतर की एक RIN उत्पादन किया. यह पिछले ठंड के लिए शाही सेना समाधान विभाज्य और फ्रीज पिघलना चक्र की संख्या को सीमित करने की सिफारिश की है.
इस विधि की उपयोगिता का प्रदर्शन, हम पृथक शाही सेना पर QRT-पीसीआर प्रदर्शन किया. तीन प्रतियों शाही सेना isolations से मतलब RIN 7.4 ± 0.20 था (मतलब ± एसडी). रैंडम primed सीडीएनए शाही सेना से संश्लेषित किया गया था और तीन हाउसकीपिंग जीनों की अभिव्यक्ति मानक तकनीक का उपयोग कर qPCR द्वारा मापा गया था. चित्रा 3 पुष्टि में दिखाया गया डेटासफलतापूर्वक एक मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक में माउस अग्नाशय शाही सेना का उपयोग करने के लिए हमारी क्षमता.
ऊतक अनुपात को चित्रा 1. उच्च सेल अभिकर्मक शाही सेना अखंडता को बेहतर बनाता है. 2 (ए, डी) में homogenized गया था कि माउस pancreases से अलग शाही सेना की अखंडता, 4 (बी, ई) या सेल अभिकर्मक के 8 (सी, एफ) मिलीलीटर था की तुलना में. सेल अभिकर्मक की मात्रा के अलावा, सभी शर्तों के साथ साथ प्रोटोकॉल में वर्णित में उन लोगों के लिए समान थे. एक सीधा संबंध homogenization और आरएनए अखंडता में इस्तेमाल सेल अभिकर्मक की मात्रा के बीच मौजूद है. (जी) मतलब ± एसडी, तीन प्रतियों isolations. पी <0.05, ** पी <0.001. देखने के लिए क्लिक करें एक बड़ा संस्करणइस आंकड़े की.
चित्रा 2. शाही सेना अंततः दोहराया फ्रीज विगलन पर degrades. माउस अग्न्याशय से अलग शाही सेना बार बार जमे हुए और ribonuclease अवरोध करनेवाला (RNase मैं) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में thawed किया गया था. ± SEM, ** पी <0.001 मतलब है.
चित्रा 3. माउस अग्नाशय शाही सेना के QRT-पीसीआर. आरएनए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग कर तीन माउस pancreases से अलग किया गया था. 18S rRNA, β-2 माइक्रोग्लोब्युलिन और snoRNA251 की अभिव्यक्ति QRT-पीसीआर (मतलब ± एसडी) का उपयोग निर्धारित किया गया था.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अमीर ribonuclease रहे हैं कि ऊतकों से शाही सेना को अलग आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है. विभिन्न अभिकर्मकों और किट मुख्य रूप से शाही सेना निकासी की फिनोल guanidine thiocyanate विधि पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आधारित हैं कर रहे हैं. Guanidine thiocyanate प्रोटीन denatures और इस तरह ribonuclease की गतिविधि कम कर देता है. हालांकि, अग्न्याशय में ribonuclease की सरासर परिमाण शाही सेना अलगाव की मानक प्रोटोकॉल के लिए अतिरिक्त संशोधनों की आवश्यकता है. एक प्रोटोकॉल मानक guanidine thiocyanate पद्धति पर आधारित है कि यहां बताया गया है अभी तक इस तरह के अग्न्याशय के रूप में ribonuclease अमीर ऊतकों से शाही सेना के सफल अलगाव के लिए कई महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ ही सुझाव शामिल हैं.
शाही सेना को अलग करने के लिए मानक दिशा निर्देशों का उल्लेख किया जा रहे हैं. इन तकनीकों में भी कम ribonuclease युक्त अग्न्याशय से कर रहे हैं कि नमूनों से, शाही सेना के सफल अलगाव के लिए महत्वपूर्ण हैं. कुछ उदाहरण आणविक जीव विज्ञान ग्रेड वा का उपयोग शामिल हैआतंकवाद, ribonuclease मुक्त उपभोग्य और नहीं बल्कि कांच की तुलना में डिस्पोजेबल प्लास्टिक के बर्तन. यह प्रत्येक अलगाव के बीच में दस्ताने बदलने की सिफारिश की है. शाही सेना को अलग करने के साथ अनुभवहीन है किसी के लिए, यह है कि वे पिछले अग्न्याशय से शाही सेना को अलग करने की आवश्यकता है कि काम पर तैयार करने के लिए इस तरह के जिगर के रूप में ribonuclease गरीब नमूने से या सेल संस्कृतियों से शाही सेना को अलग करने के साथ अनुभव हासिल की सिफारिश की है. बहुत बढ़िया प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक आरएनए 8 के साथ काम करने के लिए अंक की एक किस्म है कि प्रस्ताव में मौजूद हैं.
माउस अग्न्याशय से उच्च निष्ठा के साथ शाही सेना को अलग करने के लिए कई महत्वपूर्ण कारकों यहाँ रिपोर्ट कर रहे हैं. ये homogenization के दौरान इस्तेमाल सेल अभिकर्मक की मात्रा और शाही सेना के समाधान के लिए एक ribonuclease अवरोध करनेवाला का समावेश शामिल हैं. ribonuclease अवरोध करनेवाला शामिल करने की विधि अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र की वजह से आखिरकार ribonuclease अवरोध करनेवाला denaturing की संभावना, Rin कम हो जाएगा. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी आरएनए समाधान USED इस अध्ययन में पिछले RIN निर्धारण के लिए एक फ्रीज पिघलना के माध्यम से चला गया. फ्रीज पिघलना पर गिरावट को कम करने का एक अन्य तरीका एक उपजी फॉर्म 2 में -20 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना समाधान की दुकान है. यह अर्थात् इथेनॉल हटाने और पूर्व शाही सेना का उपयोग करने के लिए गोली फिर से भंग कुछ असुविधाओं प्रदान करता है. फिनोल / guanidine thiocyanate अभिकर्मक प्रोटोकॉल 2 की तुलना में, प्रोटोकॉल के फायदे यहां बताया lysis अभिकर्मक और विशेष समाधान और buffers की तैयारी की आवश्यकता नहीं है कि शुद्धि किट के साथ काम करने की सादगी है. यह भी इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक माउस अग्न्याशय से छोटे RNAs अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.
अतिरिक्त युक्तियाँ अग्न्याशय विच्छेदन की गति और पूर्व इच्छामृत्यु (isoflurane साँस लेना 2 asphyxiation सीओ पसंद किया जाता है) के लिए संज्ञाहरण की विधि में शामिल हैं. अग्न्याशय सर्जरी अभ्यास में कई प्रयासों के उच्च quali की आशंका पहले की सिफारिश कर रहे हैंTy आरएनए. ऐसे तिल्ली या फेफड़ों के रूप में ribonuclease युक्त ऊतकों को इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन आसानी से प्राप्त किया जाना चाहिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम उनके सहायक टिप्पणियां, सुझाव और उनके प्रोटोकॉल के बंटवारे के लिए Jianhua लिंग, रेमंड मैकडोनाल्ड, Galvin स्विफ्ट, मिशेल ग्रिफिन, पॉल Grippo और सत्यनारायण Rachagani धन्यवाद. इस काम अनुदान U01CA111294 और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम से एक आइडिया विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
