RNA Isolering från mus Pankreas: En Ribonuclease rika Tissue

Introduction

Isolering av RNA med hög integritet som krävs för rutinmässiga molekylärbiologiska experiment som norra blotting ^9, QRT-PCR ¹ eller profilering av genuttryck ^5. De flesta moderna metoder för RNA-isolering är baserade på modifieringar av guanidintiocyanat protokoll ^{2, 3.} Guanidintiocyanat är ett starkt proteindenatureringsmedel och kommer att effektivt störa aktiviteten hos ribonukleas under de flesta förhållanden. Den populära metoden enligt Chomczynski och Sacchi ³ kombinerad fenol till guanidintiocyanat lyslösning, minska isoleringen gång till omkring 4 timmar. Många kommersiellt tillgängliga RNA-extraktions-reagensen är baserade på Chomczynski och Sacchi metod ^3.

Ribonukleas rika vävnader såsom människa eller mus bukspottkörteln är ytterligare en utmaning för att isolera RNA. Mus bukspottkörteln kan innehålla upp till 75 mg ribonukleas ⁶ varav några kommer att släppas During störningar i bukspottskörteln vävnad resulterar i vävnads autolys. Modifikationer av guanidintiocyanat protokollen har med framgång använts för att isolera RNA från pankreas med hög integritet ^{2, 4, 7, 10.} Infusion av RNA-stabilisering reagens i mus bukspottkörteln lättat isolering av RNA med hög integritet ^{4, 7, 10,} infusion emellertid av lösningar i bukspottkörteln kräver stor skicklighet, kan kräva särskilda instrument såsom en dissekera mikroskop och störa vävnadsarkitektur under förfarandet kan leda till cell-lys. Perfusion vävnad med RNA stabiliseringsreagens kan störa andra tillämpningar, inklusive proteinisolering och histologisk färgning. Dessutom är denna teknik inte lämpar sig för isolering av RNA från human pankreas. Andra protokoll kräver beredning av specifika lösningar av prövaren ^2.

Vi rapporterar ett protokoll för att isolera RNA med hög integritet från mus bukspottkörteln. The protokollet använder delar av tidigare publicerade metoder och bygger till stor del på de vanliga fenol / guanidintiocyanat baserade lyseringsreagenset protokoll. Det kräver inte beredning av specialiserade lösningar inte heller kräver infusion av reagens i bukspottkörteln. Kritiska steg för lyckad RNA isolering innefattar en hög fenol / guanidin-baserade lysisreagens till vävnadsförhållande, borttagning av osmält vävnad före fasseparation och införandet av en ribonukleasinhibitor till den resulterande RNA-lösningen. Med hjälp av dessa och andra modifieringar, isolerar vi vanligtvis RNA med RIN högre än 7 för att användas för rutin genuttrycksanalys.

Protocol

1. Förberedelse

Följande praxis följer den politik som fastställts av institutionens Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Det rekommenderas att isolera mer än 6 mus pancreases på en viss dag. Har alla kirurgiska instrument rena och autoklaveras, en uppsättning per djur.
2. Märk alla mikrorör. Fyra 2 ml rör per djur.
3. Placera 8 ml lyseringsreagens i 50 ml centrifugrör på is. OBS: Även om renings kit levereras med en guanidintiocyanat fenolreagens som är lämplig för bukspottkörtel isolering är lysisreagens används på grund av de stora volymer som behövs per isolering.
4. Fördela ca 10 ml av följande lösningar i 15 ml centrifugrör för rengöring homogeniseringsanordningen s blad. Etanol, 70% (2 rör), HPLC-kvalitet vatten (1 tub) och HPLC-kvalitet vatten som innehåller ca 200 l av RNas Borta eller motsvarande ribonukleas inaktive.
2. Kirurgi, Pancreas Dissektion och Homogenisering
1. Placera 1-2 ml isofluran i en burk som innehåller gasväv eller pappershanddukar. Möss placerades på en plattform, som förhindrar dem från att nå källan av isofluran. Lägg färsk isofluran i burken innan anesthetizing varje mus.
2. Placera försiktigt musen i burken innehåller isofluran. Förslut burken och övervaka effekterna av anestesi genom att försiktigt rotera burken fram och tillbaka. Djuret bedövades när det är i oförmögen att stå i sina "egna.
3. För bekräftelse av anestesi, ta bort djur från burken och applicera ett fast tå nypa. Om musen inte reagerar på tå nypa vidare till steg 2,5.
4. Om musen reagerar på tå nypa, upprepa steg från 2,2 till 2,3.
5. Placera sövda djuret på bänken topp liggande på mage. Ur led musens livmoderhalsen genom tätt placera vänster hand på musens livmoderhalsen. Usning den högra handen tag i musens svans och snabbt dra uppåt i ungefär 45 ° vinkel för att flytta ut livmoderhalsen.
6. Fäst stommen till en yta (en nivå bit frigolit täckt med hushållspapper) genom piercing varje djurets fyra tassar in i den plana ytan med hjälp av 25 gauge kanyler.
7. Använda sterila kirurgiska instrument, klippa midsection av musen öppet och snabbt ta bort bukspottkörteln från musen. Använd pincett för att hålla bukspottkörteln och klipp från mjälten och tunntarmen med hjälp av fjäder sax. Var noga med att inte sträcka bukspottkörteln under avlägsnandet från musen. Störningar av vävnaden skulle kunna frigöra ribonukleas. Anmärkning: Den tid det tar att ta bort bukspottkörteln från mus är kritisk. En fackman bör kunna dissekera bukspottkörteln i ca 1 min eller mindre.
8. Placera hela pankreas i ett 50 ml rör innehållande 8 ml iskall lyseringsreagens. Förslut röret och kort skaka att fördjupa den tissue i reagenset och gå vidare till nästa steg utan dröjsmål. Förhållandet av lysisreagens till vävnad är kritisk. Se avsnittet Resultat för en jämförelse av RNA integriteten isoleras med hjälp av olika volymer av lyseringsreagens.
9. Homogenisera under 5 sek. Det är viktigt för att trycka homogenisatorn bladen till botten av centrifugröret för att tillåta den vävnad som skall dras in i bladen för effektiv homogenisering.

3. Borttagning av Ospjälkad Tissue

Anmärkning: Efter homogenisering, kommer små bitar av vävnad kvar i lyseringsreagens. Det är viktigare att snabbt lysera vävnaden lämnar någon vävnad osmält istället över homogenisering och risk nedbrytning av RNA.

1. Överför 2 ml lyseringsreagens som innehåller de lyserade bukspottkörteln till en 2 ml mikrocentrifugrör. Samla två mikrorör av homogenatet per isolering. Kassera återstående homogenatet eller förvara vid -80 ° C för framtida studier.
2. Centrifuge vid 4 ° C, 12000 x g under 5 min för att pelletera osmält vävnad. Detta är ett kritiskt steg eftersom överföring av osmält vävnad in i efterföljande lösningar av RNA kommer sannolikt att förorena provet med ribonukleas (steg 5,13).
3. Överför 1 ml av supernatanten i en 2 ml mikrocentrifugrör. Fortsätt med isolering omedelbart och lagra replikat röret vid -80 ° C för framtida användning. Placera alla rör innehållande homogenatet på våt is medan man går vidare till nästa steg.
4. Kassera återstående lysisreagens till lämplig kemisk avfallsbehållare.

4. Rengöring av homogeniseraren Blades

1. Innan du fortsätter till nästa isolering, rengör homogeniseraren bladen genom att placera dem i 10 ml 70% etanol. Aktivera homogeniseraren i ca 20 sekunder för att ta bort alla bitar av vävnad som kan fångas upp av knivarna.
2. Använd en 200 | il pipettspetsen för att avlägsna eventuella bitar som finns kvar i homogenisatorn bladen. Upprepa steg 4,1 i vatten, general RNas inaktive och 70% etanol. Torka homogeniseringsblandare axeln med en ren Kim torka.
3. Upprepa steg 2.1 för bukspottkörteln isolering av de återstående djuren, hålla RNA isolerat från varje djur separat i stället för att slå samman RNA.

5. RNA-isolering

Följande avsnitt är identiskt med reningskit protokoll. Fördelen med reningen kit är att det kommer att isolera totalt RNA, inklusive små RNA.

1. Vid användning av frusen homogenatet lösning, tina på våt is och låt stå vid RT under 5 min.
2. Lägg till 200 l av kloroform, mössa röret och skaka kraftigt för hand i 15 sekunder. Låt röret stå vid RT i 2-3 min.
3. Centrifugera i 15 min vid 12000 x g, 4 ° C.
4. Överför den övre vattenhaltiga fasen till ett mikrocentrifugrör. Lägg till 1,5 volymer isopropanol och blandas noggrant genom pipettering upp och ned flera gånger.
5. Överför upp till 700 pl av provet i en spinnkolonn som är placerad i en 2 ml provrör. Stäng locket och centrifugera vid 8000 xg under 15 sek vid RT.
6. Kassera genomströmning.
7. Upprepa steg från 5,5 till 5,6, med användning av resten av provet.
8. Lägg till 700 l Buffer RWT till spinnkolonn. Centrifugera i 15 s vid 8000 X g. Kassera genomströmning.
9. Pipettera 500 l Buffer RPE in i spinnkolonn. Centrifugera i 15 s vid 8000 xg för att tvätta kolonnen. Kassera genomströmning.
10. Tillsätt 500 l buffert RPE till spinnkolonn. Centrifugera i 2 min vid 8000 xg för att torka kolonnen.
11. Överför spinnkolonn i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pipettera 80 pl ribonukleas fritt vatten direkt på spinnkolonn membranet. Centrifugera under 1 min vid 8000 x g för eluering av RNA.
12. Lägg 1 il RNas-inhibitor till RNA-lösningen. Förvara vid -80 ° C eller gå vidare till 5.13.
13. För att validera integriteten av RNA, först beräkna RNA concentration och 260/280 förhållandet med hjälp av en spektrofotometer.
14. Späd ut en del av RNA-lösning till ca 500 ng / ^ il med molekylärbiologisk kvalitet vatten.
15. Bestäm RNA Integrity (dvs. RIN) med hjälp av kapillärelektrofores analys. Ungefär 5 ul av RNA-lösning är tillräcklig för analysen.
16. Alikvotera RNA-lösning (se figur 2) och förvara vid -80 ° C.

Representative Results

Det totala RNA-utbytet från 1 ml av lys homogenatet är från 20 till 40 | ig. OD 260/280 nyckeltal är vanligtvis omkring 2,0 och RIN är genomgående högre än 7,0. Om RIN är ≤ 6, kommer isoleringen behöva upprepas. Ibland används en RIN som är högre än 8,0 uppnås.

De två vanligaste metoderna för euthanizing möss före avlägsnande av bukspottkörteln är CO ₂ kvävning och inandning av isofluran. Båda teknikerna följt av cervikal dislokation. Eftersom det är möjligt att det kemiska medlet och / eller tillvägagångssätttid kan påverka RNA integritet, RIN av mus bukspottskörteln RNA isoleras med hjälp av båda teknikerna jämfördes. Möss sövdes med hjälp av CO ₂ kvävning eller isofluran inandning; båda teknikerna följdes genom cervikal dislokation. Tiden för söva djuren före halsdislokation var cirka 1 till 2 minuter längre för CO ₂ kvävning jämfört med isoflurane. RNA isoleras efter inhalation av isofluran producerade en RIN av 7,5 ± 0,31 jämfört med en RIN av 2,2 ± 0,3 (p <10 ^-4, medelvärde ± SD, tredubbla isoleringar) för CO ₂ kvävning. Metoden för eutanasi har en dramatisk effekt på RNA integritet och tekniken med isofluran inhalation föredrages till _{CO2-kvävning.}

Integriteten hos RNA som isolerats från mus bukspottkörtlar som homogeniserades i 2, 4 och 8 ml av lysisreagens jämfördes. Vi antar att öka volymen av lysisreagens kommer att leda till en högre grad av ribonukleas inaktivering. Annat än volymen av lysisreagens, alla var identiska med de som anges i protokollet. Det fanns ett direkt samband mellan den mängd lys reagens som används i homogenisering och RNA integritet (Figur 1). RIN av RNA isoleras med hjälp av 2, 4 och 8 ml lyseringsreagens var 4,2, 6,5 och 7,4, respektive (menar, är tre exemplarolations). Därför 8 ml lyseringsreagens bör användas i detta protokoll.

För vissa försök kan det vara nödvändigt att samla in både RNA och protein från samma bukspottkörteln. Exempelvis kan RNA användas för QRT-PCR och protein kan visualiseras med användning av immunohistokemi. Om så är fallet, är det rekommenderat att skära bukspottkörteln i hälften från huvud till svans. Detta är viktigt eftersom bukspottkörteln skiljer sig anatomiskt från huvud till svans. För att visa om några skillnader i RNA integriteten finns mellan RNA isolerat från antingen hälften av bukspottkörteln, var följande experiment gjort. RNA isolerades från den första halvan av bukspottkörteln. Den RIN bestämdes från detta RNA jämfördes med den av RNA som isolerats från den andra halvan av bukspottkörteln efter det lör vid RT under cirka 30 sek under upparbetningen av den initiala halv. RIN för den inledande delen av bukspottkörteln var 7,4 ± 0,20 jämfört med en RIN av 6,9 ± 0,55 för den efterföljande halvåret. Medan skära bukspottkörteln idetta sätt verkar inte släppa ribonukleas och nedbrytning av RNA, om bukspottkörteln ska sektioneras, rekommenderas att använda den första halvan för RNA-analys och den andra halvan till protein.

Lysisreagens stör proteinstruktur och reducerar ribonukleasaktivitet därför. På grund av den stora mängden av ribonukleas, som är närvarande i pankreas, är det möjligt att några aktiva ribonukleas förblir i lys homogenatet och detta ribonukleas kommer jämvikt till den vattenhaltiga fasen. Alla ribonukleas som finns kvar i den sista RNA-lösning kommer att hämma integritet. För att lösa detta har vi lagt till en ribonukleasinhibitor till vattenlösningen av RNA. RNA-integritet jämfördes från en RNA-lösning, som innehöll ribonukleasinhibitor till en som inte gjorde det. Vid ett frys tö, RIN för lösningen av RNA med inhibitor var 7,3 ± 0,15 jämfört med 2,9 ± 0,65 (figur 2, p <0,001, medelvärde ± SD, triplikata isoleringar) förlösning som inte innehöll någon inhibitor. En annan fråga är möjligheten att upprepad frysning upptining kommer att denaturera ribonukleasinhibitor gör den ineffektiv. För att undersöka denna möjlighet, tillsattes en lösning av RNA innehållande ribonukleasinhibitor upprepat fryses och tinas. RNA-lösningar som frysts och tinats upp till 5 gånger produceras fortfarande en RIN av 7 eller högre, medan de lösningar som har frysts och tinats 6 gånger eller högre producerade en RIN under 7 (Figur 2). Det rekommenderas att alikvot RNA-lösningen före frysning och begränsa antalet frysupptiningscykler.

För att demonstrera användbarheten av denna metod, utförde vi QRT-PCR på den isolerade RNA. Medelvärdet RIN från tredubbla RNA isoleringar var 7,4 ± 0,20 (medelvärde ± SD). Slumpvis primat cDNA syntetiserades från RNA och uttrycket av tre hushållningsgener mättes med qPCR användning av standardtekniker. De data som visas i figur 3 validerarvår förmåga att framgångsrikt använda musen bukspottkörtel RNA i en vanlig molekylärbiologisk teknik.

Figur 1. Hög lysisreagens till vävnad kvoten förbättras RNA-integritet. Integriteten hos RNA som isolerats från mus bukspottkörtlar som homogeniserades i 2 (A, D), 4 (B, E) eller 8 (C, F) ml lysisreagens var jämförs. Annat än volymen av lysisreagens, alla var identiska med dem som beskrivs i protokollet häri. En direkt korrelation mellan den mängd som lysisreagens användes vid homogenisering och RNA-integritet. (G) Medelvärde ± SD, trippel isoleringar. p <0,05, ** p <0,001. Klicka här för att se en större versionav denna figur.

Figur 2. RNA degraderar så småningom vid upprepad frysning upptining. RNA som isolerats från mus pankreas upprepat fryses och tinas i närvaro eller frånvaro av ribonukleasinhibitor (RNas I). Medelvärde ± SEM, ** p <0,001.

Figur 3. QRT-PCR av mus pankreatiskt RNA. RNA isolerades från tre mus bukspottkörtlar använda optimerat protokoll. Expressionen av 18S-rRNA, β-2-mikroglobulin och snoRNA251 bestämdes med användning av QRT-PCR (medelvärde ± SD).

Discussion

Isolera RNA från vävnader som ribonukleas rika utgör en stor utmaning för molekylärbiologiska experiment. Olika reagenser och kit finns kommersiellt tillgängliga som är huvudsakligen baserade på fenol guanidintiocyanat metod för RNA-extraktion. Guanidintiocyanat denaturerar protein och därmed minskar aktiviteten av ribonukleas. Men den stora omfattningen av ribonukleas i bukspottkörteln kräver ytterligare ändringar standardprotokoll för RNA-isolering. Ett protokoll redovisas här som är baserad på standard guanidintiocyanat metod ännu innehåller flera viktiga ändringar samt tips för framgångsrik isolering av RNA från ribonukleas rika vävnader såsom bukspottkörteln.

Standard riktlinjer för att isolera RNA ska noteras. Dessa tekniker är avgörande för framgångsrik isolering av RNA, även från prover som är mindre ribonukleas rika än bukspottkörteln. Några exempel med hjälp av molekylärbiologiska grade water, ribonukleas fria förbrukningsartiklar och engångsplastartiklar istället för glas. Det rekommenderas att byta handskar mellan varje isolering. För någon som är oerfaren med att isolera RNA, rekommenderas att de får erfarenhet av att isolera RNA från ribonukleas fattiga prover såsom lever eller från cellkulturer före igångsättning av arbete som kräver isolering av RNA från bukspottkörteln. Utmärkta protokoll finns som erbjuder en mängd olika punkter för att framgångsrikt arbeta med RNA ^8.

Flera viktiga faktorer för att isolera RNA med hög integritet från mus bukspottkörteln redovisas här. Dessa innefattar den volym lysisreagens användes under homogenisering och införandet av en ribonukleasinhibitor till RNA-lösningen. Metoden för att bland annat ribonukleasinhibitor fungerar bra, kommer dock upprepade frysupptiningscykler eventuellt påverka RIN, sannolikt på grund av denaturering av ribonukleasinhibitor. Det bör noteras att alla RNA lösningar used i denna studie gick igenom en frysning tina före RIN beslutsamhet. En annan metod för att minska nedbrytning vid frysupptinings är att lagra det RNA-lösning vid -20 ° C i en utfälld form ^2. Det erbjuder några olägenheter nämligen ta bort etanolen och åter upplösa pelleten före användning av RNA. Jämfört med fenol / guanidintiocyanat reagens protokoll ^2, fördelarna med protokollet redovisas här är enkelheten i att arbeta med lysisreagens och rening kit som inte kräver beredning av specialiserade lösningar och buffertar. Det bör också noteras att detta protokoll har framgångsrikt använts för att isolera små RNA från mus bukspottkörteln.

Ytterligare tips inkluderar hastigheten på bukspottkörteln dissekering och metoden för anestesi före eutanasi (isofluran inhalation föredrages till _{CO2-kvävning).} Flera försök att öva bukspottkörteln kirurgi rekommenderas innan förutse hög kvaliTY-RNA. Anpassning av detta protokoll till ribonukleas rika vävnader såsom mjälte och lungor bör vara lätt att uppnå.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Power Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizer
5424R	Eppendorf		Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent	Invitrogen	15596018	Lysis reagent
Student Vannas spring scissors	Fisher	91500-09	Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch	Fisher	08-951-20	Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps	Fisher	1381239	Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µl)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivator
HPLC grade water	Fisher	W5-4	For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water	Hyclone	SH30538.03	Elution of RNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free	USA Scientific Plastics	1620-2700
15 ml centrifuge tubes	Falcon	352099
70% ethanol	Fisher
100% ethanol	Fisher
200 µl pipet tips	Rainin	GPL200F	For cleaning homogenizer blades
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotometer
Bioanalyzer	Agilent		Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent
RNeasy spin columns	Qiagen		Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	Their age ranged from 4 to 12 months.
Mice	Jackson Lab	strain 129	Their age ranged from 4 to 12 months.