Introduction
Травматическое повреждение мозга (ЧМТ) определяется как изменение в функции мозга, или иное доказательство патологии мозга, вызванного внешним силу 1. TBIs остаются серьезные проблемы со здоровьем во всем мире, особенно в Соединенных Штатах. По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний, по крайней мере, 1,7 млн. TBIs ежегодно происходит в Соединенных Штатах в результате чего 30,5% всех случаев смерти от травм. В 2000 году прямые медицинские расходы и косвенные расходы TBIs составил около миллиарда $ 76,5 в одних только Соединенных Штатах. Хотя технологические и терапевтические достижения в предыдущие десятилетия улучшились качество и продолжительность жизни для людей, страдающих от TBIs, нет эффективного фармацевтические или профилактические процедуры в настоящее время не существует. В связи со сложностью и широкий идущие последствия TBIs, в том числе повреждению тканей, гибели клеток и аксонов дегенерации, нет двух пострадавших не идентичны; Таким образом, ток ЧМТ модель для животных точно не воспроизводитвсе аспекты ЧМТ, как видно на людях. Тем не менее, модели на животных действительно обеспечивают возможность производить почти идентичные травмы необходимые для расследования различные эффекты TBI с надеждой на дальнейшее понимание клинических проявлений TBIs.
Контролируемое корковых воздействия (ТПП) модель использует систему воздействия доставить физическое воздействие к открытой твердой мозговой оболочки животного. Он индуцирует TBIs, начиная от легкой до тяжелой похожи тем, которые испытывают люди. Эта травма была впервые отличающийся тем, хорька 2, а затем был адаптирован для использования в крысы, мыши 3,4 5-7, овец 8. С первого характеристик, на месте травмы был помещен как по средней линии 2,9 и боковой коры 10. ТПП обеспечивает легкий и точный метод исследования последствий и потенциальных методов лечения TBIs.
В дополнение к модели ТПП, перкуссии жидкости и падения веса модели сотрудничестваmmonly используется для производства TBIs. Тем не менее, эти модели представляют ограничения, в том числе менее контроль над параметрами травмы, производя histopathalogical изменения не видел в человеческой TBIs и большей частотой смерти от несчастного случая у мышей 3,5,10. Модель взрывная волна также используется для производства TBIs. Хотя модель взрывная волна не воспроизводит histopathalogical изменения видны после механического воздействия, эта модель точно производить TBIs опытных особенно военнослужащими 11. Радиоуправляемая модель корковых влияние легко контролировать из-за точного контроля над деформационных параметров, таких как время, скорость и глубину воздействия 5. Такая точность позволяет копировать практически идентичные травмы через целой группы животных более реальным. Самое главное, ТПП воспроизводит TBIs с функциями видел в человеческой TBIs 12. Тем не менее, нет единой модели животное, которое полностью успешно воспроизводят полный спектр патологического чанГЭС, наблюдаемые после ЧМТ. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью раскрыть острые и хронические изменения, которые происходят после ЧМТ.
Два типа травм происходит после ЧМТ: первичные и вторичные травмы. Первичный повреждение происходит в момент удара и не чувствительна к лечебных процедур; Однако вторичные повреждения, которые сохраняются после начальной травмы подлежат лечения 13. Радиоуправляемая модель корковых воздействие производит первичную травму, что позволяет исследователям изучить влияние ЧМТ и потенциальные терапевтические методы лечения потенциально долгосрочные последствия вторичных повреждений. Области возможного исследования с использованием модели CCI включают гибель нейронов, отек мозга, нейрогенез, сосудистые эффекты, histopathalogical изменения и нарушения памяти и многое другое 3,13-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход животных
Мужской C57 BL / 6 мышей были группа-размещены и хранятся в 12/12 ч цикле свет / темнота с свободный доступ к еде и воде. Животные, используемые в настоящем протоколе были 10-12 недель. Все процедуры были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом уходу и использованию животных Университета Индианы по.
1. Хирургическая подготовка
- Обезболить мыши с помощью кетамина / ксилазина смесь (87,7 мг / мл кетамина и 12,3 мг / мл ксилазина) и администрирования (1 мл / кг) посредством инъекции IP.
- Бритье головы мыши между ушами.
- Нанесите нефтяной основе желе для глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание во время операции.
- Очистите бритую зона с 10% йода. Затем с помощью 70% этанола счистить йод.
- Закрепите голову мыши в стереотаксической рамы с помощью уха баров и укуса пластину. Убедитесь, что мозг является стабильной.
2. Удаление фрагментов костей черепа
3. Impaction
Система воздействия включает в себя блок управления для установки параметров удара, привод для выполнения столкновение, и стереотаксической рамы для фиксации актаuator и глава мышь для удара.
- Предварительно установите скорость привода до 3 м / сек до операции.
- Предварительно установлено разную глубину деформации, чтобы вызвать различные тяготы травмы. Деформация глубины 0,0-0,2 мм, 0,5-1,0 мм и 1,2-2,0 мм может привести легкой, средней и тяжелой TBIs соответственно. Этот протокол объяснил, как достичь умеренно тяжелой травмы мозга с глубиной деформации 1 мм с помощью скорость 3 м / с.
- Прикрепите привод к держателю в стереотаксической рамы и использовать микроманипуляторами перемещая его, чтобы закрепить круглые, плоские кончик привода (диаметр 3 мм) в центре на открытой площадке черепа. Затем регулировать наконечник под углом параллельно поверхности ударного узла.
- Установите нулевую точку, перемещая вниз привод в проходящей модели пока наконечник касается поверхности участка воздействия. Затем установите Z канал на стереотаксической панели управления до нуля.
- Уберите кончик ударногос одновременным перемещением привода вниз 1 мм.
- Нажмите кнопку удара, чтобы ударить место повреждения и достичь глубины деформации 1 мм.
4. Травмы сайта Закрытие
- Используйте хлопка наконечником аппликаторы для удаления крови следующее влияние, но не прикасайтесь к области травмы.
- Наведите курсор на теплый площадку для поддержания температуры тела.
- После того, как кровотечение остановилось, шов раны закрыты. Положите животное обратно в чистую клетку и дать ему возможность восстановиться после операции на ночь на теплом площадку.
- Администрирование бупренорфин 0,05-0,10 мг / кг SQ каждый 8-12 часов в течение 2 дней после операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Радиоуправляемая модель корковых воздействие производит TBIs начиная по тяжести от легкой до тяжелой. Сообщение отдачей количество черепной отек, кровотечение и черепно искажения при ударе сайта покажет серьезность травмы, полученные в ходе скоростных параметров и глубины деформации. Легкие TBIs привести к черепно-мозговой отек в месте воздействия и небольшое кровотечение из-за ограниченного твердой мозговой нарушения. Умеренное ЧМТ демонстрирует черепа отек и повышенная кровоточивость из-за твердой мозговой пролом за столкновение (рис. 1). Разница между средней и тяжелой ЧМТ может быть трудно отличить, пока не визуализируется на фиксированных тканей с помощью микроскопа (рис. 2); Однако тяжелая ЧМТ могут иногда показать усиленный искажения и черепа отек пост-эффект. ТПП модель может быть использована для определения влияния нескольких аспектах TBIs, в том числе деформации ткани (рис. 2), гибели нейронов, и histopathalogical изменений.
= "Jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "всегда"> 
Рисунок 1. Контролируемая корковых модель воздействия для умеренного черепно-мозговой травмой. Процедура управляемой корковой воздействия показан на этом рисунке.) Глава мыши стабильно фиксируется на стереотаксической рамы с штрих-уха и рта бит. B) Левый череп был воздействию и 4 мм круг было обращено в центре темени и лямбда. С) кость удаляли бурения для создания окна для воздействия. D) привод была прикреплена на стереотаксической рамы и нулевой точки на оси Z. было настроить. Е) ткани мозга был искажен и вызвало кровотечение с ударом. F) кровотечение остановилось несколько минут после воздействия и кровь удаляют ватным аппликатором./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Гистология для умеренных черепно-мозговой травмы. A) наивным 10-12 недельного возраста мозг мыши была удалена. B) 10-12 недельного возраста мозг мышь использовали в качестве контрольного обман. С) Мозг 10-12 недельных мышей был удален через 24 часа после умеренного ЧМТ с использованием модели CCI. D) Мозг 10-12 недельных мыши был удален через 6 недель после умеренного ЧМТ с использованием модели CCI. Отступ в ткани мозга видно на месте удара. Е) окрашивание Нисслю проводили на контроль мнимого 10-12 неделя мозга мыши, чтобы показать нормальный гистологию. Окрашивание F) Нисслю проводили на 10-12 неделя мозга мыши, что былиполучил умеренную TBI, используя модель CCI. Полость видна уходящий вглубь коры. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги для успешного получения в соответствии TBIs с использованием электронной системы воздействия магнит, чтобы вызвать CCI являются: 1) стабильно фиксации головы мыши в стереотаксической рамы; 2) формирование и тот же размер окна кости между мышей путем удаления костей, не повредив твердую мозговую оболочку под ним во время удаление фрагментов костей черепа; 3) правильно позиционируя наконечник ударную в центре открытом пространстве и установления нулевой точки перед влияет.
Глава мыши должен быть закреплен в стереотаксической рамы очень плотно перед ударом. Свободные фиксация будет генерировать большие изменения в уровне травматизма. Для обеспечения фиксации является стабильной, использовать щипцы для оказания давления на черепе, как только головка мышь фиксируется в стереотаксической раме и подтвердить, что череп остается неподвижным. Примите меры предосторожности, чтобы избежать инфицирования обнаженной черепа. После разоблачения череп, перейти к самой сложной части контролируемого корковой воздействия хирургии: бурение циркулярнарезать черепа без повреждения твердой мозговой оболочки под ним.
Оптимальный размер сверла наконечником 0,5 мм. Подходит скорость 10,000-20,000 мин; однако, использование более высокой скорости может облегчить бурение более окно кости. Бурение будет генерировать тепло, что может привести к повреждению мозга, особенно в молодых мышей, чьи кости и твердой мозговой прилагаются. Для предотвращения повреждения головного мозга, применяют физиологический раствор относительно поверхности черепа в процессе бурения. Применяя физиологический раствор сделает его необходимо использовать рассекает микроскопом для того, чтобы увидеть пробурена круг. Когда мышей зрелые, пространство развивается между костью и твердой мозговой оболочки, таким образом, эффект тепла, генерируемого бурения будет производить минимальное влияние.
В то время как бурение, перемещать буровую головку медленно и непрерывно вдоль круговой траектории. В противном случае, бит может двигаться с линии или перейти непосредственно через кости и повредить ткани мозга. Осторожно коснитесь окно костного помощью щипцов для проверки бурение. Если кости черепа штСилы движется вверх и вниз, переместите мелкий кончик пинцетом в пространство между костью и твердой мозговой оболочки. Затем поднимите вверх, чтобы снять всю кость, тем самым создавая в окно. Не поднимайте кость с одной стороны на другую, так как это может повредить ткани мозга. Создание одинаковых по размеру окна кости имеет решающее значение для создания последовательных травмы головного мозга. В связи с внутричерепным давлением, мозг выпирают из открытой области после того, как кость удаляется, тем самым вызывая незначительную деформацию мозга. Если размер окна кости изменяется, уровень деформации мозга будет отличаться, будучи похож на поверхности кривой мозга в среду сайте. Костный не был перемещен над участка воздействия после операции, так как он был меньше, чем окно кости. Это приведет к тому, костный придерживаться непосредственно в ткани головного мозга. Применение клея для герметизации окна кости может привести к повышенным внутричерепным давлением. Рассматривая ударную сайт 3 недели после ТПП хирургии новый мембрана была найдена охватывающий ткани мозга жне Ith никакого роста ткани мозга за пределами участка воздействия. Ни один из известных гистологические изменения не происходят из-за отсутствия костной покрытием.
Система электронное воздействие магнит чрезвычайно стабильной и может точно контролировать скорость и глубину деформации. Тем не менее, благодаря конструкции, катушка соединена с наконечником воздействия можно смещать то время как удар и привести к смещению места падения. Это является основной причиной противоречивых травм, не запрещая никаких других осложнений. Несмотря на возможность для перехода ударную сайт, управляемый метод корковых влияние остается более точным и легче контролировать по сравнению с перкуссией жидкости и методами падение веса, что делает ТПП предпочтительный метод исследования краткосрочных и долгосрочных последствий TBIs , а также возможные терапевтические процедуры. Хотя важно для TBI исследований, удаления части черепа до воздействие ограничивает клиническую значимость модели CCI.
Протокол выше DESприписывает процедуру для получения умеренное TBI в мыши. Воздействие сайт может составлять от 1-6 мм в диаметре в зависимости от животного и серьезности травмы желаемого. Хотя протокол указано наконечник воздействие было 3 мм в диаметре, 4 мм в диаметре удаление фрагментов костей черепа была выполнена, чтобы предотвратить случайно поразительное кости. В дополнение к изменению размера участка воздействия, скорость ударника и глубины деформации можно регулировать, чтобы достичь необходимой степени тяжести.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование из шнура Индиана спинного & Травмы головного мозга исследовательских грантов (SCBI 200-12), Ральф У. и Грейс М. Шоуолтер исследований премии, Университет Индианы биологических исследований Грант, NIH гранты RR025761 и 1R21NS072631-01A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Cotton tipped applicators | Henry Schein | 100-6015 | Remove blood and debris |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13021-12 | Surgery |
| Rechargeable Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| tert-Amyl alcohol | Sigma | 152463-250ML | Making 2.5% Avertin |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | Making 2.5% Avertin |
References
- Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
- Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
- Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
- Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
- Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
- Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
- Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
- Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
- Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
- Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
