Introduction
Traumatisch hersenletsel (TBI) wordt gedefinieerd als een verandering in de hersenfunctie, of andere bewijzen van hersenenpathologie, veroorzaakt door een externe kracht 1. TBIs blijven een ernstig gezondheidsprobleem in de hele wereld, met name in de Verenigde Staten. Volgens de Centers for Disease Control and Prevention, ten minste 1,7 miljoen TBIs komen jaarlijks in de Verenigde Staten resulteerde in 30,5% van alle schade-gerelateerde sterfgevallen. In 2000, de directe medische kosten en indirecte kosten van TBIs bedroeg een geschatte $ 76500000000 in de Verenigde Staten alleen. Hoewel technologische en therapeutische vooruitgang in de afgelopen decennia de kwaliteit en de lengte van het leven voor mensen die lijden aan TBIs zijn verbeterd, geen effectieve farmaceutische of preventieve behandelingen die momenteel bestaan. Vanwege de complexiteit en verreikende effecten van TBIs, zoals weefselbeschadiging, celdood en axon degeneratie, geen twee gewonden zijn identiek; Zo zullen de huidige geen TBI model voor dieren nauwkeurig reproduceertalle aspecten van TBI bij mensen. Echter, diermodellen hebben de mogelijkheid bieden bijna identiek letsel noodzakelijk verschillende effecten van TBI met de hoop verder begrip van de klinische manifestaties van TBIs onderzoeken produceren.
De gecontroleerde corticale effect (CCI) model gebruikt een slagsysteem fysieke effect leveren aan de blootgestelde dura van een dier. Het induceert TBIs variëren van mild tot ernstig vergelijkbaar met die ervaren door mensen. Deze verwonding werd eerst gekarakteriseerd in de fret 2 en later aangepast voor gebruik in de rat 3,4, 5-7 muizen en schapen 8. Sinds de eerste karakterisering is de plaats van letsel zijn zowel geplaatst over de middellijn 2,9 en laterale cortex 10. CCI biedt een eenvoudige en nauwkeurige methode van onderzoek naar de effecten en de mogelijke behandelingen voor TBIs.
Naast de CCI model, de vloeistof percussie en gewicht neerzetten modellen commonly gebruikt om TBIs produceren. Echter, deze modellen huidige beperkingen, zoals minder controle over letsel parameters, produceren histopathalogical veranderingen niet gezien in de menselijke TBIs en grotere incidentie van overlijden door een ongeval bij muizen 3,5,10. De schokgolf die model wordt ook gebruikt om TBIs produceren. Hoewel de schokgolf model niet de histopathalogical veranderingen gezien reproduceren na een mechanische belasting, betekent dit model nauwkeurig produceren TBIs ervaren vooral door militair personeel 11. De gecontroleerde corticale impactmodel is eenvoudig te bedienen door het precieze controle over vervorming parameters zoals tijd, snelheid en diepte effect 5. Een dergelijke nauwkeurigheid maakt repliceren bijna identiek letsel over een hele groep dieren meer haalbaar. Belangrijker nog, CCI reproduceert TBIs met functies gezien in menselijke TBIs 12. Er is echter niet een diermodel dat volledig in het reproduceren van het volledige spectrum van pathologische chanGES waargenomen na TBI. Verder onderzoek is nodig om de acute en chronische veranderingen die optreden na TBI volledig onthullen.
Twee vormen van letsel optreden na een TBI: primaire en secundaire verwondingen. Het primaire letsel optreedt op het moment van impact en is niet gevoelig voor therapeutische behandelingen; echter de secundaire verwondingen die blijven bestaan na de eerste blessure zijn onderworpen aan behandelingen 13. De gecontroleerde corticale impactmodel produceert primaire letsel, waardoor onderzoekers de effecten van TBI en potentiële therapeutische behandelingen te onderzoeken voor de potentieel langdurige effecten van secundaire verwondingen. Gebieden van potentiële onderzoek met behulp van de CCI-model omvatten neuronale dood, cerebraal oedeem, neurogenese, vasculaire effecten, histopathalogical veranderingen, en het geheugen tekorten en meer 3,13-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care
Man C57 BL / 6 muizen werden gehuisvest in groep en hield in een 12/12 uur licht / donker cyclus met gratis toegang tot voedsel en water ad libitum. De in dit protocol gebruikte dieren waren 10-12 weken oud. Alle procedures werden uitgevoerd onder protocollen door Animal Care en gebruik Comite Indiana University's goedgekeurd.
1. Chirurgische Voorbereiding
- Verdoven van de muis met een ketamine / xylazine mengsel (87,7 mg / ml ketamine en 12,3 mg / ml xylazine) en beheren (1 ml / kg) via IP injectie.
- Scheer de kop van de muis tussen de oren.
- Breng een aardolie gebaseerde jelly voor de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen tijdens de operatie.
- Reinig het geschoren gebied met 10% jodium. Maak dan gebruik van 70% ethanol schoon te maken uit de jodium.
- Zet de muis hoofd in de stereotactische frame met behulp van het oor bars en beet plaat. Zorg ervoor dat de hersenen is stabiel.
2. Craniectomy
3. Impaction
De impact systeem omvat een schakelkast om de impact parameters in te stellen, een actuator om de impactie te voeren, en een stereotactische kader om de handeling te beveiligenuator en muis hoofd voor impact.
- Vooringestelde de snelheid van de actuator tot 3 m / sec voor de operatie.
- Pre-set verschillende vervorming diepte aan verschillende verwondingen severities induceren. Vervorming diepte van 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm en 1,2-2,0 mm zou resulteren in lichte, matige en ernstige TBIs, respectievelijk. Dit protocol uitgelegd hoe een matig ernstig hersenletsel met deformatie diepte van 1 mm te bereiken met een snelheid van 3 m / sec.
- Bevestig de aandrijving op de houder van het stereotactische frame en gebruik micromanipulators zij verhuizen naar de ronde, platte uiteinde van de actuator (3 mm diameter) in het midden van de open ruimte schedel beveiligen. Stel vervolgens het uiteinde schuin parallel aan het oppervlak van de botsing plaats.
- Bepaal het nulpunt naar beneden beweegt de actuator in de uitbreiding van model tot het punt raakt het oppervlak van de impact website. Stel vervolgens de Z-kanaal op de stereotactische bedieningspaneel op nul.
- Trek de impactor tipterwijl tegelijkertijd het verplaatsen van de aandrijving naar beneden 1 mm.
- Hit de impact knop om de schade website staken en een vervorming diepte van 1 mm te bereiken.
4. Letsel Site Sluiting
- Gebruik wattenstaafje applicators om geen bloed volgende effecten te verwijderen, maar de schade niet aan.
- Plaats de muis op een warme pad om lichaamstemperatuur te handhaven.
- Zodra bloeden is gestopt, hechten de wond gesloten. Plaats het dier terug in de schone kooi en laat het een nacht herstellen van de operatie aan de warme pad.
- Dien Buprenorfine 0,05-0,10 mg / kg SQ elke 8-12 uur gedurende 2 dagen na de operatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gecontroleerde corticale invloed model produceert TBIs variërend in ernst variëren van mild tot ernstig. Post-effect van de hoeveelheid craniale zwelling, bloeden, en craniale vervorming bij de impact site zal de ernst van het letsel als gevolg van de snelheid en de vervorming diepte parameters onthullen. Milde TBIs resulteren in craniale zwelling op de impact plaats en lichte bloeden vanwege de beperkte dura inbreuk. Een matige TBI vertoont craniale zwelling en een verhoogd bloedingsrisico als gevolg van dura inbreuk op impactie (figuur 1). Het verschil tussen een matige en ernstige TBI kan moeilijk te onderscheiden tot gevisualiseerd op gefixeerde weefsels microscopisch (figuur 2); kan echter een ernstige TBI af en toe weer versterkt vervorming en craniale zwelling post-impact. De CCI-model kan worden gebruikt om de effecten van verschillende aspecten van TBIs, waaronder weefsel vervorming (figuur 2), neuronale dood en histopathalogical veranderingen bepalen.
= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "altijd"> 
Figuur 1. Gecontroleerde corticale impactmodel gematigde traumatisch hersenletsel. De procedure voor gecontroleerde corticale effect wordt geïllustreerd in deze figuur. A) De muis hoofd was stabiel gefixeerd op het stereotactische frame oor bar en mond bits. B) De linker schedel was belicht en 4 mm cirkel werd getrokken in het midden van bregma en lambda. C) Het bot werd verwijderd door het boren van een venster voor het effect. D) genereren De actuator is bevestigd op het stereotactische frame en het nulpunt voor Z-as is opgezet. E) Het hersenweefsel werd vervormd en veroorzaakt bloedingen met impact. F) Het bloeden stopte enkele minuten na de inslag en het bloed werd verwijderd door katoenen applicator./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Histologie voor Matige Traumatisch hersenletsel. A) Een naïeve 10-12 week oude muis hersenen werd verwijderd. B) A 10-12 weken oude hersenen van muizen werd gebruikt als een schijnvertoning controle. C) De hersenen van een 10-12 week oude muis werd verwijderd 24 uur na een matige TBI met de CCI-model. D) De hersenen van een 10-12 week oude muis werd verwijderd 6 weken na een matige TBI met de CCI-model. Een inspringing in het hersenweefsel blijkt op de plaats van de botsing. E) Nissl-kleuring werd uitgevoerd op een sham control 10-12 weken oude muizenhersenen de normale histologie vertonen. F) Nissl-kleuring werd uitgevoerd op een 10-12 weken oud hersenen van muizen die hadkreeg een gematigde TBI met de CCI-model. Een holte zichtbaar uitstrekt tot diep in de cortex. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen voor het succesvol genereren van consistente TBIs via een elektronisch magneet slagsysteem een CCI veroorzaken zijn: 1) stabiel tot vaststelling van de muis hoofd in de stereotactische beeld; 2) het genereren van dezelfde grootte been venster tussen muizen en het bot te verwijderen zonder schade aan de dura daaronder tijdens craniectomy; 3) correct positioneren van de impact punt in het midden van de open ruimte en tot oprichting van het nulpunt alvorens met.
Een muis hoofd moeten worden vastgesteld in de stereotactische kader zeer strak voor de botsing. Losse fixatie zal grote variaties in blessuretijd niveau te genereren. Om ervoor te zorgen fixatie is stabiel, een tang om druk uit te oefenen op de schedel zodra de muis hoofd is vastgesteld in de stereotactische frame en bevestigen dat de schedel blijft onbeweeglijk. Neem voorzorgsmaatregelen om besmetting van de blootgestelde schedel te voorkomen. Na het belichten van de schedel, te verplaatsen naar het moeilijkste deel van de gecontroleerde corticale invloed chirurgie: het boren van een cirkelvormigegesneden in de schedel zonder beschadiging van de dura mater eronder.
De optimale grootte van de boorpunt is 0,5 mm. De geschikte snelheid is 10.000-20.000 tpm; echter met een hogere snelheid kan vergemakkelijken boren van een betere bot venster. Boren zal de warmte die de hersenen kunnen beschadigen, vooral bij jonge muizen waarvan bot en duur zijn bevestigd genereren. Om schade aan de hersenen te voorkomen, zoutoplossing van toepassing op de schedel oppervlak tijdens het boren. Het toepassen van een zoutoplossing zal nopen tot een dissectie microscoop gebruiken om de geboorde cirkel zien. Bij volwassen muizen, een ruimte ontstaat tussen het bot en dura, waardoor het effect van warmte die door boren zouden een minimaal effect te produceren.
Tijdens het boren, verplaatsen de boor langzaam en voortdurend langs een cirkelvormige baan. Anders kan het beetje buiten de lijn te verplaatsen of ga direct door het bot en beschadigt het hersenweefsel. Zachtjes aanraken het bot venster met behulp van een tang om het boren te inspecteren. Als de schedel bot easily op en neer beweegt, bewegen de fijne punt van de tang in de ruimte tussen het bot en de dura. Til vervolgens de hele bot te verwijderen, waardoor het venster creëren. Heeft bot niet opheffen van de ene kant naar de andere, want dit kan het hersenweefsel kwetsen. Het maken van even grote bot ramen is van cruciaal belang voor het genereren van consistente hersenletsel. Vanwege intracraniële druk, zal de hersenen uitpuilen van de open ruimte zodra het bot wordt verwijderd, waardoor de kleine vervorming hersenen. Als het bot venstergrootte varieert, zal het niveau van hersenen vervorming verschillend zijn, dat vergelijkbaar is met het oppervlak hersenen bocht in deze crash. Het bot werd niet verplaatst boven de impact plaats na een operatie, omdat het was kleiner dan het bot venster. Dit zou ervoor zorgen dat het bot direct hechten aan het hersenweefsel. Aanbrengen van lijm op het bot venster afdichting kan leiden tot verhoogde intracraniale druk. De behandeling van een botsing plaats 3 weken na een CCI operatie een nieuw membraan werd gevonden met betrekking tot het hersenweefsel wet geen hersenweefsel groei buiten de impact website. Geen bekende histologische veranderingen optreden als gevolg van een gebrek aan bot bekleding.
De elektronische magneet effect systeem is uiterst stabiel en kan nauwkeurig de snelheid en vervorming diepte te controleren. Echter, vanwege het ontwerp, de spoel verbonden met het effect tip kan verschuiven tijdens het slaan en resulteren in een verschuiving van de botsing plaats. Dit is de belangrijkste oorzaak van inconsistente verwondingen, behoudens geen andere complicaties. Ondanks de mogelijkheid van het verschuiven van de effecten plaats, blijft de gecontroleerde corticale invloed methode nauwkeuriger en gemakkelijker te controleren ten opzichte van de vloeistof percussie en gewicht neerzetten methoden, waardoor CCI een voorkeurswerkwijze voor het onderzoeken van de korte en lange termijn effecten van TBIs alsook mogelijke therapeutische behandelingen. Hoewel belangrijk voor TBI onderzoek, het verwijderen van een deel van de schedel vóór effect beperkt de klinische relevantie van de CCI-model.
Het protocol hierboven describes de procedure om een gematigde TBI te produceren in een muis. De effecten site kan variëren 1-6 mm diameter, afhankelijk van het dier en de ernst van de schade gewenst. Hoewel het protocol aangegeven het effect punt was 3 mm diameter, een 4 mm diameter craniectomy werd uitgevoerd om per ongeluk opvallende bot voorkomen. Naast het veranderen van de grootte van het effect plaats, kan de snelheid van het botslichaam en diepte van de vervorming worden aangepast aan de ernst benodigde bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Indiana Spinal Cord & Brain Injury Research Grants (SCBI 200-12), de Ralph W. en Grace M. Showalter Research Award, Indiana University Biological Research Grant, NIH subsidies RR025761 en 1R21NS072631-01A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Cotton tipped applicators | Henry Schein | 100-6015 | Remove blood and debris |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13021-12 | Surgery |
| Rechargeable Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| tert-Amyl alcohol | Sigma | 152463-250ML | Making 2.5% Avertin |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | Making 2.5% Avertin |
References
- Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
- Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
- Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
- Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
- Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
- Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
- Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
- Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
- Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
- Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
