Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) defineres som en ændring i hjernens funktion, eller anden dokumentation for hjernens patologi, forårsaget af en ydre kraft 1.. TBIs fortsat et alvorligt sundhedsproblem i hele verden, især i USA. Ifølge Centers for Disease Control og Forebyggelse, forekommer mindst 1,7 mio TBIs årligt i USA resulterede i 30,5% af alle dødsfald skade-relaterede. I 2000 de direkte medicinske omkostninger og indirekte omkostninger til TBIs udgjorde en anslået 76500 millioner dollars i USA alene. Selv om de teknologiske og terapeutiske fremskridt i de foregående årtier har forbedret kvaliteten og længden af livet for dem, der lider TBIs, ingen effektiv farmaceutiske eller forebyggende behandlinger findes i øjeblikket. På grund af kompleksiteten og vidtrækkende virkninger af TBIs, herunder vævslæsioner, celledød og Axon degeneration, ikke to skader er identiske; således ingen aktuelle TBI model for dyr nøjagtigt gengiveralle aspekter af TBI, som ses hos mennesker. Men dyremodeller giver evnen til at producere næsten identiske skader, der er nødvendige for at undersøge de forskellige effekter af TBI med håb om yderligere at forstå de kliniske manifestationer af TBIs.
Den kontrollerede kortikale virkning (CCI) model bruger en indvirkning systemet til at levere den fysiske indvirkning på den udsatte dura af et dyr. Det inducerer TBIs spænder fra mild til svær svarende til dem, der opleves af mennesker. Denne skade blev først karakteriseret i fritten 2 og blev senere tilpasset til anvendelse i rotte 3,4, mus 5-7, og får 8. Siden den første karakterisering har skadestedet blevet placeret både over midterlinjen 2,9 og den laterale cortex 10. CCI giver en nem og præcis metode til at undersøge virkningerne og mulige behandlinger for TBIs.
Ud over at CCI-modellen, fluid percussion og vægt dråbe modeller commonly bruges til at producere TBIs. Men disse modeller nuværende begrænsninger, herunder mindre kontrol over skadeparametrene, der producerer histopathalogical ændringer, som ikke er set i menneskelig TBIs og større forekomst af hændelig død i mus 3,5,10. Trykbølgen model anvendes også til at fremstille TBIs. Selv trykbølgen model ikke reproducere de histopathalogical ændringer ses efter en mekanisk påvirkning, er denne model præcist producere TBIs opleves især ved militært personel 11. Den kontrollerede kortikale virkning model er let at styre på grund af den præcise kontrol over deformation parametre såsom tid, hastighed og dybde for slag 5. En sådan nøjagtighed gør at kopiere næsten identiske skader på tværs af en hel gruppe af dyr mere realistisk. Vigtigst er det, CCI gengiver TBIs med funktioner set i menneskelig TBIs 12. Men der er ingen enkelt dyremodel, der er helt vellykket i at gengive hele spektret af patologisk chanGES observeret efter TBI. Yderligere forskning er nødvendig for fuldt ud at afsløre de akutte og kroniske forandringer, der sker efter TBI.
To typer af skader forekomme efter en traumatisk hjerneskade: primære og sekundære skader. Den primære skade sker i det øjeblik virkning og er ikke følsom over for terapeutiske behandlinger; Men de sekundære skader, der resterer, efter at oprindelige skade er underlagt behandlinger 13. Den kontrollerede kortikale virkning model producerer den primære skade, således at forskerne at undersøge virkningerne af TBI og potentielle terapeutiske behandlinger for de potentielt langvarige effekter af sekundære skader. Områder af forskningspotentiale ved hjælp af CCI-modellen omfatter neuronal død, hjerneødem, neurogenese, vaskulære effekter, histopathalogical ændringerne og hukommelse underskud og mere 3,13-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care
Mandlige C57 BL / 6 mus var gruppe-opstaldes og holdes i et 12/12 timers lys / mørke-cyklus med fri adgang til mad og vand ad libitum. De anvendte dyr i denne protokol var 10-12 uger gamle. Alle procedurer blev udført under protokoller godkendt af Indiana University Animal Care og brug Udvalg.
1.. Kirurgisk Forberedelse
- Bedøver musen ved hjælp af en ketamin / xylazin-blanding (87,7 mg / ml ketamin og 12,3 mg / ml xylazin) og administrere (1 ml / kg) via IP injektion.
- Barbere hovedet af musen mellem ørerne.
- Påfør en oliebaseret gelé for øjnene af musen for at forhindre udtørring under operationen.
- Rengør barberede område med 10% jod. Brug derefter 70% ethanol til at rense ud af jod.
- Fastgør musen hovedet i stereotaktisk ramme ved hjælp af øre barer og bide plade. Sørg for, at hjernen er stabil.
2. Kraniektomi
3. Impaction
Systemet effekt omfatter en styreboks til at indstille impact parametre, en aktuator til at udføre sammenpresning, og en stereotaktisk ramme for at sikre handlinguator og mus hoved for effekt.
- Forudindstillet hastighed af aktuatoren til 3 m / sek før operation.
- Pre-sæt anderledes deformation dybde til at fremkalde forskellige skade sværhedsgrader. Deformationsegenskaber dybder på 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm, og 1,2-2,0 mm ville resultere i mild, moderat og svær TBIs hhv. Denne protokol forklaret hvordan man kan opnå en moderat alvorlig hjerneskade med en deformation dybde på 1 mm ved hjælp af en hastighed på 3 m / sek.
- Fastgør aktuatoren til holderen i stereotaktisk ramme og bruge mikromanipulatorer flytter den til at sikre den runde, flad spids af aktuatoren (3 mm i diameter) i midten af det åbne kraniet området. Derefter justerer spids ved en vinkel parallelt med overfladen af virkningerne site.
- Etablere nulpunktet ved at flytte ned aktuatoren i at udvide modellen, indtil spidsen rører overfladen af webstedet effekt. Derefter indstille Z kanal på stereotaktisk kontrolpanel til nul.
- Træk slaglegemets spidssamtidig bevæger aktuatoren ned 1 mm.
- Hit på knappen virkning at strejke skaden site og opnå en deformation dybde på 1 mm.
4.. Injury fabrikslukning
- Brug bomuld tippes applikatorer til at fjerne noget blod efter virkning, men ikke røre skaden området.
- Placer musen på en varm pad at opretholde kroppens temperatur.
- Når blødningen er stoppet, suturere såret lukket. Aflive dyret tilbage til den rene bur og gør det muligt at komme sig efter operationen natten over på den varme pad.
- Administrere Buprenorphin 0,05-0,10 mg / kg SQ hver 8-12 timer i 2 dage efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kontrollerede kortikale virkning model producerer TBIs spænder i sværhedsgrad fra mild til svær. Post-effekt mængden af kranie hævelse, blødning, og kraniel forvrængning på stedet virkningerne vil afsløre skaden sværhedsgrad som følge af parametre hastighed og deformation dybde. Milde TBIs resulterer i kraniel hævelse på virkning og mindre blødning på grund af den begrænsede dura brud. En moderat TBI udstiller kraniel hævelse og øget blødning på grund af dura brud på impaction (Figur 1). Forskellen mellem en moderat og svær TBI kan være vanskeligt at skelne indtil visualiseret på faste væv ved hjælp af et mikroskop (figur 2); dog kan en alvorlig TBI lejlighedsvis vise forstærket forvrængning og kraniel hævelse efter sammenstød. CCI-modellen kan anvendes til at bestemme virkningerne af flere aspekter af TBIs, herunder væv deformation (figur 2), neuronal død og histopathalogical ændringer.
= "Jove_content" fo: keep-together.within-side = "altid"> 
Fig. 1. Kontrolleret kortikale virkning model for moderat traumatisk hjerneskade. Proceduren for kontrolleret kortikal virkning er illustreret i denne figur. A) mus hoved blev stabilt fikseret på stereotaktisk ramme med øre bar og munden bits. B) Den venstre kraniet eksponerede og 4 mm cirkel blev trukket i centrum af bregma og lambda. C) Knoglen blev fjernet ved boring til at generere et vindue virkning. D) Aktuatoren blev fastgjort på stereotaktisk ramme og nulpunktet på Z-aksen oprettet. e) hjernevæv blev fordrejet og forårsagede blødning med effekt. f) afblødning stoppet flere minutter efter effekt og blod blev fjernet ved bomuld applikator./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 2.. Histologi for Moderate traumatiske hjerneskader. A) en naiv 10-12 uger gamle mus hjernen blev fjernet. B) 10-12 uger gamle mus hjernen blev anvendt som en fingeret kontrol. C) Hjernen af en 10-12 uger gamle mus blev fjernet 24 timer efter en moderat TBI bruge CCI-modellen. D) Hjernen af en 10-12 uger gamle mus blev fjernet 6 uger efter en moderat TBI hjælp CCI-modellen. En indrykning i hjernevævet er tydeligt på stedet for effekt. E) Nissl farvning blev udført på en fingeret kontrol 10-12 uger gamle mus hjerne viser normal histologi. F) Nissl farvning blev udført på en 10-12 uger gammel musehjerne, der havdemodtaget en moderat TBI hjælp af CCI-modellen. Et hulrum er synlig strækker sig dybt ind i cortex. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin for succes generere konsistente TBIs ved hjælp af et elektronisk system, indvirkning magnet til at forårsage en CCI er: 1) stabilt fastsættelse musen hovedet i stereotaktisk ramme; 2) generering af samme størrelse af knogle vindue mellem mus og fjerne knoglen uden at beskadige dura under det under kraniektomi; 3) korrekt placering virkningen spids i midten af det åbne område og oprettelse af nulpunktet før påvirker.
En mus hoved skal fastsættes i stereotaktisk ramme meget stramt før kollisionen. Løs fiksering vil generere store variationer i skade-niveau. For at sikre fiksering er stabil, skal du bruge pincet til at lægge pres på kraniet, når musen hoved er fastgjort i stereotaktisk ramme og bekræfte, at kraniet forbliver ubevægelig. Træf foranstaltninger for at undgå infektion af den eksponerede kraniet. Efter at udsætte kraniet, flytte til den sværeste del af den kontrollerede kortikale virkning kirurgi: bore et cirkulæreskåret i kraniet uden at beskadige dura mater nedenunder.
Den optimale størrelse på boret spids er 0,5 mm. Den passende hastighed er 10.000-20.000 rpm; dog under anvendelse af en højere hastighed, kan lette boring af en bedre knogle vindue. Boring vil generere varme, som kan skade hjernen, især i unge mus, hvis knogler og dura er vedlagt. For at undgå at beskadige hjernen, anvende saltvand til kraniet overfladen, mens boring. Anvendelse af saltvand vil gøre det nødvendigt at anvende et dissektionsmikroskop for at se det borede cirkel. Når mus modne, udvikler et mellemrum mellem knogle og dura, hvorved virkningen af varme, der genereres ved boring ville producere en minimal indvirkning.
Mens boring, flyt boret langsomt og konstant langs en cirkulær bane. Ellers kan den smule flytte væk fra linjen eller gå direkte gennem knoglen og beskadige hjernevæv. Tryk forsigtigt i knoglen vinduet med pincet til at inspicere boringen. Hvis kraniet eaSily bevæger sig op og ned, flytte den fine spids pincet ind i rummet mellem knoglen og dura. Løft derefter op for at fjerne det hele ben, og dermed skabe vinduet. Løft ikke knogle fra den ene side til den anden, da dette kan skade hjernevæv. Gør identisk mellemstore knogle vinduer er afgørende for at skabe konsistente hjerneskader. På grund af intrakranielt tryk, hjernen vil bule ud af det åbne område, når knoglen er fjernet, hvilket forårsager mindre hjerne deformation. Hvis knoglen vindue størrelse varierer, vil niveauet af hjernens deformation være anderledes, at ligne hjernens overflade kurve i stedet effekt. Knoglen blev ikke repositioneret over nedslagsstedet efter operationen, da det var mindre end knoglen vinduet. Det ville medføre, at knoglerne til at klæbe direkte til hjernevæv. Anvende lim til at forsegle knoglen vinduet kan resultere i øget intrakranielt tryk. Undersøge en indvirkning hjemmeside 3 uger efter en CCI operation en ny membran blev fundet dækker hjernevævet wed ingen hjernevæv vækst uden for nedslagsstedet. Ingen kendte histologiske forandringer opstå på grund af mangel på knogle dækker.
Den elektroniske virkning magnet er yderst stabile og kan præcist at styre hastigheden og deformation dybde. Men på grund af konstruktionen, kan spolen forbundet til virkningen spids skifte samtidig slående og resultere i en forskydning af virkningerne site. Dette er den væsentligste årsag til inkonsistente skader, spærring ingen andre komplikationer. Trods muligheden for at flytte webstedet virkning, den kontrollerede kortikale indvirkning metode stadig mere præcis og nemmere at styre i forhold til væsken slagtøj og vægt drop metoder, og dermed gøre CCI en foretrukken metode til at undersøge de kortsigtede og langsigtede virkninger af TBIs , såvel som mulige terapeutiske behandlinger. Selvom vigtigt for TBI forskning, at fjerne en del af kraniet, før virkningen begrænser den kliniske relevans af CCI-modellen.
Protokollen over describes proceduren for at producere en moderat TBI i en mus. Virkningen stedet kan variere fra 1 til 6 mm i diameter afhængig af dyret og sværhedsgraden af skade ønskes. Selv om protokollen anført virkningerne spids var 3 mm i diameter, 4 mm i diameter kraniektomi blev udført med henblik på at undgå utilsigtet slående knogle. Ud over ændring af størrelsen på webstedet virkning må hastigheden af slaglegemet og dybden af deformation justeres for at nå sværhedsgraden behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet med midler fra Indiana Spinal Cord & Brain Injury Research Grants (SCBI 200-12), Ralph W. og Grace M. Showalter Research Award, Indiana University Biological Research Grant, NIH tilskud RR025761 og 1R21NS072631-01A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Cotton tipped applicators | Henry Schein | 100-6015 | Remove blood and debris |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13021-12 | Surgery |
| Rechargeable Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| tert-Amyl alcohol | Sigma | 152463-250ML | Making 2.5% Avertin |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | Making 2.5% Avertin |
References
- Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
- Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
- Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
- Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
- Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
- Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
- Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
- Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
- Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
- Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
