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Medicine

控制皮层影响模型创伤性脑损伤

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

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创伤性脑损伤(TBI)被定义为改变在脑功能,或其他证据脑病理学的,引起的外力1。科技企业孵化器仍然是一个严重的健康问题,在世界各地,特别是在美国。根据疾病控制中心和预防,至少170万科技企业孵化器,每年发生在美国造成的所有伤害相关的死亡的30.5%。 2000年,直接医疗费用和科技企业孵化器的间接成本总额估计为76.5十亿在美国孤单。尽管在过去几十年的技术和治疗的进步已经改善的生活质量和长度为那些从孵化器的数量的痛苦,没有有效的药物或预防性治疗目前存在。由于复杂性和科技企业孵化器,包括组织病变,细胞死亡和轴突变性广泛深远的影响,没有两个伤害是相同的;因此,对动物无电流TBI模型准确地再现TBI的各个方面所看到的人类。然而,动物模型并提供生产所需的调查TBI的目的是进一步了解科技企业孵化器的临床表现,希望不同的效果几乎相同的伤害的能力。

受控皮质冲击(CCI)模型使用了一个冲击系统提供物理冲击到动物的暴露硬脑膜。它诱导科技企业孵化器的范围从轻微到严重类似的经历的人。这种损伤是第一特征的白鼬2和后来被改编为在大鼠3,4,鼠标5-7,和羊8使用。由于第一特征,损伤部位已被放置两过中线2,9和外侧皮质10。 CCI提供了调查的影响和潜在的治疗科技企业孵化器的一个简单而准确的方法。

除了在CCI模型中,流体打击乐器和重量下降模型是共mmonly用于生产科技企业孵化器。然而,这些模型存在的局限性,包括更少的控制参数的伤害,产生不可见人的科技企业孵化器histopathalogical变化,意外死亡的小鼠3,5,10发病较多。冲击波模型也用于生产科技企业孵化器。虽然冲击波模式不会重现见过histopathalogical变化下的机械冲击,这种模式并准确地生成特别是军事人员11经历科技企业孵化器。该控制皮层的影响模型是很容易控制,由于精确控制变形参数,如时间,速度和冲击5的深度。这样的精度,使整个动物更可行的整组复制几乎相同的伤害。最重要的是,CCI再现科技企业孵化器与出现在人类的科技企业孵化器12的功能。然而,没有一个单一的动物模型是在病理性重现陈的完整光谱完全成功GES脑外伤后观察。进一步的研究是必要的,以充分揭示脑外伤后发生的急性和慢性的变化。

两种类型的伤害发生下列脑外伤:主要和次要受伤。原发性损伤发生在撞击时刻,而不是治疗性的治疗敏感;然而,在初始损伤后持续存在二次伤害受治疗13。该控制皮层的影响模型产生的原发性损伤,从而使研究人员调查TBI的影响和潜在的治疗治疗继发性损伤的潜在的长期影响。使用CCI模型潜在的研究领域包括神经元死亡,脑水肿,神经,血管的影响,histopathalogical变化,记忆障碍,更3,13-16。

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Protocol

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动物护理
男C57 BL / 6小鼠群养,并保持在一个12/12小时亮/暗周期,自由地获取食物和水随意 。在这个协议中使用的动物是10-12周龄。所有程序均在批准的印第安纳大学的动物护理和使用委员会的协议执行。

1,手术准备

  1. 使用氯胺酮/甲苯​​噻嗪混合物(87.7毫克/毫升氯胺酮和12.3毫克/毫升甲苯噻嗪)麻醉小鼠,并通过腹腔注射给药(1毫升/千克)。
  2. 剃两耳之间的小鼠头部。
  3. 适用于石油基果冻到鼠标的眼睛,以防止在手术过程中变干。
  4. 请用10%碘的剃光区域。然后用70%的酒精擦拭脱碘。
  5. 用耳棒和导板固定鼠标头部立体定位框架。保证大脑是稳定的。

2。骨瓣

  • 使头部用剪刀中间有纵形切口。用止血钳保持皮肤脱落的左侧。
  • 用棉签除去血液和组织中的骨,以暴露颅骨。允许暴露颅骨干燥1分钟。
  • 使用镊子施加压力,并确保该头骨保持不动。确定解剖标志LAMBDA(尾椎方面)和前囟门(正面的方面)。绘制在Lambda和前囟门的中心圆直径4mm和0.5 mm远离中线。
  • 使用钻孔沿标记的圆圈切割。轻轻地吹骨扬灰了。不要穿过骨完全钻,以免损坏硬脑膜。
  • 使用镊子去除骨暴露硬脑膜。
  • 3。嵌塞

    冲击系统包括控制箱设置影响的参数,一个致动器来执行嵌塞,和立体定位框架,以确保该行为uator和鼠标头的影响。

    1. 预先设定的致动器的速度,以6米/秒的手术前。
    2. 预先设置不同的变形深度诱导不同的损伤严重性。为0.0-0.2毫米,0.5-1.0毫米,1.2-2.0毫米深的变形会导致轻度,中度,重度科技企业孵化器,分别为。该协议解释了如何通过使用3米/秒的速度实现了适度重型颅脑损伤1毫米变形深度。
    3. 连接所述致动器在支架中的立体定位框架,并使用显微操作器移动它来固定致动器(直径3mm),在打开头骨区域的中心的圆的,平的端部。然后调节笔尖在平行于冲击部位的表面的角度。
    4. 通过向下移动的扩展模型中执行器,直到笔尖接触撞击点的表面建立的零点。然后设置Z通道的立体定向控制面板零上。
    5. 收回撞击尖同时移动驱动器下降1毫米。
    6. 击中冲击按钮罢工的损伤部位,达到1毫米的变形深度。

    4,损伤部位封闭

    1. 用棉签涂药,以消除任何血继的影响,但不碰损伤区域。
    2. 放置在一个温暖的鼠标垫,以保持体温。
    3. 一旦出血停止后,缝合关闭伤口。将动物放回笼子清洁并允许其从手术中恢复过夜的暖垫。
    4. 管理丁丙诺啡0.05-0.10毫克/公斤SQ每天8-12小时的手术后2天。

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    Representative Results

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    该控制皮层的影响模型产生科技企业孵化器范围的严重程度从轻微到严重。撞击后颅肿胀的量,出血,并在冲击地点颅失真将揭示从速度和变形深度参数造成的损伤程度。温和的科技企业孵化器导致颅肿胀在撞击地点和轻微出血,由于有限的硬脑膜违约。适度表现出脑外伤颅内肿胀,出血增多,由于硬脑膜违反嵌塞后( 图1)。中度和重度TBI之间的差别可能是难以区分,直到上观察用显微镜( 图2)固定的组织;然而,严重的脑外伤可能偶尔会显示放大的失真和颅肿胀后影响。在CCI模型可以用来确定孵化器的数量的多个方面,包括组织变形( 图2),神经元死亡,并histopathalogical变化的影响。

    =“jove_content”FO:保持together.within页=“总是”> 图1
    图1。控制皮层的影响模型对中度创伤性脑损伤。受控皮质影响的过程说明了这个数字。 一)鼠标头部稳定地固定在立体定位框架,穗条和嘴巴位B关于左侧头骨暴露和4mm圆被画在囟和lambda的中心。℃)的骨除去钻孔产生用于冲击D)一个窗口的致动器附着在立体定位框架和零点Z轴上被设置E)的脑组织被扭曲,造成与影响。 女性)出血出血停止冲击后几分钟,血液中除去棉签。/ ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

    图2
    图2。组织学为中度创伤性脑损伤。 A)天真10-12周龄小鼠大脑已被删除。B)10〜12周龄的小鼠大脑作为一个假的控制。C)的 10-12周龄小鼠大脑辗转24小时后温和使用TBI的CCI模型D)辗转的10-12周龄小鼠大脑后6周中度头部外伤使用CCI模型。在脑组织的缩进是显而易见的影响的部位E)尼氏染色的假手术对照组10〜12周龄的小鼠大脑进行正常显示的组织学。在10-12周龄进行F)的尼氏染色小鼠大脑中有收到了中度头部外伤使用CCI模型。一腔可见延伸深入皮层。 点击这里查看大图。

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    Discussion

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    为成功地产生一致的孵化器的数量使用电子冲击磁体系统以引起CCI中最关键的步骤是:1)稳定地固定在鼠标头在立体定位框架; 2)产生的小鼠之间的骨窗的大小相同,没有骨瓣期间根据其损伤硬膜去除骨; 3)正确定位的影响,提示在开区的中心,影响之前确定的零点。

    鼠标头必须固定在立体定位框架的影响之前非常紧密。内固定松动会产生大的变化伤害的水平。为了确保固定稳定,使用产钳适用于颅骨的压力,一旦鼠标头部固定在立体定位框架,并确认头骨仍然不动。采取预防措施,以避免外露颅骨感染。暴露颅骨后,移动到控制皮层影响手术的最困难的部分:钻一个圆形切成颅骨而不损伤底下的硬脑膜。

    的钻头尖端的最佳尺寸为0.5毫米。在合适的速度是10,000-20,000转;然而,使用较高的速度可以促进钻一个更好的骨窗口。钻孔会产生热量,可以破坏大脑,尤其是在年轻小鼠的骨和硬脑膜相连。为了防止损坏大脑,应用生理盐水颅骨表面,而钻孔。应用生理盐水将使得有必要使用解剖显微镜才能看到的钻圈。当小鼠成熟,空间的骨和硬脑膜之间的发展,从而通过钻孔产生的热效应会产生最小的影响。

    虽然钻,移动钻头慢慢不断沿着圆形路径。否则,该位可能会离开该行或去直接通过骨损伤脑组织。使用镊子来检查钻孔轻轻触碰骨窗。如果颅骨EAsily上下移动,所述钳子的细尖移动到骨和硬脑膜之间的空间。然后抬起删除整个骨骼,从而创建窗口。不要从一侧到另一解除骨,因为这样可能会伤及脑组织。使相同大小的骨窗是产生一致的脑损伤的关键。由于颅内压增高,大脑会凸出开区,一旦骨被删除,从而造成轻微脑变形。如果骨窗大小而变化,脑变形的程度将是不同的,即类似于在冲击地点的脑表面的曲线。手术后的骨没有重新定位在冲击地点,因为它是比骨窗较小。这样做会导致骨直接粘附到脑组织。将胶水封住的骨窗,可能会导致颅内压增高。检查产生影响的网站后3周CCI手术一个新的膜被发现覆盖在脑组织瓦特第i个无脑组织生长的影响站点之外。没有已知的组织学变化的发生是由于缺乏骨覆盖的。

    电子冲击磁铁系统是极其稳定的,并且可以精确地控制速度和变形深度。然而,由于该设计,连接到冲击头的线圈可以移动而撞击并导致撞击点的移位。这是不一致的受伤的主要原因,除非无其他并发症。尽管有可能用于移位的影响站点相比,液压冲击和体重下降的方法的控制皮层冲击方法仍然更精确和更容易控制,从而使CCI的优选方法为调查孵化器的数量的短期和长期影响,以及可能的治疗性治疗。虽然重要的是TBI研究之前,冲击去除颅骨的一部分限制了CCI模型的临床相关性。

    上述DES协议cribes以产生适度的TBI的小鼠的步骤。取决于损伤所需的动物和严重性的影响,站点可以为1-6毫米的直径。虽然协议规定的冲击尖端为3mm,直径为4毫米的直径,以防止意外撞击骨进行颅骨切除术。除了改变撞击部位的大小,变形的冲击和深度的速度可以调节,以达到所需要的程度。

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    Acknowledgments

    这项工作是由来自印第安纳州脊髓和脑损伤的研究资助(SCBI 200-12)提供资金支持,拉尔夫W.和格雷斯M.沙氏研究奖,美国印第安纳大学生物研究基金,美国国立卫生研究院资助RR025761和1R21NS072631-01A。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

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    References

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    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

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