Introduction
Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é definido como uma alteração no funcionamento do cérebro, ou outra evidência de patologia cerebral, causada por uma força externa 1. Tbis continuam a ser um grave problema de saúde em todo o mundo, especialmente nos Estados Unidos. De acordo com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças, pelo menos 1,7 milhão de Tbis ocorrem anualmente nos Estados Unidos, resultando em 30,5% de todas as mortes relacionadas com a lesão. Em 2000, os custos médicos diretos e custos indiretos de Tbis totalizaram um valor estimado de 76.500 milhões dólares nos Estados Unidos sozinho. Embora os avanços tecnológicos e terapêuticos em décadas anteriores melhoraram a qualidade ea duração da vida para aqueles que sofrem de Tbis, nenhuma farmacêutica eficaz ou tratamentos preventivos existem atualmente. Devido à complexidade e os efeitos de grande alcance de Tbis, incluindo lesões teciduais, morte celular e degeneração de axônios, não há duas lesões são idênticas; assim, nenhum modelo de TBI atual para animais reproduz com precisãotodos os aspectos do TCE, como visto nos seres humanos. No entanto, os modelos animais não fornecem a capacidade para produzir lesões quase idênticos necessários para investigar os efeitos de vários TCE com a esperança de compreender ainda as manifestações clínicas da lesão cerebral traumática.
O modelo de impacto cortical controlado (CCI) utiliza um sistema de impacto para gerar impacto físico para a dura-máter de um animal exposto. Induz Tbis que variam de leve a grave semelhantes às vividas por seres humanos. Esta lesão foi caracterizado pela primeira vez no furão, 2 e depois foi adaptada para uso no rato 3,4, rato 5-7, e ovelhas 8. Desde a primeira caracterização, o local da lesão foi colocada tanto sobre a linha média e 2,9 a cortical lateral 10. CCI fornece um método fácil e preciso de investigar os efeitos e tratamentos potenciais para Tbis.
Além do modelo de CCI, a percussão do fluido e da queda de peso modelos são commonly usado para produzir Tbis. No entanto, estes modelos apresentam limitações, incluindo menos controle sobre parâmetros de lesão, produzindo alterações histopathalogical não vistos em Tbis humano e uma maior incidência de morte acidental em ratos 3,5,10. O modelo de onda de choque também é usado para produzir Tbis. Embora o modelo de onda de choque não reproduz as mudanças histopathalogical visto após um impacto mecânico, este modelo não produz precisão Tbis experientes particularmente por militares 11. O modelo de impacto cortical controlado é fácil de controlar, devido ao controlo preciso sobre os parâmetros de deformação, tais como tempo, velocidade e profundidade de impacto 5. Essa precisão torna replicando lesões quase idênticas em todo um grupo inteiro de animais mais viáveis. Mais importante ainda, CCI reproduz Tbis com características vistas em Tbis humano 12. No entanto, não existe um modelo único animal que é totalmente bem-sucedido em reproduzir o espectro completo de patológico changes observadas após o TCE. Mais pesquisas são necessárias para revelar plenamente as alterações agudas e crônicas que ocorrem após o TCE.
Dois tipos de lesões ocorrem após um TCE: lesões primárias e secundárias. A lesão primária ocorre no momento do impacto, e não é sensível a tratamentos terapêuticos; No entanto, as lesões secundárias que persistem após a lesão inicial, estão sujeitos a tratamentos de 13. O modelo de impacto cortical controlado produz a lesão primária, permitindo assim que os pesquisadores a investigar os efeitos da TBI e potenciais tratamentos terapêuticos para os efeitos potencialmente duradouros de lesões secundárias. Áreas de pesquisa potencial utilizando o modelo de CCI incluem morte neuronal, edema cerebral, a neurogênese, efeitos vasculares, alterações histopathalogical e déficits de memória e mais 3,13-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care
Masculino C57 BL / 6 machos foram alojados em grupo e mantidos em um ciclo claro / escuro 12/12 horas de luz com acesso ao acesso a alimentos e água ad libitum. Os animais utilizados neste protocolo foram 10-12 semanas de idade. Todos os procedimentos foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Use da Universidade de Indiana.
1. Preparação Cirúrgica
- Anestesiar o rato usando uma mistura de cetamina / xilazina (87,7 mg / ml de cetamina e 12,3 mg / ml de xilazina) e administrar (1 ml / kg), por injecção IP.
- Raspar a cabeça do rato entre as orelhas.
- Aplique uma geléia à base de petróleo para os olhos do mouse para evitar ressecamento durante a cirurgia.
- Limpe a área de barba feita com 10% de iodo. Em seguida, use álcool 70% para limpar o iodo.
- Fixe a cabeça do rato na moldura estereotáxica usando as barras de ouvido e placa de mordida. Certifique-se de que o cérebro é estável.
2. Craniectomia
3. Impactação
O sistema de impacto inclui uma caixa de controle para definir os parâmetros de impacto, um atuador para realizar a compactação, e um quadro estereotáxico para garantir o atouator e cabeça de rato para o impacto.
- Pré-estabelecidos da velocidade do actuador de 3 m / s antes da cirurgia.
- Pré-definido diferente profundidade deformação para induzir diferentes gravidades da lesão. Profundezas de Deformação de 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm e 1,2-2,0 mm resultaria em Tbis leve, moderada e grave, respectivamente. Este protocolo explicado como conseguir uma lesão cerebral moderadamente grave, com uma profundidade de deformação de um milímetro por meio de uma velocidade de 3 m / seg.
- Fixe o atuador para o titular na armação estereotáxica e usar os micromanipuladores movê-lo para garantir a ponta redonda e plana do atuador (3 mm de diâmetro) no centro da área do crânio aberto. Em seguida, ajustar a ponta em ângulo paralelo à superfície do local do impacto.
- Estabelecer o ponto zero, movendo-se o atuador no modelo que prorroga até a ponta toca a superfície do local do impacto. Em seguida, defina o canal Z no painel de controle estereotáxico para zero.
- Recolha a ponta pênduloenquanto se move para baixo, simultaneamente, o actuador de um milímetro.
- Aperte o botão de impacto para atingir o local da lesão e atingir uma profundidade de deformação de 1 mm.
4. Lesão site Encerramento
- Utilize aplicadores com ponta de algodão para remover qualquer impacto sangue seguinte, mas não toque na área da lesão.
- Coloque o mouse sobre uma almofada quente para manter a temperatura corporal.
- Uma vez que o sangramento parou, suturar a ferida fechada. Coloque o animal de volta para a gaiola limpa e permitir que ele se recuperar da cirurgia durante a noite na almofada quente.
- Administrar Buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg SQ cada 8-12 horas por 2 dias após a cirurgia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O modelo de impacto cortical controlado produz Tbis que variam em gravidade de leve a grave. Pós-impacto a quantidade de inchaço craniano, hemorragia e distorção cranial no local do impacto irá revelar a gravidade da lesão resultante dos parâmetros de velocidade e profundidade deformação. Tbis leves resultar em inchaço craniano no local do impacto e um leve sangramento, devido à quebra dura limitado. A TCE moderado apresenta inchaço craniano e aumento de sangramento devido à quebra dura em cima de impactação (Figura 1). A diferença entre um TCE moderado e grave pode ser difícil distinguir até visualizados em tecidos fixados utilizando um microscópio (Figura 2); no entanto, um TCE grave podem, ocasionalmente, apresentar distorção amplificada e inchaço pós-impacto craniano. O modelo CCI pode ser usado para determinar os efeitos de vários aspectos da lesão cerebral traumática, incluindo deformação do tecido (Figura 2), a morte neuronal, e alterações histopathalogical.
= "Jove_content" fo: manter-together.within-page = "always"> 
Figura 1. Modelo de impacto cortical para a lesão cerebral traumática moderada controlada. O procedimento para o impacto cortical controlado é ilustrado nesta figura. A) A cabeça de rato foi estavelmente fixada no quadro estereotáxico com bar orelha e boca bits. B) O crânio foi deixado exposta e 4 mm círculo foi desenhado no centro do bregma e lambda. C) O osso foi removido pela perfuração para gerar uma janela de impacto. D) O actuador foi ligado na estrutura estereotáxica e o ponto zero no eixo Z foi configurar. E) O tecido cerebral foi distorcida e causou sangramento com impacto. F) O sangramento parou vários minutos após o impacto eo sangue foi removido por aplicador de algodão./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Histologia para lesões cerebrais traumáticas moderadas. A) Um ingénuos cérebro do rato de 10-12 semanas de idade foi removida. B) Um cérebro de ratinho de 10-12 semanas de idade foi utilizado como um controlo simulado. C) O cérebro de um rato de 10-12 semanas de idade foi removido 24 horas após uma moderada TBI utilizando o modelo de CCI. D) O cérebro de um rato de 10-12 semanas de idade foi removido 6 semanas após um TCE moderado utilizando o modelo de CCI. Um recuo no tecido cerebral é evidente no local de impacto. E) coloração de Nissl foi realizada num controlo simulado de 10-12 semanas de idade cérebro do rato para mostrar a histologia normal. Coloração F) Nissl foi realizada num 10-12 semanas de idade cérebro do rato que tinharecebeu um TCE moderado, utilizando o modelo CCI. A cavidade é visível que se estende profundamente no córtex. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os passos mais críticos para a geração de sucesso Tbis consistentes usando um sistema impacto ímã eletrônico para causar um CCI são: 1) de forma estável a fixação da cabeça do rato na moldura estereotáxica; 2) gerar o mesmo tamanho da janela de osso entre ratinhos e remoção do osso, sem danificar a dura por baixo durante a craniotomia; 3) posicionar corretamente a ponta impacto no centro da área aberta e estabelecer o ponto zero antes de colidir.
A cabeça de rato deve ser fixado no quadro estereotáxico muito firmemente antes do impacto. Fixação solto vai gerar grandes variações no nível da lesão. Para garantir a fixação é estável, utilize uma pinça para aplicar pressão no crânio uma vez que a cabeça de rato é fixada no quadro estereotáxico e confirmar que o crânio permanece imóvel. Tomar medidas de precaução para evitar a infecção do crânio exposto. Depois de expor o crânio, mover-se para a parte mais difícil da cirurgia impacto cortical controlado: a perfuração de um circularcortar dentro do crânio, sem danificar a dura-máter sob.
O tamanho ideal da ponta da broca é de 0,5 mm. A velocidade adequada é 10.000-20.000 rpm; No entanto, utilizando uma velocidade maior pode facilitar a perfuração de uma janela melhor osso. Perfuração irá gerar calor que pode danificar o cérebro, particularmente em ratos jovens cujos ossos e dura estão ligados. Para evitar danos ao cérebro, aplicar soro fisiológico para a superfície do crânio durante a perfuração. Aplicando salina irá tornar necessária a utilização de um microscópio de dissecação, a fim de ver o círculo perfurado. Quando os ratos maduros, desenvolve um espaço entre o osso e dura, assim, o efeito do calor gerado pela perfuração produziria um impacto mínimo.
Enquanto perfuração, mover a broca devagar e constantemente ao longo de uma trajetória circular. Caso contrário, o bit pode mover-se fora da linha ou ir diretamente através do osso e danificar o tecido cerebral. Toque suavemente a janela do osso usando uma pinça para inspecionar a perfuração. Se o osso do crânio easily se move para cima e para baixo, mover a ponta fina da pinça para dentro do espaço entre o osso e a dura. Em seguida, levante-se para remover o osso total, criando assim a janela. Não levante osso de um lado para o outro, pois isso pode prejudicar o tecido cerebral. Fazendo janelas ósseas de tamanho idêntico é fundamental para a geração de lesões cerebrais consistentes. Devido à pressão intracraniana, o cérebro vai ser empurrada para fora da área aberta, uma vez que o osso é removida, causando assim a deformação do cérebro menor. Se o tamanho da janela óssea varia, o nível de deformação cerebral será diferente, sendo semelhante à curva da superfície do cérebro no local do impacto. O osso não foi reposicionado sobre o local do impacto após a cirurgia, uma vez que era menor do que a janela do osso. Fazer isso faria com que o osso para aderir diretamente ao tecido cerebral. Aplicando cola para selar a janela do osso pode resultar em aumento da pressão intracraniana. Examinando um site de impacto 3 semanas após uma cirurgia CCI uma nova membrana foi encontrado cobrindo o tecido cerebral wom sem cérebro crescimento do tecido do lado de fora do local do impacto. Sem alterações histológicas conhecidos ocorrer devido à falta de cobertura óssea.
O sistema de impacto ímã eletrônico é extremamente estável e pode controlar com precisão a velocidade e profundidade deformação. No entanto, devido à concepção, a bobina ligada à ponta de impacto pode deslocar ao golpear e resultar em uma mudança de local de impacto. Esta é a principal causa de lesões inconsistentes, salvo quaisquer outras complicações. Apesar da possibilidade de deslocamento local do impacto, o método de impacto cortical controlado continua a ser mais preciso e mais fácil de controlar em comparação com o fluido de percussão e métodos de queda de peso, tornando assim CCI um método preferido para investigar as de curto prazo e de longo prazo, os efeitos da lesão cerebral traumática , bem como possíveis tratamentos terapêuticos. Embora importante para a pesquisa TBI, a remoção de uma porção do crânio antes de impacto limita a relevância clínica do modelo de CCI.
O protocolo acima describes o procedimento para produzir um TCE moderado em um mouse. O local de impacto pode variar 1-6 mm de diâmetro, dependendo do animal e da gravidade da lesão desejada. Embora o protocolo indicado na ponta de impacto foi de 3 mm de diâmetro, um de 4 mm de diâmetro craniectomia foi realizada a fim de evitar osso golpear acidentalmente. Além de alterar o tamanho da área de impacto, a velocidade do pêndulo e profundidade de deformação pode ser ajustada para atingir a intensidade necessária.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Cordão Indiana Spinal & Brain Injury Research Grants (SCBI 200-12), o Ralph W. and Grace M. Showalter Research Award, da Universidade de Indiana Biological Research Grant, NIH concede RR025761 e 1R21NS072631-01A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Cotton tipped applicators | Henry Schein | 100-6015 | Remove blood and debris |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13021-12 | Surgery |
| Rechargeable Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| tert-Amyl alcohol | Sigma | 152463-250ML | Making 2.5% Avertin |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | Making 2.5% Avertin |
References
- Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
- Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
- Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
- Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
- Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
- Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
- Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
- Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
- Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
- Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
