Summary
Níveis de atividade de campo aberto são usados para avaliar os níveis de atividade de locomotivas e comportamentais. Este protocolo fornece um bem concebido, protocolo padronizado para usar em ensaios pré-clínicos para doenças neuromusculares.
Abstract
O sistema de monitoramento de atividades de campo aberto avalia exaustivamente locomotor e os níveis de atividade de comportamento de camundongos. É uma ferramenta útil para avaliar a deficiência locomotiva em modelos animais de doença neuromuscular e eficácia dos medicamentos terapêuticos que podem melhorar a função de locomoção e / ou muscular. A medição de atividade de campo aberto fornece uma medida diferente do que a força muscular, o que é comumente avaliada por medidas da força de preensão. Ele também pode mostrar como as drogas podem afetar outros sistemas do corpo, bem como quando utilizada com medidas adicionais de desfechos. Além disso, medidas como a distância total percorrida espelhar o teste de caminhada de 6 min, uma medida do resultado dos ensaios clínicos. No entanto, o monitoramento da atividade de campo aberto também está associada com importantes desafios: as medições da actividade campo aberto variam de acordo com a cepa animal, idade, sexo, e ritmo circadiano. Além disso, a temperatura ambiente, umidade, iluminação, ruído, e mesmo odor pode afetar os resultados da avaliação. No geral, este manuscript fornece uma SOP atividade de campo aberto bem testado e padronizado para ensaios pré-clínicos em modelos animais de doenças neuromusculares. Nós fornecemos uma discussão de questões importantes, os resultados típicos, análise de dados e detalhar os pontos fortes e fracos de testes de campo aberto. Além disso, podemos fornecer recomendações para o projeto de estudo ideal quando usando atividade de campo aberto em um estudo pré-clínico.
Introduction
Os modelos animais têm sido úteis para aprender sobre os mecanismos da doença, mas a sua utilidade em predizer a eficácia do tratamento em ensaios clínicos tem sido freqüentemente desafiada 1-3. Numerosos "promissores" estudos pré-clínicos são publicados a cada ano; No entanto, muito poucas das intervenções propostas mostram resultados positivos quando se mudou para ensaio clínico. Estas discrepâncias são frequentemente atribuídos a um viés de publicação, as conclusões excessivamente optimistas, e mal projetada e executada estudos pré-clínicos que levam a resultados irreproduzíveis 1-3.
Com os avanços atuais no desenvolvimento de medicamentos para doenças neuromusculares, há uma necessidade crescente de ensaios pré-clínicos bem desenhados. Em particular, há uma necessidade de metodologias rigorosas que podem ser realizadas de forma padronizada e cego, com validados, reprodutíveis e medidas de resultados traduzíveis. Como um membro do músculo congênita Consórcio de Doenças, como desejo de realizar estudos pré-clínicos mais rigorosos, partilhamos aqui o nosso Procedimento Operacional Padrão (POP) para Campo Aberto Atividade. Este SOP foi previamente validado 4 e publicado como parte de SOPs do TREAT-NMD para distrofia muscular de Duchenne (DMD) modelos animais 5. Temos utilizado este método para o fenótipo e testar a eficácia terapêutica de vários medicamentos em uma variedade de modelos animais de doença neuromuscular, incluindo-2J dy / J camundongos (Dy2J) Lama2, o modelo animal para distrofia muscular congênita (CMD) 6,7 . Por sua vez, este artigo é uma adaptação de nosso TREAT-NMD publicado anteriormente SOP 5.
O sistema de monitoramento de atividades de campo aberto avalia exaustivamente locomotor e os níveis de atividade de comportamento de ratos, que podem ser correlacionados com a função locomotora. O teste também é utilizado para avaliar a ansiedade como e comportamentos exploratórios 8-10. Em particular, o campo aberto é uma ferramenta útil para assessing insuficiência locomotiva em modelos animais da doença neuromuscular 11,12 e a eficácia de fármacos que podem melhorar a locomoção e / ou de função motora 6,7,13,14. A avaliação da atividade campo aberto fornece uma medida diferente do que a força muscular, o que é comumente medida com a força de preensão, e mostra como as drogas podem afetar outros sistemas do corpo (ou seja, o sistema nervoso central), bem 5. Além disso, a atividade medida campo aberto, a distância total percorrida, espelha o teste de caminhada de 6 min, uma medida do resultado do ensaio clínico, que incide sobre o desempenho do exercício submáximo e qualidade de vida 15,16. Em geral, este faz com que a atividade de campo aberto testar um desfecho secundário ou auxiliar benéfico para usar em ensaios pré-clínicos. No entanto, o sistema de monitorização de actividade campo aberto também tem desafios significativos associados. O teste é comportamental e pode ser bastante variável, uma vez que é influenciada por uma multidão de externofatores. Por exemplo, este comportamento pode ser influenciado pela unidade de exploração (isto é, a cognição), a ansiedade, a doença, o ritmo circadiano, os factores ambientais antecedentes genéticos, além de saída do motor 10. Como resultado, é imperativo para realizar esta medida de forma padronizada com um ambiente controlado. O protocolo aqui apresentado descreve o nosso aberto SOP atividade de campo em detalhe. Ele fornece procedimentos passo-a-passo e uma discussão mais aprofundada de considerações importantes para controlar as condições ambientais e ajudar a reduzir a variabilidade, os resultados típicos, análise de dados, e os pontos fortes da avaliação e fraquezas em mais detalhes.
Protocol
NOTA: Aberto campo sistema de monitorização utiliza uma actividade de campo aberto de plexiglas câmara com emissores e receptores das fotocélulas igualmente espaçados ao longo do perímetro da câmara (Figura 1). Estes emissores e receptores das fotocélulas criar uma grelha de feixes infravermelhos xy invisíveis. Quando um animal é colocado na câmara, desloca-se sobre, causando quebras feixe. Sensores verticais também estão presentes para avaliar os níveis de atividade verticais (ou seja, o comportamento de criação) também. O analisador regista a informação pausa do feixe e analisa-se rapidamente. O software, então, calcula várias medidas de atividade durante o período de tempo pré-definido. Estas medidas incluem: atividade horizontal (unidades), atividade verticais (unidades), a distância total percorrida (cm), tempo de movimento (seg), eo tempo restante (s) 5.
NOTA: Em geral, a sala de ensaios deve ser com temperatura e umidade controladas, com uma iluminação uniforme. Câmaras de teste devem ser dis uniformementetribuiu sobre o quarto e não deve ser colocado sob luz direta, cantos escuros, ou em áreas sombreadas. Todos aclimatação instrumento e ensaios devem ser realizados ao mesmo tempo em cada dia (por exemplo, na parte da manhã) e pelos mesmos indivíduos. Estes indivíduos devem ser cego para o grupo de tratamento animal, e genotipagem quando possível.
O protocolo a seguir foi realizada sob a orientação e aprovação das Crianças National Medical Center IACUC.
1 Instrumento Aclimatação
- Coloque os ratos na sala de testes em suas gaiolas para cerca de 10 min para se aclimatar. Deixe o quarto durante o período de aclimatação.
- Volte para a sala de ensaios e ligar as câmaras de atividade. Mesmo que os dados não estão sendo coletados, neste momento, isso vai imitar ainda mais o ambiente de teste.
- Remova cuidadosamente cada rato a partir de sua gaiola e imediatamente colocá-los em câmaras de ensaio. Se a actividadecâmara tem uma divisória central que divide a câmara em quadrantes (Figura 1), colocar um rato em cada quadrante vazio.
- Uma vez que todos os animais são carregados para dentro das câmaras de ensaio, colocar a tampa na parte superior da cada câmara de teste. Deixe o quarto durante este período de aclimatação.
- Após os 60 minutos, voltar para a sala. Retire a tampa de cada câmara de teste e gentilmente voltar cada rato para sua respectiva gaiola.
- Limpe cada uma das câmaras com desinfectantes e toalhas de papel. Certifique-se de que nenhuma sujeira partículas são deixados na câmara.
NOTA: Se várias sessões estão sendo executados a cada dia, limpe cuidadosamente cada uma das câmaras de teste entre cada sessão. - Repita os passos 1-6 para 4 dias consecutivos.
NOTA: Execute de aclimatação de uma semana antes da coleta inicial de dados. Se os animais são testados várias vezes ao longo de um estudo, apenas realizar a aclimatação antes da primeira rodada de testes para evitar a habituação. Além disso, atribua aleatoriamente os animais para uma novaCaixa de cada sessão. Acompanhe as atribuições de caixa durante toda a duração do estudo.
2 Coleta de Dados
- Coloque os ratos na sala de testes em suas gaiolas para 10-30 min para se aclimatar. Deixe o quarto durante este tempo.
- Após a 10-30 min, voltar para a sala de ensaios. Ligue as câmaras de atividade e abrir o software que acompanha o computador ligado para as câmaras. Se a câmara contém um divisor de quadrante, inserir a partição neste momento.
NOTA: Se a câmara de ensaio contém um divisor de quadrante, de dois animais pode ser colocado na câmara de ensaio durante a recolha de dados. Um animal pode ser colocado no quadrante frontal esquerdo e uma no quadrante traseiro direito (Figura 1).
NOTA: Não coloque os animais em todos os quatro quadrantes durante a coleta de dados ou na mesma linha ou coluna. Colocando os animais nestas orientações irá interferir com a grade xy de raios infravermelhos e o movimento de animais seráimprecisamente medido. - Configure o software de computador para realizar uma verificação prebeam. Esta configuração irá permitir uma para executar uma verificação de pré-viga, seguindo a configuração experimental e antes da inserção dos animais nas câmaras de teste (ver abaixo).
NOTA: Quando o cheque prebeam é executado, o software de computador avalia a função dos raios infravermelhos xy. Por exemplo, é possível determinar se os emissores e receptores de células fotoeléctricas estão bloqueados e incapazes de detectar apropriadamente circulação no interior da câmara. - Defina os parâmetros de coleta de dados primários no software de computador para coletar seis mínimo 10 blocos de dados (ou seja, coletar dados para um total de 60 min), e em seguida, digite os números de data, nome de arquivo e rato ID adequadas.
- Uma vez que todos os parâmetros são definidos, executar a verificação prebeam. Se a câmara não passar no prebeam verificá-lo é provavelmente devido a mau alinhamento do divisor de centro quadrante ou câmara de teste. Se isso acontecer, realinhar a divi centro quadranteder e câmara de ensaio até que os sensores são não bloqueados e o sistema declara que a câmara de ensaio é preparado. Se isso não corrigir o problema, fazer referência ao manual do instrumento.
- Quando todas as câmaras de teste estiver pronto, retire delicadamente o rato a partir de sua gaiola e imediatamente colocar ele ou ela para dentro da câmara de teste. Observe a identificação do mouse e verifique se corresponde a uma entrada em computador.
- Uma vez que todos os animais são apropriadamente carregadas nas câmaras de ensaio, colocar a tampa na parte superior da cada câmara. Em seguida, selecione o comando apropriado no software de computador para iniciar a coleta de dados. Neste momento, o programa de computador analisador e iniciará os níveis de actividade de gravação de acordo com os parâmetros de recolha de dados.
- Deixar a sala de teste durante o restante do período de teste.
- Após a conclusão do período de teste (ou seja, 60 minutos mais tarde), retornar imediatamente para a sala de testes. Salve os dados, e depois voltar cada animal a seu respeitogaiola ive.
- Limpe todas as unidades com um desinfectante e toalhas de papel.
NOTA: Se várias sessões estão sendo executados a cada dia, limpe cuidadosamente cada uma das câmaras de teste entre cada sessão. - Exportar dados para uma planilha e, em seguida, sair do programa de software.
- Verifique os dados para garantir que eles foram registrados. Se os dados não foram gravadas, ou os animais dormiu durante toda a totalidade do período de coleta de dados, realizar um dia extra de coleta de dados.
NOTA: Um animal é considerado "adormecido" se ele não se move ao longo de toda a duração do teste de 60 min. - Repita os passos 2,1-2,12 durante 4 dias consecutivos.
NOTA: Se os animais são testados em vários momentos ao longo da duração de um estudo, não realizar medições de atividade de campo aberto mais do que uma vez por mês para evitar a habituação. Além disso, atribua aleatoriamente os animais para uma nova caixa de cada sessão. Acompanhe as atribuições de caixa durante toda a duração do estudo.
Análise 3. Dados
- Calcular a atividade média horizontal (unidades), atividade verticais (unidades), a distância total percorrida (cm), tempo de movimento (seg), eo tempo restante (s) por rato e do grupo. O software calcula e informa o total da actividade horizontal (unidades), atividade verticais (unidades), a distância total percorrida (cm), tempo de movimento (seg), eo tempo restante (s) durante o período de coleta de dados (ou seja, 60 min) para cada rato. Calcula-se a média para cada um dos parâmetros acima mencionados a partir de 4 dias de recolha de dados.
- Antes de realizar quaisquer análises estatísticas, avaliar a normalidade dos dados através do teste de Shapiro-Wilk, e verificar a existência de valores atípicos, utilizando o teste do Grubb. Remova todos os outliers significativos (p <0,05).
- Para os dados com distribuição normal, a comparação de médias entre os grupos utilizando um teste t para amostras independentes ou uma análise de variância e teste post-hoc com valores de p ajustado para comparações múltiplas dependemção no número total de grupos de tratamento.
- Para os dados com distribuição não normal, comparar os valores médios entre os grupos que utilizam tanto o teste de Wilcoxon, ou um teste de teste e classificação soma Kruskal-Wallis, com o consequente p-valores ajustados para comparações múltiplas, dependendo do número total de grupos de tratamento.
Representative Results
Ao analisar os dados da atividade de campo aberto, nos concentramos em algumas medidas selecionadas que proporcionam uma avaliação do nível de atividade que geralmente refletem função locomotora. Esses parâmetros incluem: atividade horizontal, atividade vertical, tempo de movimento, tempo de descanso, e distância total percorrida. Em geral, os animais com redução da função muscular será menos ativo e ter menor atividade ambulatorial. Isso é geralmente associado com a diminuição da atividade horizontal, atividade vertical, distância percorrida e do tempo total de movimento e maior tempo de descanso 5,6,12,17. Pelo contrário, os animais com a função muscular intacto ou aqueles tratados com agentes terapêuticos que diminuem a progressão da deterioração da patologia muscular são mais propensos a exibir níveis mais elevados de actividade 6,7,14,17.
Para mostrar um exemplo de resultados típicos obtidos utilizando este protocolo em modelos animais de doença neuromuscular, que forneceu dados de um estudo longitudinal we previamente realizado na distrofia muscular congênita (CMD) modelo animal 6 Dy2J. Em resumo, o modelo Dy2J contém uma forma truncada do gene LAMA2 que resulta em paralisia dos membros posteriores, a desmielinização, e alterações distróficas musculares esqueléticas. O impacto desta patologia muscular nos níveis de atividade é observado nesses camundongos. Por exemplo, os ratos Dy2J no estudo tenderam a apresentar menores níveis de atividade horizontais e menos distância percorrida, em relação à sua idade e BL / 6 controles do tipo selvagem pareados por gênero durante toda a duração do estudo (Figura 2); no entanto, estas diferenças não foram sempre significativas. A falta de significado é mais provável devido ao pequeno tamanho da amostra e alta variação intra-grupo nos dados BL6. A variação é típica de dados actividade campo aberto; No entanto, estes dados, em particular, a falta de energia suficiente para determinar se estes grupos são estatisticamente diferentes um do outro. Tipicamente, um n = 10-12 deve ser usada para detectar statistically diferenças significativas 5,17. Por exemplo, quando uma amostra maior é usado, tal como foi feito no estudo SJL (ver a segunda barra BL6 nas Figuras 3B, 3D, 3E e) diferenças significativas entre os grupos pode ser observada. Os animais Dy2J também mostrou uma perda completa de actividade níveis verticais, que reflectia a paralisia dos membros posteriores, e por sua vez, uma incapacidade para a retaguarda (Figura 2B) 6. Por último, é importante notar as diferenças entre os sexos nos níveis de atividade. Por exemplo, as mulheres tendem a ser mais ativos do que os homens, apresentando níveis mais elevados de atividade horizontal, atividade vertical e distância total percorrida (Figura 2); No entanto, estas diferenças não foram estatisticamente significativas.
Nós também fornecemos dados de vários estudos anteriores realizados em outros modelos animais de doenças neuromusculares, bem como para destacar vários fatores adicionais que afetam o atoníveis ivity (Figura 3). Por exemplo, os níveis de atividade variam de acordo com o fundo genético 10. BL10 ratinhos do tipo selvagem apresentam uma maior actividade horizontal, actividade vertical e a distância total percorrida em relação à idade e sexo do BL6 em ratinhos de tipo selvagem (Figura 3). Esta é uma observação importante notar, como utilizar as cepas de controle incorretas em um estudo pode tornar os dados inutilizáveis. Em segundo lugar, os níveis de atividade variam de acordo com modelo de doença e fenótipo (Figura 3). Por exemplo, o ratinho SJL, o modelo animal para distrofia muscular do membro cinto-2B (DMC-2B), mostra o nível mais baixo de actividade horizontal e a distância total percorrida, seguido do rato Dy2J e o rato mdx, um modelo animal para distrofia distrofia muscular (Figuras 3A, 3C). No entanto, os ratinhos Dy2J, por causa da sua paralisia dos membros posteriores, exibir o nível mais baixo de actividade vertical (Figura 3B). Também é importante notar que o nível mais elevado deactividade no fenótipo mdx é provavelmente atribuído ao aumento do nível do fundo estirpe BL10 actividade. Finalmente, esta figura destaca a importância de animal Idade / doença patologia no momento do teste. Por exemplo, com 30 semanas de idade, não há diferenças pode ser detectada nos níveis de actividade entre os ratos mdx e sua idade e sexo correspondentes BL10 controlos de tipo selvagem (Figura 3). No entanto, com 6 semanas de idade, em torno do pico de fase necrótico no modelo MDX rato, ratos mdx exibir uma diminuição significativa da actividade vertical, horizontal e de actividade. A redução é também observada para a distância total percorrida, mas esta diferença não é significativa (Figura 3) 4.
Figura 1: Abrir aparelhos de atividades de campo. Dois campo aberto com aparelhos centro quadradivisores NT, e tops. Se divisores quadrante central removível estão presentes, os animais só devem ser colocados na parte frontal esquerda (1, 3) e volta câmaras direitas (2, 4) de cada caixa durante os testes para obter leituras válidas.
Figura 2. dados de atividade de campo aberto. Dados de atividade campo aberto típicas para Dy2J (linha cinza, n = 3) e por idade e sexo do estirpe de controlo BL6 (linha preta, n = 3) ratos em 14, 19, 23, 25, e 30 semanas de idade (A - F) a) Actividade Horizontal (unidades arbitrárias) do sexo masculino, B) de atividade Horizontal (unidades arbitrárias) do sexo feminino, C) atividade Vertical (unidades arbitrárias) do sexo masculino, D) de atividade Vertical (unidades arbitrárias) do feminino. E) trave Distância totalled (cm) do sexo masculino, E) A distância total percorrida (cm) do sexo feminino. Os dados foram coletados ao longo de 4 dias consecutivos, com uma média por rato e do grupo. Os mesmos ratinhos foram ensaiados em cada ponto de tempo. Os dados representam a média ± SEM. Os dados anteriormente publicados 6. Camundongos Dy2J e BL6 foram comparados com um teste t para amostras independentes em cada ponto de tempo. Um valor de p <0,05 foi considerado significativo. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Figura 3 Abra o campo de dados de atividade múltiplas cepas dados comportamentais típicos da atividade de BL10 masculino (6 semanas de idade, n = 8; 25-30 semanas de idade, n = 10)., MDX (6 semanas de idade, n = 9; 25-30 semanas de idade, n = 15), BL6 (grupo de controlo para os ratos Dy2J, n = 3, grupo de controlo de murganhos da estirpe SJL, n = 13), Dy2J (n = 3), e da estirpe SJL (n = 13) ratinhos em varying idades dados de BL10 e camundongos mdx com 6 e 25-30 semanas de idade. A) atividade Horizontal (unidades arbitrárias), B) atividade Horizontal (unidades arbitrárias) dados de BL6, Dy2J e SJL a 25-30 semanas de idade dados de camundongos BL10 e MDX em 6 e 25-30 semanas de idade dados de camundongos BL6, Dy2J e SJL a 25-30 semanas de idade, C) atividade Vertical (unidades arbitrárias), D) atividade Vertical (unidades arbitrárias) , E) A distância total percorrida (cm) dados de BL10 e camundongos mdx com 6 e 25-30 semanas de idade, e F) A distância total percorrida (cm) de dados de camundongos BL6, Dy2J e SJL a 25-30 semanas de idade . Dy2J, modelo animal para CMD com mutação do gene laminina α2 no fundo BL6; SJL, modelo animal para cinto membro da distrofia muscular-2B (DMC-2B); mdx, modelo animal para a DMD no fundo BL10. Não há controle SJL disferlina-suficiente. Os dados são médias ± SEM. B, C e D contêm dados anteriormente publiderramado 6,17. Os dados não apresentaram distribuição normal; Portanto, os dados foram comparados através de um teste somas de Wilcoxon. Um valor-p de p <0,05 foi considerado significativo. As seguintes comparações foram feitas para cada parâmetro: a) BL10 e camundongos mdx com 6 semanas de idade, p <0,05; b) BL10 e camundongos mdx em 25-30 semanas de idade, não significativo; c) Dy2J e BL6 combinados estirpe de ratos de controlo em 25-30 semanas de idade, p <0,05; d) e SJL BL6 combinados estirpe de controlo em 25-30 semanas de idade, p <0,001; e) BL10 ratinhos com 25-30 semanas de idade e BL6 (grupo de controlo para Dy2J ratinhos) ratos com 25 semanas de idade, p <0,01; f) BL10 em 25-30 semanas de idade e BL6 (grupo controle para SJL ratos) em 25-30 semanas de idade, p <0,001.
Discussion
A medição da actividade no campo aberto é um ensaio in vivo que pode ser útil para avaliar a progressão da doença e da eficácia de drogas em modelos animais da doença neuromuscular 6,7,11-14. Como mostrado na Figura 2, que fornece uma avaliação dos níveis de actividade que, geralmente, reflectem função locomotora. Esta é uma medida diferente do que a força muscular, tornando-se um desfecho secundário ou auxiliar ideal para executar em um estudo pré-clínico de drogas. Além disso, é de 15, medida não invasiva clinicamente relevante, que pode ser realizada várias vezes ao longo da duração do estudo. No entanto, a atividade comportamental e locomotiva também é influenciada por fatores adicionais também (ou seja, manipulação experimentador, condições ambientais, e cognição) criando variação nos dados de atividade de campo aberto. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo bem testado e padronizada que reduz a variação e permite que os resultados sejam compared em vários laboratórios, na esperança de melhorar a tradução dentro de nosso campo.
A principal desvantagem desta medida é que ele é altamente variável e influenciada por numerosos fatores externos. No entanto, levamos isso em consideração ao desenvolver o protocolo. Avaliamos uma variedade de protocolos de ensaio que variam em duração de 1-5 dias de coleta de dados. No fim, determinou-se que a realização instrumento de aclimatação antes da coleta de dados para familiarizar os animais com o meio ambiente câmara de teste e execução de 4 dias de coleta de dados reduziu significativamente a quantidade de variação nos dados de resultados 5. Este protocolo foi originalmente concebido para avaliar os níveis de atividade comportamental e locomotivas do modelo MDX do mouse; no entanto, este protocolo foi recentemente validado no modelo animal Dy2J bem 6. Sugere-se que o protocolo ser normalizado dentro de seu laboratório para cada modelo animal antes de usá-lo em um ensaio pré-clínico.
Atividade de campo aberto varia de acordo com o fundo genético 17, sex 18-20, 18 anos, e ritmo circadiano 21. Isso exige que os animais da mesma idade, sexo e antecedentes genéticos a serem avaliados ao mesmo tempo. Durante as etapas de planejamento, o pensamento cuidadoso deve ser colocado em decidir em que idade ou idades campo aberto atividade níveis serão avaliados. Cada modelo animal tem a sua própria progressão da doença e do fenótipo distinto locomotiva e comportamental, que variam em gravidade e da idade 6,15 (Figura 2 e Figura 3). Portanto, é importante para determinar os pontos de tempo clinicamente e patologicamente relevantes para avaliar a actividade medidas de campo abertas. O número total de animais necessários em cada grupo de tratamento para detectar diferenças estatisticamente significativas varia consoante o modelo animal, idade, e sexo, assim. Consequentemente, os cálculos do tamanho da amostra relevantes também deve ser realizada durante a fase de planejamento para determine o número total de animais necessários em cada grupo de tratamento para detectar diferenças estatisticamente significativas. Estes cálculos também deve levar em consideração adicional medidas de resultados utilizadas no estudo (por exemplo, medidas de força de preensão ou análise histológica). Com base em nossos cálculos de potência, que normalmente usam 10-12 animais por grupo de tratamento. Além disso, especial atenção deve ser dada para o esforço de controle é usada no estudo. Há uma tendência para que as estirpes de controlo impróprias para ser usado em estudos pré-clínicos. Por exemplo, os ratos BL6 são muitas vezes utilizados como uma estirpe de controlo de camundongos mdx; no entanto, o camundongo mdx está em um fundo BL10. Como visto na Figura 3, os ratos BL10 são muito mais ativos do que os camundongos BL6, o que torna impossível comparar os dados MDX e BL6. Quando a realização de estudos pré-clínicos com ratinhos mdx, ratinhos BL10 deve ser usada como a estirpe de controlo. Além disso, se um estudo está a ser realizado com os ratinhos Dy2J, ratinhos BL6 deve ser usada como a contrestirpe ol.
Pequenas mudanças ambientais também podem afetar significativamente os níveis de atividade. Estes incluem iluminação, temperatura, umidade, odor, ruído e 4,15 atividade humana. Portanto, é muito importante que o teste ser realizado em uma sala com temperatura controlada e umidade com iluminação não-direta, ao mesmo tempo, cada dia 5. As câmaras de ensaio devem ser espaçadas uniformemente por toda a sala e não colocado sob luz direta ou em sombra ou escuros cantos 5. Os animais devem ser repartidos aleatoriamente suas câmaras de teste a cada dia para reduzir os efeitos da variação das condições ambientais em toda a sala, e eles devem ser autorizados a se aclimatar para a sala de ensaios para 10-30 min antes da coleta de dados. Certifique-se de acompanhar a atribuição de caixa de cada animal durante toda a duração do estudo para garantir que qualquer influência de caixa / ambiente é distribuído igualmente entre os diferentes grupos de tratamento. Os indivíduos que carregam o animals para as câmaras de teste e manejo dos animais durante todo o período de duração do estudo deve ser cego para o grupo de tratamento e, quando possível estirpe animal. Em muitos casos genótipos afetados são marcadamente diferentes controles relacionados e cegueira não é possível. No entanto, as pessoas devem sempre ser cega entre os grupos tratados e não tratados. Além disso, todas as pessoas devem sair da sala durante a coleta de dados para reduzir o ruído e as distrações dentro da sala, e todas as câmaras devem ser cuidadosamente limpos após cada sessão de coleta de dados. Estas acções irão reduzir significativamente a variação nos dados. É importante notar que os animais também são altamente susceptíveis a adaptação 15. Portanto, sugere-se que os animais sejam removidos da câmara de ensaio directamente a seguir a 60 minutos de cada dia de recolha de dados, e que os níveis de actividade de campo aberto ser avaliado mais do que uma vez por mês.
A distância total percorrida eo movimento total demedições de tempo mento tendem a ser o campo aberto mais sensíveis medições de atividade 5. No modelo Dy2J, a medição da actividade vertical, tende a ser a medida de actividade mais sensível campo aberto (Figura 3); no entanto, pode ser difícil para capturar as medições da actividade verticais precisos em animais pequenos. Por exemplo, é possível que um animal menor irá apresentar um comportamento de criação e o sensor não vai capturá-lo devido à altura do sensor vertical. Como resultado, recomendamos que os animais de teste antes das 5 semanas de idade. Também é possível que um animal vai dormir durante toda a duração de uma sessão de recolha de dados. Se este for o caso, é conveniente acrescentar mais um dia de coleta de dados. Finalmente, o mau alinhamento do divisor de quadrante ou bloqueio dos sensores no interior da caixa pode resultar em dados incorrectos bem. Portanto, é muito importante para realizar um pré-verificação do sensor, antes do teste, e rever todos os dados a seguir ao final dacada sessão de coleta de dados.
Cuidado também deve ser tomado quando se analisa os dados da atividade de campo aberto. Dados Abertos atividade de campo tem uma tendência a ser normalmente não distribuídos e têm valores atípicos 4. Antes de realizar quaisquer análises estatísticas, os nossos biostatisticians recomendo verificar a normalidade dos dados e valores discrepantes. Se os dados não são distribuídos normalmente, deve-se considerar a utilização de um teste não paramétrico quando se comparam os meios. Além disso, todos os dados deveriam ser analisados por uma pessoa cega para o que os grupos de tratamento são.
No geral, a medida atividade de campo aberto tem grandes vantagens: a) é uma avaliação abrangente de ambos a atividade locomotora e comportamental, que é fortemente, mas nem sempre correlacionada com função locomotora; b) é uma medida de fácil execução; c) que não necessita de manejo dos animais durante os testes; d) que é uma medida não invasivo que pode ser realizado mais do que uma vez durante todo o período de um study; e) nenhum treinamento especial é necessário para realizar o teste; f) vários animais pode ser testado de uma só vez; e g) é uma medida de resultado clinicamente relevante 5,16. No entanto, ao testar terapêutica, tenha em mente que outros fatores podem afetar o comportamento de um animal, e por sua vez as medições de atividade de campo aberto. Os medicamentos podem ter SNC ou outros efeitos e largura do corpo, e comportamento também pode ser influenciada por um ambiente de tensão. Como resultado, pode ser difícil distinguir se as alterações nos níveis de actividade locomotora ou comportamentais estão relacionadas com alterações da função muscular, força muscular, ou é um resultado dos efeitos adversos da medicação. Portanto, ensaios funcionais, histológicas e moleculares ou adicionais devem ser realizados também. Este protocolo padronizado também tem sido utilizada com sucesso em outras doenças musculares 4,17; No entanto, como pode ser visto na Figura 3, os estudos-piloto deve ser realizado inicialmente para avaliar a sensibilidade da medida no animalmodelo.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta publicação é financiada através Cure CMD, Francês Muscular Distrofia Association (AFM), uma bolsa de investigação de translação da Associação de Distrofia Muscular, Os Institutos Nacionais de Saúde (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), o Departamento de Defesa ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) e uma subvenção piloto de Pais Projeto Distrofia Muscular ( PPMD).
Este papel é um dos vários em uma série de POPs para metodologias utilizadas rotineiramente na área doença muscular congênita. Ele reflete os esforços discutido e estabelecido por mais de 20 especialistas na área de doença muscular congênita na recente muscular congênita Doença Consórcio Oficina, realizada em abril de 2013, em Washington, DC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (potassium peroxymonosulfate/ sodium chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 | |
References
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