Summary
Los niveles de actividad en campo abierto se utilizan para evaluar los niveles de actividad locomotora y de comportamiento. Este protocolo proporciona un bien diseñado, protocolo estandarizado para su uso en ensayos preclínicos de trastornos neuromusculares.
Abstract
El sistema de monitoreo de la actividad de campo abierto evalúa exhaustivamente locomotora y los niveles de actividad de comportamiento de los ratones. Es una herramienta útil para evaluar el deterioro locomotora en modelos animales de enfermedad neuromuscular y eficacia de los fármacos terapéuticos que pueden mejorar la función de locomoción y / o músculo. La medición de la actividad de campo abierto ofrece una medida diferente de la fuerza muscular, que es comúnmente evaluada por mediciones de fuerza de agarre. También puede mostrar cómo las drogas pueden afectar a otros sistemas del cuerpo, así cuando se utiliza con medidas de resultado adicionales. Además, medidas tales como la distancia total recorrida reflejan la prueba de marcha de 6 min, una medida de resultado de ensayos clínicos. Sin embargo, el monitoreo de actividades de campo abierto también se asocia a importantes desafíos: mediciones de la actividad de campo abierto varían según la cepa animal, la edad, el sexo, y el ritmo circadiano. Además, temperatura ambiente, humedad, iluminación, ruido, e incluso olor pueden afectar los resultados de evaluación. En general, este manuscript ofrece un SOP actividad en campo abierto bien probado y estandarizado para los ensayos preclínicos en modelos animales de enfermedades neuromusculares. Proporcionamos una discusión de consideraciones importantes, los resultados típicos, análisis de datos, así como información de las fortalezas y debilidades de las pruebas de campo abierto. Además, proporcionamos recomendaciones para el diseño óptimo de estudio cuando se utiliza la actividad en campo abierto en un ensayo preclínico.
Introduction
Los modelos animales han sido útiles para el aprendizaje de mecanismos de la enfermedad, pero su utilidad en la predicción de la eficacia del tratamiento en los ensayos clínicos con frecuencia ha sido desafiada 1-3. Se publican numerosos estudios preclínicos "prometedoras" cada año; Sin embargo, muy pocas de las intervenciones propuestas muestran resultados positivos cuando se trasladó a ensayo clínico. Estas discrepancias se suelen atribuir a un sesgo de publicación, conclusiones demasiado optimistas, y mal diseñados y ejecutados los estudios pre-clínicos que conducen a resultados irreproducibles 1-3.
Con los avances actuales en el desarrollo de fármacos para los trastornos neuromusculares, hay una creciente necesidad de ensayos preclínicos bien diseñados. En particular, hay una necesidad de metodologías rigurosas que se pueden llevar a cabo de una manera estandarizada y ciego, con validados, y las medidas de resultado traducibles reproducibles. Como miembro de la muscular congénita Consorcio de Enfermedades, conel deseo de llevar a cabo estudios preclínicos más rigurosos, compartimos aquí nuestra Procedimiento Operativo Estándar (POE) para el Open Field Activity. Este SOP fue previamente validada 4 y publicado como parte de los PNT de TREAT-NMD para distrofia muscular de Duchenne (DMD) modelos animales 5. Hemos utilizado esta metodología para el fenotipo y probar la eficacia terapéutica de numerosos fármacos en una variedad de modelos animales de enfermedad neuromuscular, incluyendo-2J dy / J (Dy2J) ratones Lama2, el modelo animal de la distrofia muscular congénita (CMD) 6,7 . A su vez, este artículo es una adaptación de nuestra TREAT-NMD publicado previamente SOP 5.
El sistema de monitorización de la actividad en campo abierto evalúa exhaustivamente la locomotora y los niveles de actividad de comportamiento de los ratones, que se pueden correlacionar con la función locomotora. La prueba también se usa ampliamente para evaluar la ansiedad como y comportamientos exploratorios 8-10. En particular, el campo abierto es una herramienta útil para el culoessing deterioro locomotora en modelos animales de enfermedad neuromuscular 11,12 y la eficacia de fármacos terapéuticos que pueden mejorar la locomoción y / o función de motor 6,7,13,14. La evaluación de la actividad de campo abierto ofrece una medida diferente de la fuerza muscular, que se mide comúnmente con la fuerza de agarre, y muestra cómo las drogas pueden afectar a otros sistemas del cuerpo (es decir, el sistema nervioso central) y 5. Además, el campo abierto actividad medida, distancia total recorrida, refleja la prueba de marcha de 6 min, una medida de resultado de ensayos clínicos, que se centra en el rendimiento del ejercicio submáximo y calidad de vida 15,16. En general, esto hace que la actividad en campo abierto probar una medida de resultado secundaria o auxiliar beneficioso utilizar en los ensayos preclínicos. Sin embargo, el sistema de monitorización de la actividad de campo abierto también tiene importantes desafíos asociados. La prueba es conductual y puede ser bastante variable, ya que está influenciado por una multitud de externafactores. Por ejemplo, este comportamiento puede ser influenciada por la unidad de exploración (es decir, la cognición), la ansiedad, la enfermedad, el ritmo circadiano, los factores ambientales, los antecedentes genéticos, además de salida del motor 10. Como resultado de ello, es imperativo llevar a cabo esta medida de forma estandarizada con un ambiente controlado. El protocolo que aquí se presenta describe nuestra actividad en campo abierto SOP en detalle. Proporciona procedimientos paso a paso y más discusión de consideraciones importantes para el control de las condiciones ambientales y ayudar a reducir la variabilidad, los resultados típicos, análisis de datos, y los puntos fuertes de la evaluación y debilidades con más detalle.
Protocol
NOTA: Open sistema de monitorización de la actividad de campo utiliza un campo abierto cámara de plexiglás con emisores y receptores de las fotocélulas igualmente espaciados a lo largo del perímetro de la cámara (Figura 1). Estos emisores y receptores de las fotocélulas crean una cuadrícula xy de rayos infrarrojos invisibles. Cuando un animal se coloca en la cámara, se mueve alrededor, provocando roturas de haz. Sensores verticales también están presentes para evaluar los niveles de actividad verticales (es decir, la conducta de crianza) también. El analizador registra la información de corte de haz y rápidamente analiza. El software calcula entonces varias medidas de la actividad durante el período de tiempo preestablecido. Estas medidas incluyen: la actividad horizontal (unidades), de actividad verticales (unidades), distancia total recorrida (cm), el tiempo de movimiento (s), y el tiempo de descanso (s) 5.
NOTA: En general, la sala de pruebas debe ser la temperatura y humedad controlada, con una iluminación uniforme. Cámaras de prueba deben ser uniformemente discontribuido a la habitación y no debe ser colocado en la luz directa, rincones oscuros, o zonas de sombra. Todos aclimatación y pruebas instrumento deben realizarse a la misma hora cada día (por ejemplo, por la mañana) y por los mismos individuos. Estas personas deben estar cegados al grupo de tratamiento de los animales, y el genotipo cuando sea posible.
El siguiente protocolo se ha realizado bajo la dirección y aprobación de Infantil del Centro Médico Nacional IACUC.
1. Instrumento Aclimatación
- Coloca los ratones en la sala de pruebas en sus jaulas durante aproximadamente 10 minutos para aclimatarse. Sal de la habitación durante el período de aclimatación.
- Regreso a la sala de pruebas y encender las cámaras de actividad. A pesar de que los datos no están siendo recogidos en este momento, esto imitar aún más el entorno de pruebas.
- Retire con cuidado cada ratón de su jaula e inmediatamente colocarlos en los recipientes de ensayo. Si la actividadcámara contiene un divisor central que divide la cámara en cuadrantes (Figura 1), colocar un ratón en cada cuadrante vacío.
- Una vez que todos los animales se cargan en las cámaras de prueba, coloque la tapa en la parte superior de cada cámara de prueba. Sal de la habitación durante este tiempo de aclimatación.
- Tras la 60 min, volver a la habitación. Retire la tapa de cada cámara de prueba y volver suavemente cada ratón a su respectiva jaula.
- Limpie cada cámara con desinfectantes y toallas de papel. Asegúrese de no suciedad partículas se quedan en la cámara.
NOTA: Si varias sesiones se ejecutan cada día, limpiar a fondo cada cámara de prueba entre cada sesión. - Repita los pasos 1-6 para 4 días consecutivos.
NOTA: Realice la aclimatación de una semana antes de la recogida de datos inicial. Si los animales se prueban varias veces durante un estudio, sólo realizar la aclimatación antes de la primera ronda de pruebas para evitar la habituación. Además, asignar al azar a los animales a una nuevacaja de cada sesión. Seguimiento de las asignaciones de la caja durante toda la duración del estudio.
2. Data Collection
- Coloca los ratones en la sala de pruebas en sus jaulas durante 10-30 min para aclimatarse. Sal de la habitación durante este tiempo.
- Tras el 10-30 min, volver a la sala de pruebas. Encienda las cámaras de actividad y abra el software que acompaña en el ordenador conectado a las cámaras. Si la cámara contiene un divisor de cuadrante, inserte la partición en este momento.
NOTA: Si la cámara de prueba contiene un divisor de cuadrante, dos animales pueden ser colocados en la cámara de prueba durante la recogida de datos. Un animal puede ser colocado en el cuadrante frontal izquierdo y uno en el cuadrante posterior derecha (Figura 1).
NOTA: No coloque animales en los cuatro cuadrantes durante la recolección de datos o en la misma fila o columna. La colocación de los animales en estas orientaciones se interfiere con la cuadrícula xy de rayos infrarrojos y el movimiento de los animales seráerróneamente medido. - Configure el software de computadora para realizar una comprobación de prebeam. Esta configuración permitirá que uno ejecute una comprobación previa a la viga después de la configuración experimental y antes de la inserción de los animales en las cámaras de ensayo (véase más adelante).
NOTA: Cuando el cheque prebeam se ejecuta, el software evalúa la función de los rayos infrarrojos xy. Por ejemplo, se puede determinar si los emisores de las fotocélulas y los receptores están bloqueados y no puede detectar correctamente el movimiento dentro de la cámara. - Establezca los parámetros de recopilación de datos primarios en el software de computadora para recoger seis bloques de 10 min de los datos (es decir, reunir datos para un total de 60 minutos), a continuación, introduzca los números de la fecha, nombre de archivo, y el ratón de identificación correspondientes.
- Una vez que todos los parámetros se establecen, ejecutar la verificación prebeam. Si una cámara no pasa la verificación prebeam es más probable debido a la mala alineación del divisor central cuadrante o cámara de prueba. Si esto sucede, vuelva a alinear la divi centro cuadranteder y cámara de prueba hasta que los sensores ya no son comandos y el sistema establece que la cámara de prueba está lista. Si esto no corrige el problema, haga referencia al manual del instrumento.
- Cuando todas las cámaras de prueba están listos, retire suavemente el ratón de su jaula y de inmediato se le debe colocar en la cámara de prueba. Tenga en cuenta el ID del ratón y asegúrese de que coincide con la introducida en el ordenador.
- Una vez que todos los animales están cargados adecuadamente en las cámaras de prueba, coloque la tapa en la parte superior de cada cámara. A continuación, seleccione el comando adecuado en el software de computadora para iniciar la recopilación de datos. En este momento, el software del analizador y el ordenador se iniciará niveles de actividad de grabación de acuerdo a los parámetros de recogida de datos.
- Deja la sala de pruebas para el resto del período de prueba.
- Al finalizar el período de prueba (es decir, 60 minutos más tarde), inmediatamente volver a la sala de pruebas. Guarde los datos, y luego regresar cada animal a su respetojaula ive.
- Limpie todas las unidades con un desinfectante y toallas de papel.
NOTA: Si varias sesiones se ejecutan cada día, limpiar a fondo cada cámara de prueba entre cada sesión. - Exportar datos a una hoja de cálculo y luego salga del programa de software.
- Compruebe los datos para asegurarse de que se registraron. Si no se registraron los datos, o los animales dormían largo de la totalidad del período de tiempo de recogida de datos, lleve a cabo un día extra de recogida de datos.
NOTA: Un animal se considera que está "dormido" si no se mueve a lo largo de toda la duración de la prueba 60 min. - Repita los pasos 2.1 a 2.12 por 4 días consecutivos.
NOTA: Si los animales se ponen a prueba en múltiples puntos de tiempo a lo largo de la duración de un estudio, no se realizan mediciones de la actividad de campo abierto más de una vez al mes para evitar la habituación. Además, asignar al azar a los animales a una nueva caja de cada sesión. Seguimiento de las asignaciones de la caja durante toda la duración del estudio.
Análisis de datos 3.
- Calcular la actividad media horizontal (unidades), la actividad verticales (unidades), la distancia total recorrida (cm), tiempo de movimiento (sec), y el tiempo de descanso (SEC) por ratón y de grupo. El software de ordenador calcula y reporta la actividad total horizontal (unidades), la actividad vertical (unidades), la distancia total recorrida (cm), tiempo de movimiento (sec), y el tiempo de descanso (seg) durante el período de recogida de datos (es decir, 60 min) para cada ratón. Calcular la media para cada uno de los parámetros antes mencionados de los 4 días de la recolección de datos.
- Antes de realizar cualquier análisis estadísticos, evaluar la normalidad de los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y comprobar si hay valores atípicos utilizando la prueba de la Grubb. Retire todos los valores atípicos significativos (p <0,05).
- Para los datos de distribución normal, la comparación de medias entre los grupos que recibían una muestra independiente t-test o ANOVA de una vía y el test post-hoc con los valores p ajustados para comparaciones múltiples dependeráning en el número total de grupos de tratamiento.
- Para los datos de los no-normalmente distribuidos, comparar los valores medios entre los grupos que recibían la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, o una prueba de ensayo y de suma de rangos de Kruskal-Wallis con el resultado de los valores p ajustados para comparaciones múltiples, dependiendo del número total de grupos de tratamiento.
Representative Results
Al analizar los datos de actividad en campo abierto, nos centramos en algunas mediciones selectas que proporcionan una evaluación de los niveles de actividad que en general reflejan la función locomotora. Estos parámetros incluyen: actividad horizontal, la actividad vertical, tiempo de movimiento, tiempo de descanso, y la distancia total recorrida. En general, los animales con la función muscular reducida serán menos activos y tienen la actividad ambulatoria inferior. Esto se asocia generalmente con la disminución de la actividad horizontal, la actividad vertical, la distancia recorrida y el tiempo total de movimiento, y el aumento de tiempo de descanso 5,6,12,17. Por el contrario, los animales con la función muscular intacta o los tratados con terapias que disminuyen la progresión del deterioro de la patología muscular son más propensos a mostrar mayores niveles de actividad 6,7,14,17.
Para mostrar un ejemplo de los resultados típicos obtenidos con este protocolo en los modelos animales de enfermedad neuromuscular, proporcionamos datos de un estudio longitudinal we realizado previamente en la Dy2J distrofia muscular congénita (CMD) modelo animal 6. En resumen, el modelo Dy2J contiene una forma truncada del gen Lama2 que resulta en la parálisis de las extremidades posteriores, desmielinización, y cambios distróficos del músculo esquelético. El impacto de esta patología muscular en los niveles de actividad se observa en estos ratones. Por ejemplo, los ratones Dy2J en el estudio tendieron a exhibir niveles de actividad horizontales inferiores, y menos la distancia recorrida, en comparación con su edad y BL / 6 de tipo salvaje controles emparejados por sexo durante toda la duración del estudio (Figura 2); Sin embargo, estas diferencias no siempre fueron significativos. La falta de significación es más probable debido al tamaño de muestra pequeño, y alta variación intra grupo en los datos BL6. La variación es típica de campo abierto datos de la actividad; Sin embargo, estos datos, en particular, la falta de potencia suficiente para determinar si estos grupos son estadísticamente diferentes uno de otro. Normalmente, un n = 10-12 se debe utilizar para detectar statistically diferencias significativas 5,17. Por ejemplo, cuando se utiliza un tamaño de muestra más grande, como se hizo en el estudio SJL (ver la segunda barra BL6 en las Figuras 3B, 3D y 3E) se pueden observar diferencias significativas entre los grupos. Los animales Dy2J también mostraron una pérdida completa de los niveles de actividad verticales, que refleja su parálisis de las extremidades posteriores, y, a su vez, una incapacidad para posterior (Figura 2B) 6. Por último, es importante tener en cuenta las diferencias de sexo en los niveles de actividad. Por ejemplo, las mujeres tienden a ser más activos que los machos, se presentan niveles más altos de actividad horizontal, actividad vertical y distancia total recorrida (Figura 2); sin embargo estas diferencias no fueron estadísticamente significativas.
También hemos proporcionado los datos de varios estudios previos realizados en otros modelos animales de enfermedades neuromusculares, así como para poner de relieve varios factores adicionales que afectan actoniveles IVITY (Figura 3). Por ejemplo, los niveles de actividad varían según el fondo genético 10. BL10 ratones de tipo salvaje exhiben mayor actividad horizontal, actividad vertical y distancia total recorrida comparación con la edad y el género coincide BL6 ratones de tipo salvaje (Figura 3). Esta es una observación importante tener en cuenta, como la utilización de las cepas de control incorrectos en un estudio puede hacer que los datos inutilizable. En segundo lugar, los niveles de actividad varían según el modelo de la enfermedad y el fenotipo (Figura 3). Por ejemplo, el ratón SJL, el modelo animal de la distrofia muscular de cinturas-2B (LGMD-2B), muestra el nivel más bajo de actividad horizontal y la distancia total recorrida, seguido por el ratón Dy2J y el ratón mdx, el modelo animal para Duchenne distrofia muscular (Figuras 3A, 3C). Sin embargo, los ratones Dy2J, a causa de su parálisis de las extremidades posteriores, muestran el nivel más bajo de la actividad vertical (Figura 3B). También es importante tener en cuenta que el nivel más alto dela actividad en el fenotipo mdx es más probable que atribuye a la mayor nivel de actividad de la cepa BL10 de fondo. Finalmente, esta cifra pone de relieve la importancia de la patología de los animales de edad / enfermedad en el momento de la prueba. Por ejemplo, a las 30 semanas de edad, no se pueden detectar diferencias en los niveles de actividad entre los ratones mdx y su edad y sexo controles pareados BL10 de tipo salvaje (Figura 3). Sin embargo, a las 6 semanas de edad, en torno a la fase necrótico pico en el modelo de ratón mdx, ratones mdx muestran una disminución significativa en la actividad vertical, y la actividad horizontal. Una disminución también se observa en la distancia total recorrida, pero esta diferencia no es significativa (Figura 3) 4.
Figura 1. aparatos de actividad en campo abierto. Dos aparatos de campo abierto con centro quadradivisores nt, y las tapas. Si center removible divisores cuadrantes están presentes, los animales sólo se deben colocar en la parte frontal izquierda (1, 3) y trasera cámaras derechas (2, 4) de cada caja durante las pruebas para obtener las lecturas válidas.
Figura 2. datos de la actividad de campo abierto. Datos de actividad en campo abierto típicos para Dy2J (línea gris, n = 3) y la tensión ajustada por edad y género de control BL6 (línea de color negro, n = 3) ratones a los 14, 19, 23, 25, y 30 semanas de edad (A - F) a) actividad Horizontal (unidades arbitrarias) machos, B) de actividad Horizontal (unidades arbitrarias) hembras, C) de actividad Vertical (unidades arbitrarias) varones, d) Actividad Vertical (unidades arbitrarias) mujeres. E) trave Distancia totalled (cm) hombres, E) distancia total recorrida (cm) mujeres. Los datos fueron recolectados durante 4 días consecutivos y se promediaron por ratón y grupal. Los mismos ratones se ensayaron en cada punto de tiempo. Los datos representan la media ± SEM. Datos publicó anteriormente 6. Ratones Dy2J y BL6 se compararon con una muestra independiente t-test en cada punto de tiempo. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Figura 3. campo Abrir actividad de datos múltiples cepas de datos típicos de comportamiento de la actividad de BL10 masculino (6 semanas de edad, n = 8; 25 a 30 semanas de edad, n = 10)., Mdx (6 semanas de edad, n = 9; 25-30 semanas de edad, n = 15), BL6 (grupo de control para los ratones Dy2J, n = 3; grupo de control de ratones SJL, n = 13), Dy2J (n = 3), y SJL (n = 13) ratones en VAen libros edades datos de BL10 y ratones mdx a los 6 y 25-30 semanas de edad. A) actividad Horizontal (unidades arbitrarias), B) la actividad Horizontal (unidades arbitrarias) datos de BL6, Dy2J, y los ratones SJL en 25-30 semanas de la edad de los datos de los ratones BL6, Dy2J, y SJL a 25-30 semanas de edad los datos procedentes de ratones mdx y BL10 en 6 y 25-30 semanas de edad, C) la actividad Vertical (unidades arbitrarias), D) la actividad Vertical (unidades arbitrarias) , E) Distancia total recorrida (cm) datos de BL10 y ratones mdx de 6 y 25-30 semanas de edad, y F) la distancia total recorrida (cm) Los datos de los ratones BL6, Dy2J, y SJL a 25-30 semanas de edad . Dy2J, modelo animal para CMD con α2 laminina mutación genética en el fondo BL6; SJL, modelo animal para el anillo óseo distrofia muscular-2B (LGMD-2B); mdx, modelo animal para la DMD en el fondo BL10. No hay control de SJL-disferlina suficiente. Los datos son medias ± SEM. B, C, y D contienen los datos previamente publiarrojar 6,17. Los datos no se distribuyen normalmente; Por lo tanto, los datos se compararon mediante una prueba de sumas de rangos de Wilcoxon. Un valor de p de p <0,05 fue considerado significativo. Las siguientes comparaciones se hicieron para cada parámetro: a) BL10 y ratones mdx a las 6 semanas de edad, p <0,05; b) BL10 y ratones mdx en 25-30 semanas de edad, no es significativo; c) Dy2J y BL6 emparejados ratones de la cepa de control a los 25-30 semanas de edad, p <0,05; d) SJL y BL6 igualados cepa de control a los 25-30 semanas de edad, p <0,001; e) los ratones BL10 en 25-30 semanas de edad y BL6 (grupo de control para los ratones Dy2J) ratones a las 25 semanas de edad, p <0,01; f) BL10 en 25-30 semanas de edad y BL6 (grupo de control de ratones SJL) en 25-30 semanas de edad, p <0,001.
Discussion
La medición de la actividad de campo abierto es un ensayo in vivo que puede ser beneficioso para la evaluación de la progresión de la enfermedad y la eficacia del fármaco en modelos animales de enfermedad neuromuscular 6,7,11-14. Como se muestra en la Figura 2, que proporciona una evaluación de los niveles de actividad que, en general reflejan la función locomotora. Esta es una medida diferente de la fuerza muscular, por lo que es una medida de resultado secundaria o auxiliar ideal para realizar en un estudio preclínico de drogas. Además, es un 15, medida no invasiva clínicamente relevante, que puede realizarse varias veces durante la duración de un estudio. Sin embargo, la actividad locomotora conductual y también está influenciada por factores adicionales, así (es decir, la manipulación experimentador, las condiciones ambientales, y la cognición) la creación de variación en los datos de actividad en campo abierto. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo bien probada y estandarizada que reduce la variación y permite que los resultados sean compared en varios laboratorios, con la esperanza de mejorar la traducción dentro de nuestro campo.
Una desventaja importante de esta medida es que es muy variable e influenciada por numerosos factores externos. Sin embargo, tomamos esto en cuenta al elaborar el protocolo. Se evaluó una variedad de protocolos de pruebas que van en duración de 1-5 días de la recolección de datos. Al final, se determinó que la realización de la aclimatación al instrumento antes de la recogida de datos para familiarizar a los animales con el ambiente de la cámara de pruebas y la realización de 4 días de recolección de datos reduce significativamente la cantidad de variación en los datos de los resultados 5. Este protocolo fue originalmente diseñado para evaluar los niveles de actividad y de comportamiento de la locomotora en el modelo de ratón mdx; Sin embargo, este protocolo ha sido recientemente validado en el modelo animal Dy2J así 6. Se sugiere que el protocolo se normalizará dentro de su laboratorio para cada modelo animal antes de usarlo en un estudio preclínico.
Actividad de campo abierto varía por antecedentes genéticos 17, el sexo 18-20, de 18 años, y el ritmo circadiano 21. Esto requiere animales de la misma edad, sexo y antecedentes genéticos que deben evaluarse al mismo tiempo. Durante las etapas de planificación, el pensamiento cuidadoso debe ser puesto en decidir a qué edad o edades campo abierto los niveles de actividad se evaluará. Cada modelo animal tiene su propia progresión de la enfermedad distinta y fenotipo locomotora y de la conducta, que varían en gravedad y por 6,15 la edad (Figura 2 y Figura 3). Por lo tanto, es importante para determinar los puntos de tiempo, clínica y patológicamente relevantes para evaluar las medidas de actividad de campo abierto. El número total de animales que se necesitan en cada grupo de tratamiento para detectar diferencias estadísticamente significativas varía según el modelo animal, la edad y el sexo también. En consecuencia, los cálculos del tamaño de muestra pertinentes también deben realizarse durante la etapa de planificación para determine el número total de animales que se necesitan en cada grupo de tratamiento para detectar diferencias estadísticamente significativas. Estos cálculos también deben tomar en consideración las medidas de resultado adicionales utilizados en el estudio (por ejemplo, mediciones de fuerza de prensión o análisis histológicos). Sobre la base de nuestros cálculos de potencia, por lo general utilizamos 10-12 animales por grupo de tratamiento. Además, se debe prestar especial atención a lo que la tensión de control se utiliza en el estudio. Hay una tendencia para las cepas de control inadecuadas para ser utilizado en estudios preclínicos. Por ejemplo, BL6 se utilizan a menudo como una cepa de control para los ratones mdx; sin embargo, el ratón mdx está en un fondo BL10. Como se ve en la Figura 3, los ratones BL10 son mucho más activos que los ratones BL6, que hacen imposible comparar los datos mdx y BL6. Cuando se realizan estudios preclínicos con ratones mdx, ratones BL10 deben utilizarse como cepa control. Por otra parte, si un estudio está siendo realizado con los ratones Dy2J, BL6 deben utilizarse como el contrcepa ol.
Pequeños cambios ambientales también pueden afectar de manera significativa los niveles de actividad. Estos incluyen la iluminación, temperatura, humedad, el olor, el ruido, y la actividad de 4,15 humano. Por lo tanto, es muy importante que la prueba se realiza en una sala controlada por temperatura y humedad con una iluminación no directo a la misma hora cada día 5. Las cámaras de prueba se deben espaciar de manera uniforme en toda la habitación y no se colocan bajo una luz directa o en esquinas sombreadas u oscuros 5. Los animales deben ser asignados al azar a sus cámaras de prueba cada día para reducir los efectos de la variación de las condiciones ambientales en toda la habitación, y se les debe permitir a aclimatarse a la sala de examen por 10-30 minutos antes de la recolección de datos. Asegúrese de realizar un seguimiento de la asignación de caja de cada animal durante toda la duración del estudio para asegurarse de que cualquier influencia de la caja / medio ambiente se distribuye en partes iguales entre los diferentes grupos de tratamiento. Las personas que carguen la animals en las cámaras de ensayo y manejo de los animales a lo largo de la duración del estudio deben estar cegados al grupo de tratamiento, y cuando sea posible cepa animal. En muchos casos genotipos afectadas son marcadamente diferentes de los controles relacionados y el cegamiento no es posible. Sin embargo, los individuos siempre deben estar cegados entre los grupos tratados y no tratados. Además, todas las personas deben salir de la habitación durante la recolección de datos para reducir el ruido y las distracciones dentro de la habitación, y todas las cámaras deben limpiarse a fondo después de cada sesión de toma de datos. Estas acciones reducirán significativamente variación en los datos. Es importante tener en cuenta que los animales también son altamente susceptibles a la adaptación 15. Por lo tanto, se sugiere que los animales se retiran de la cámara de ensayo inmediatamente después de la 60 min de la recolección de datos cada día y que los niveles de actividad en campo abierto evaluarse no más de una vez al mes.
La distancia total recorrida y el movimiento total demedidas de tiempo Ment tienden a ser las medidas de la actividad de campo abierto más sensibles 5. En el modelo de Dy2J, la medición de la actividad vertical, tiende a ser la más sensible campo abierto actividad medida (Figura 3); sin embargo, puede ser difícil de capturar mediciones de la actividad verticales precisos en los animales más pequeños. Por ejemplo, es posible que un animal más pequeño será exhibir un comportamiento de cría y el sensor no capturará que debido a la altura del sensor vertical. Como resultado de ello, le recomendamos los animales de prueba no antes de las 5 semanas de edad. También es posible que un animal dormir durante toda la duración de una sesión de recogida de datos. Si este es el caso, es conveniente añadir un día adicional de recopilación de datos. Por último, la mala alineación del divisor de cuadrante o bloqueo de sensores dentro de la caja puede resultar en datos inexactos también. Por lo tanto, es muy importante realizar una comprobación previa sensor, antes de la prueba, y revisar todos los datos a partir del final decada sesión de recogida de datos.
Precaución también debe tener cuidado al analizar los datos de actividad en campo abierto. Abrir los datos de actividad de campo tiene una tendencia a ser no-distribuido normalmente y tienen valores extremos 4. Antes de realizar cualquier análisis estadísticos, nuestros expertos en bioestadística recomiendan encarecidamente el registro de los datos de normalidad y valores atípicos. Si los datos se distribuyen normalmente no, se debe considerar la utilización de una prueba no paramétrica al comparar los medios. Además, todos los datos deben ser analizados por un individuo cegado a lo que los grupos de tratamiento son.
En general, la actividad de campo abierto medida tiene importantes ventajas: a) se trata de una evaluación completa de ambos locomotor y la actividad de comportamiento, que es fuerte, pero no siempre correlaciona con la función locomotora; b) es una medida fácil de realizar; c) que no requiere manipulación de los animales durante la prueba; d) que es una medida no invasiva que se puede realizar más de una vez durante toda la duración de un Study; e) no se necesita ninguna preparación especial para realizar la prueba; f) múltiples animales pueden ser probadas a la vez; y g) es una medida de resultado clínicamente relevantes 5,16. Sin embargo, al probar la terapéutica, tenga en cuenta que otros factores pueden afectar el comportamiento de un animal, ya su vez las medidas de actividad de campo abierto. Las drogas pueden tener SNC y otros efectos en todo el cuerpo, y el comportamiento también pueden ser influenciados por un ambiente estresante. Como resultado, puede ser difícil distinguir si los cambios en los niveles de actividad locomotora o de comportamiento están relacionados con cambios en la función muscular, la fuerza muscular, o son el resultado de los efectos secundarios de la droga. Por lo tanto, los ensayos funcionales, histológicos y moleculares o adicionales deben llevarse a cabo también. Este protocolo estandarizado también se ha utilizado con éxito en otras enfermedades musculares 4,17; Sin embargo, como se ve en la Figura 3, los estudios piloto deben realizarse inicialmente para evaluar la sensibilidad de la medida en el animalmodelo.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta publicación se financia a través de Cure CMD, Asociación Francesa Muscular Distrofia (AFM), una beca de investigación traslacional de la Asociación de Distrofia Muscular, Los Institutos Nacionales de la Salud (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), el Departamento de Defensa ( W81XWH-11-1-0330, 11-1-0782 W81XWH-, W81XWH-10-1-0659, 11-1-0809 W81XWH-, W81XWH-09-1-0599) y una subvención piloto del Parent Project Muscular Distrofia ( PPMD).
Este trabajo es uno de varios en una serie de procedimientos normalizados de trabajo para las metodologías utilizadas habitualmente en el campo de la enfermedad muscular congénita. Refleja los esfuerzos discutieron y establecieron por más de 20 expertos en el campo de la enfermedad muscular congénita en la reciente muscular congénita Enfermedad Consorcio taller, que se celebró en abril de 2013 en Washington, DC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (potassium peroxymonosulfate/ sodium chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 | |
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