Abstract
L'obiettivo di questo protocollo video è quello di discutere come eseguire e analizzare un esperimento tridimensionale fluorescente orbitale particle tracking utilizzando una versione modificata del microscopio a due fotoni 1. A differenza di approcci convenzionali (scansione raster o largo campo basato su una pila di frame), il tracciamento orbitale 3D permette di localizzare e seguire con un spaziale elevata (10 precisione nm) e risoluzione temporale (risposta in frequenza 50 Hz) lo spostamento 3D di una particella fluorescente passare lunghezza-scale di centinaia di micron 2. Il metodo si basa su un algoritmo di feedback che controlla l'hardware di un microscopio a scansione laser a due fotoni per eseguire un'orbita circolare intorno all'oggetto da tracciare: il meccanismo di feedback manterrà dell'oggetto fluorescente al centro da comandare lo spostamento dei il raggio di scansione 3-5. Per dimostrare i vantaggi di questa tecnica, abbiamo seguito un organello in rapido movimento, il lisosoma, dentro alcellule iving 6,7. Le cellule sono state piastrate secondo protocolli standard, e colorate con un colorante commercialmente lisosoma. Discutiamo brevemente la configurazione hardware e più in dettaglio il software di controllo, effettuare un esperimento di tracciamento orbitale 3D all'interno delle cellule viventi. Si parlerà in dettaglio i parametri richiesti per controllare il microscopio a scansione e consentire il movimento del fascio in un'orbita chiusa attorno alla particella. Concludiamo dimostrando come questo metodo può essere efficacemente utilizzato per tracciare il movimento veloce di un lisosoma marcato lungo i microtubuli in 3D all'interno di una cella dal vivo. Lisosomi possono muoversi con velocità nell'intervallo 0,4-0,5 micron / sec, tipicamente visualizzando un moto diretto lungo la rete microtubuli 8.
Introduction
Un gran numero di approcci sono stati sviluppati fino ad oggi per monitorare le particelle fluorescenti in tre dimensioni utilizzando un microscopio. La maggior parte approcci si basano sull'impiego di telecamere veloci, ideale per monitorare in due dimensioni, di solito in combinazione con modifiche personalizzate dell'ottica emissione del microscopio per ottenere inseguimento in direzione assiale. Microscopi a scansione laser confocale (uno o due fotoni) convenzionalmente in grado di monitorare una particella fluorescente eseguendo una sequenza temporale di z-stack, anche se questo processo è in genere richiede tempo, e produce la risoluzione di tempo ragionevole (10 Hz) solo se la particella monitorata è conservato nel centro di una piccola regione di imaging raster da un meccanismo di feedback attivo 2.
L'idea di bloccaggio-in per la particella è alla base del metodo di monitoraggio orbitale. Invece di un raster scan un'orbita circolare viene eseguita intorno alla particella fluorescente. L'intensità della fluorescenza lungol'orbita localizza con precisione la posizione delle particelle 4.
La posizione localizzato della particella può quindi essere utilizzato per azionare gli scanner microscopio e ri-centro orbita sulla posizione delle particelle. Gli scanner galvanometro del microscopio sono guidate da una tensione analogica. La componente alternata della tensione permette di eseguire un'orbita con il fascio laser focalizzato, cioè un sinusoidale e un'onda coseno applicata agli specchi X e Y scansione consentirà di eseguire un'orbita circolare. Il DC offset del segnale facilita la modifica della posizione del centro orbita. Dopo un periodo di orbita è determinata e la forma d'onda per il segnale AC è configurato, il sistema di retroazione deve aggiornare solo la componente continua del segnale.
Un software in grado di leggere il segnale fluorescente raccolti dai rivelatori è necessario per controllare gli scanner e rivelatori, per calcolare la posizione della particella e aggiornare il DC offset. Per una valutazione di successo di imaging un'accurata scelta dei parametri orbitali (dimensioni e della tempistica) è necessario e questi parametri devono essere regolati in base alle caratteristiche delle particelle fluorescenti che è necessario tenere traccia.
I fondamenti fisici e matematici della tecnica sono stati descritti in passato 4,5 per entrambe le applicazioni 2D e 3D. In questo protocollo si illustrano brevemente le principali componenti hardware del setup, e più in dettaglio la scelta dei parametri e la preparazione del campione richiesto per un tipico esperimento che ci permette in seguito lo spostamento di un lisosoma con una risoluzione temporale elevata all'interno di una cellula vivente.
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Protocol
Preparazione del campione 1
- Mantenere le cellule CHOK1 in tessuto fiasche di coltura utilizzando DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e 100 UI / ml di penicillina 50 mg / ml di streptomicina. Incubare le cellule in un 5% di CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.
- Raccolta e poi plate cellule CHOK1 su un diametro di micro-pozzetto 14 mm e uno spessore superficie di 0,16 mm. Cellule seme per densità ottimale per l'imaging, intorno al 60-70% di confluenza.
- Incubare le cellule per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. Lavare le cellule tre volte in HBSS (Hank Buffered Saline Solution), e incubare le cellule in una soluzione contenente 50 nM di Lysotracker DND26 verde e 150 Nm di tubulina inseguitore verde. Incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C. Passaggio facoltativo: Prima di incubazione, eseguire una macchia supplementare con un colorante colorazione matrice mitocondriale (25 Nm).
- Lavare le cellule tre volte in HBSS per rimuovere il colorante non legato. Aggiungere fresco terreno di coltura DMEM prima imagzione le cellule.
2. Configurazioni Microscopio
Il microscopio per il tracciamento di particelle descritto nel protocollo video viene montato sul telaio di un microscopio invertito disponibile in commercio (Figura 4). Tuttavia moduli commerciali per 3D tracciamento di particelle orbitali sono ora disponibili.
- Utilizzare un coerente Chameleon-Ultra II Ti: Sa a femtosecondi sorgente di luce di eccitazione laser, con una gamma di lunghezze d'onda di uscita regolabile tra 690 nm-1.040 nm.
- Assicurarsi che il raggio laser è allineato nella porta posteriore del microscopio utilizzando specchi IR-rivestito. Il raggio laser viene attenuato mediante una piastra semionda rotante seguito da un polarizzatore lineare calcite. Attenuazione del fascio in modo che la potenza media al campione è compreso tra 0,5 e 2 mW.
NOTA: Il raggio laser viene riflesso da una coppia di specchi a comando galvanometro motori che consentono il controllo della posizione e traiettoria del fascio focalizzato nel piano campione. Inconfigurazione tipica del fascio laser collimato uscire degli specchi galvanometro viene espanso (10X), che passa attraverso un espansore del fascio, prima di entrare nel retro dell'obiettivo microscopio dopo la riflessione nel passo corto specchio dicroico. - Raccogliere la luce di fluorescenza dal campione ponendo un obiettivo numerico ad elevata dell'acqua di apertura (60X, NA 1.2) nel percorso ottico. Scegli un cubo filtro di fluorescenza in funzione delle lunghezze d'onda di emissione desiderati in configurazione sia uno o due canali. Impiegare filtri passa-banda di emissione per selezionare ulteriormente la gamma spettrale della fluorescenza emessa.
- Porre il campione su un palco motorizzato, e regolare la multa movimento dell'obiettivo del microscopio con un piezo-controllore obiettivo.
- Dirigere la luce dal cubo del filtro in tubi fotomoltiplicatori dove il segnale viene discriminati e inviato a una scheda di acquisizione dati I / O digitale.
Generato dal computer forme d'onda sono l'uscita analogica della scheda I / O e sono provid: NOTAed agli scanner di controllo elettronica. L'ingresso di conteggio di fotoni dai fotomoltiplicatori e il segnale di uscita per gli scanner sono misurati e controllati tramite la scheda I / O dal Laboratorio per il software Fluorescence Dynamics SimFCS.
3. Imaging
- Posizionare le cellule sul palco e mettere a fuoco utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa.
- Passa alla scansione di immagini raster per identificare le cellule che hanno incorporato il colorante e di visualizzare i microtubuli sottostanti. Identificare l'area iniziale in cui il movimento delle vescicole è presente.
- Una volta che una vescicola isolato è identificato, impostare i seguenti parametri per l'inseguimento orbitale:
- Selezionare il raggio dell'orbita per definire le dimensioni della scansione circolare secondo la dimensione della particella monitorata. Per un emettitore punto, impostare il raggio dell'orbita pari alla vita della Point Spread Function (PSF) del fascio di eccitazione al massimo la sensibilità e la risposta.
- Impostare il assialedistanza per definire la distanza tra le due orbite che vengono eseguite per localizzare la posizione della particella lungo la direzione assiale. Impostare la distanza assiale a 1,5-3 volte la vita PSF.
- Definire il tempo di sosta in base alla luminosità della particella per impostare il tempo speso su ogni punto dell'orbita, che determinerà anche il tasso-photo sbiancamento. Utilizzare un tempo di sosta tra 10-100 msec.
- Impostare il numero di punti in ciascuna orbita di 64 o 128 per produrre periodi orbita nell'ordine di 4-32 msec e fornire un'elevata risoluzione temporale per la determinazione della posizione della particella.
- Modificare il segnale di offset DC inviata agli specchi in modo da centrare il fascio sulla particella attraverso l'interfaccia utente grafica mediante un cursore di selezione nell'immagine raster-digitalizzata.
- Inizia il monitoraggio commutando la modalità microscopio da raster-imaging per la scansione orbitale.
- Attivare la raccolta di feedback e dati.
4. TrajectAnalisi ory
- Utilizzare il software per visualizzare la fluorescenza raccolte in ogni punto lungo l'orbita e ad ogni tempo sotto forma di un 'tappeto intensità'. L'intensità raccolto lungo il tappeto fornisce informazioni sulle interazioni della particella con altri oggetti luminosi. Utilizzare il software per visualizzare sia le informazioni traiettoria (cioè lo spostamento CC nel tempo di x, y scanner e del -piezo z) e l'intensità di fluorescenza raccolti dal tubo fotomoltiplicatore nel tempo sotto forma di serie temporali.
- Utilizzare la rappresentazione delle serie storiche e le informazioni 'tappeto' intensità 'di scegliere solo una regione di interesse nella traiettoria.
- Utilizzare il software per visualizzare una proiezione 2D della porzione selezionata della traiettoria della particella. Selezionare i controlli appropriati per codice colore traiettoria secondo l'intensità di fluorescenza delle particelle.
- Selezionare l'opzione per visualizzare la particolo traiettoria in 3D, e codice-colore che secondo l'intensità di fluorescenza. Ruotare la traiettoria in 3D utilizzando i comandi per visualizzare le caratteristiche del moto lisosomi lungo il microtubulo.
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Representative Results
Secondo questo protocollo veloce inseguimento singola particella 3D può essere eseguita all'interno di cellule viventi utilizzando un microscopio a due fotoni modificato per monitorare lo spostamento dei lisosomi fluorescente. L'esperimento eseguito consiste di tracciare un lisosoma isolato muoversi all'interno della cella dopo il processo di maturazione endosome 9. I lisosomi sono stati colorati con un colorante verde fluorescente ed eccitato a 930 nm che sfruttano 2-fotone di eccitazione. I nostri dati dimostrano che è possibile ottenere x, y, z traiettorie di spostamento con una risoluzione temporale di 32 msec (Figura 1a). L'analisi tappeto mostra l'intensità registrato lungo ogni orbita nel tempo (Figura 1b). Durante l'inseguimento l'intensità integrata della fluorescenza emessa può essere registrata (Figura 2a). La traiettoria 3D ricostruita mostra un movimento diretto, come ci si può aspettare da una vescicola in movimento sulla rete dei microtubuli. Ladditionally, è possibile correlare la traiettoria 3D a un'immagine scansione raster della regione circostante (Figura 2b). Questo conferma il movimento della particella lungo la direzione di un fascio di microtubuli.
Le cellule sono state inoltre marcate con un pennarello rosso per i mitocondri di registrare l'eventuale interazione della vescicola con questi organelli durante il loro movimento. È possibile correlare la traiettoria 3D della particella all'interno della cella (Figura 3a) al tappeto intensità registrata dal Mitotracker emissione di fluorescenza (Figura 3b). Questo ci consente di registrare le interazioni di prossimità della vescicola con la rete mitocondriale in funzione della loro posizione all'interno della cellula. Il picco delle emissioni registrato nel "canale mitocondri" non fornisce informazioni funzionali sul modo in cui gli organelli interagiscono. Può fornire solo informazioni sul tempo della loro interazionee la posizione spaziale relativa dell'oggetto fluorescente rispetto alla particella monitorata. Questa posizione relativa viene estratto dall'angolo nell'orbita dove viene registrato il picco di emissione. Una rappresentazione schematica del microscopio abbiamo usato per effettuare questo esperimento si può osservare nella figura 4.
Figura 1 Cilindrata vs traiettorie temporali e moquette intensità. a) x, y e z lisosomi spostamento in funzione del tempo le tracce. b) La traiettoria intensità (cioè l'intensità raccolto lungo ciascun asse verticale orbita circolare è tempo) fornisce informazioni sui dintorni fluorescenza della particella. Punti luminosi al di fuori della scatola corrispondono alle interazioni delle particelle con altri oggetti luminosi, e sono associati a salti nella traiettoria come th E orbite ri-centri sulla sorgente luminosa a fluorescenza. La regione inscatolato corrisponde alla porzione della traiettoria tra due salti.
Figura 2 Seguendo la traiettoria 3D di un lisosoma. a) ricostruzione 3D di una porzione della traiettoria di un lisosoma raccolti utilizzando il monitoraggio delle particelle. La traiettoria è colore codificato per l'intensità di fluorescenza raccolti dalla particella (rosso, alto, blu, basso numero di fotoni). Scale assi sono in nm. Si noti che x, y, z assi hanno differenti gamme. Proiezione b) 2D della traiettoria 3D, visualizzando una sovrapposizione della traiettoria in cima al microtubulo ripreso in un raster scansione immediatamente dopo la traiettoria stato raccolto. C) I mitocondri colorati con Mitotracker .
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Figura 3 Estensione del tracciamento orbitale a più di un canale (eccitazione a 930 nm). a) traiettoria 3D di un lisosoma all'interno della cella. b) Intensità tappeto nel canale verde (fluorescenza raccolti in questo canale viene utilizzato per il puntamento). c) Intensità tappeto nel canale rosso, dove i mitocondri sono state colorate con una matrice fluorescente rosso colorante mirata. Le regioni in cui la traiettoria entra in contatto con i mitocondri (punte di freccia) appaiono come protuberanze intensità nel tappeto, come il raggio orbita attorno al lisosoma attraversa nella matrice mitocondriale.
Figura 4. Schema del setup sperimentale: modificato microscopio a due fotoni. Rappresentazione schematica del laser set-up: un 2-Photon laser Ti: Sa con una gamma 690-1,040 nm noi eraed, un polarizzatore e mezzo waveplate sono usati per controllare la potenza di eccitazione. Tutte le altre voci sono elencate in figura utilizzando le abbreviazioni indicate. Abbiamo usato un obiettivo 60X con un NA di 1.2.
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Discussion
Nonostante gli enormi progressi delle tecniche di microscopia a fluorescenza e strumentazioni nel corso degli ultimi anni, raggiungendo traiettorie delle particelle fluorescenti in tre dimensioni con una elevata risoluzione temporale è rimasta una sfida nel campo. Se alta risoluzione temporale è stato raggiunto particelle di inseguimento in due dimensioni, estensione alla direzione assiale comporta tipicamente una drastica riduzione della risposta in frequenza del sistema 10.
In questo video-protocollo ci siamo concentrati sull'applicazione dimostrativo di tracciare una singola particella in tre dimensioni all'interno di una cellula vivente con una risoluzione temporale elevata (32 msec in questo esperimento) utilizzando un microscopio a due fotoni. La configurazione necessaria per l'esecuzione di un esperimento è in genere a disposizione dei laboratori che effettuano microscopia a scansione laser. Entrambi gli strumenti add-on per il 3D tracciamento orbitale così come il software di controllo sono disponibili sul mercato, per la commercial microscopi a scansione laser, come quelli prodotti da Olympus. L'utilizzo di una sorgente pulsata laser infrarosso ad alta potenza, se disponibili, è vantaggioso nella progettazione del setup sperimentale in quanto non richiede de-scansione della fluorescenza emessa. Inoltre è stato dimostrato in passato che l'irradiazione a infrarossi è più benigna verso la cellula, in condizioni particolari 11, data la riduzione del fuori fuoco fluorescenza e la foto-sbiancamento.
Sebbene veloce inseguimento di una particella fluorescente in due dimensioni può essere effettuata utilizzando una macchina fotografica sensibile, la mancanza di informazioni tridimensionali può essere spesso limitante per interpretare il significato biofisico delle informazioni traiettoria. Ad esempio, le vescicole si muovono lungo microtubuli spesso si scontrano regioni microtubuli intersezione 8,12. In questa situazione, l'uso di una tecnica di tracciamento 3D supera il limite di utilizzo di proiezioni 2D di una struttura 3D.
A causa del tempo di risposta del nostro dispositivo nanopositioner piezo obiettivo, il periodo del movimento in asse z è limitata a circa 30 msec, mentre in x, y direzioni si può andare fino a pochi msec. La precisione di localizzazione del metodo scala come il rapporto segnale rumore 4,5. L'unica limitazione apparente del metodo, cioè la perdita di una visione globale dell'ambiente della particella, è compensato dalla possibilità di ricostruire un tappeto intensità temporale 13, tracciando la storia delle interazioni della particella fluorescente con sorgenti fluorescenti limitrofi, visualizzazione sia la stessa o una emissione spettrale diversa.
Mostriamo che il moto dei lisosomi, vescicole che subiscono diretti movimento lungo i microtubuli, alimentato da kinesins o dineine, può essere seguito all'interno di una cellula vivente dopo colorazione con un colorante disponibile in commercio. Recentemente, 2D monitoraggio dei lisosomi era correuforico per il super-Resolution Imaging della rete di microtubuli, nello sforzo di individuare i percorsi che le vescicole prendono a microtubuli-microtubuli intersezioni 8. Traiettorie 3D dei lisosomi mostrano un comportamento più complesso di movimento unidirezionale. Anche se una media diretta movimento può essere osservato, flessione, torsione e le possibili rotazioni lungo i tubuli possono essere osservati da queste traiettorie.
Abbiamo identificato due fasi critiche di eseguire questi esperimenti: in primo luogo, è necessario per raggiungere una densità etichettatura dei lisosomi che è allo stesso tempo sufficientemente elevata per ottenere particelle vivacemente colorati, e che allo stesso tempo fornisce una densità di particelle basse sufficiente per consentire il monitoraggio delle singole particelle. Nel caso di due particelle di attraversamento, il microscopio può passare da una particella all'altra tenendo traccia. Il secondo passaggio critico riguarda la scelta del tempo di permanenza dei pixel, permettendo un ragionevole equilibrio siainterpolare elevato rapporto segnale-rumore e la velocità di inseguimento. Abbiamo osservato che la velocità di tracciamento dell'ordine di 32 msec per ciclo di monitoraggio sono in genere sufficienti per seguire lisosomi sottoposti a movimento veloce diretto a velocità inferiori a 1 micron / sec.
In sintesi, tracciamento orbitale permette di misurare in tre dimensioni e con una risoluzione temporale <40 msec il movimento intracellulare di vescicole fluorescente. Il tracciamento orbitale 3D ha il potenziale per essere impiegato in futuro per lo studio dei diversi processi cellulari altamente dinamici tali noi lo studio della dinamica della cromatina tempo reale, trascrizione e diffusione di nanoparticelle plasmoniche nel mezzo intracellulare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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