Abstract
Formålet med denne video protokol er at diskutere, hvordan man kan udføre og analysere en tredimensionel fluorescerende orbital partikel sporing eksperiment ved hjælp af en modificeret to-foton mikroskop 1. I modsætning til konventionelle metoder (rasterskandering eller bredt felt baseret på en stak af rammer), 3D orbital sporing giver mulighed for at lokalisere og følge med en høj rumlig (10 nm nøjagtighed) og tidsmæssig opløsning (50 Hz frekvens respons) 3D forskydning af en bevægende fluorescerende partikel på længde-skalaer hundrede mikrometer 2. Metoden er baseret på en feedback-algoritme, der styrer hardwaren på et to-foton-laserscanningmikroskop for at udføre en cirkulær bane omkring genstanden, der skal spores: feedback mekanisme vil opretholde det fluorescerende objekt i midten ved at styre forskydningen af scanningsstrålen 3-5. For at vise fordelene ved denne teknik, vi fulgte en hurtig bevægelse organel, lysosomet inden aliving celle 6,7. Celler blev udpladet i overensstemmelse med standardprotokoller og farvet under anvendelse af en kommercielt lysosom farvestof. Vi diskuterer kort hardwarekonfiguration og mere detaljeret kontrol software, til at udføre en 3D orbital sporing eksperiment inde levende celler. Vi diskutere i detaljer de parametre, der kræves for at styre scanning mikroskop og muliggøre bevægelse af strålen i et lukket kredsløb omkring partiklen. Vi konkluderer ved at demonstrere, hvordan denne metode kan bruges effektivt til at spore den hurtige bevægelse af en mærket lysosom langs mikrotubuli i 3D i en levende celle. Lysosomer kan bevæge sig med hastigheder i området 0,4-0,5 um / s, der typisk viser en rettet bevægelse langs mikrotubulære netværk 8.
Introduction
Et stort antal af fremgangsmåder er blevet udviklet til dato til at spore fluorescerende partikler i tre dimensioner ved hjælp af et mikroskop. De fleste metoder hviler på anvendelse af hurtige kameraer, velegnet til at spore i to dimensioner, typisk kombineret med tilpassede modifikationer af emission optik mikroskop for at opnå tracking i den aksiale retning. Laserscanningmikroskoper (enten konfokal eller to fotoner) konventionelt kan spore en fluorescerende partikel ved at udføre en sekvens af z-stakke, selv om denne proces er typisk tidskrævende, og giver rimelig tid opløsning (10 Hz), hvis partikel, der spores, er holdes i centrum af en lille raster billeddannelse region af en aktiv feedback-mekanisme 2.
Ideen om at binde sig til partiklen er grundlaget for orbital sporing metode. I stedet for en raster scanne en cirkulær bane udføres omkring fluorescerende partikel. Intensiteten af fluorescensen langskredsløb nøjagtigt lokaliserer partiklen stilling 4.
Den lokaliserede stilling af partiklen kan derefter anvendes til at aktivere mikroskop scannere og recentrere orbit på partiklen stilling. Galvanometret scannere mikroskopet som drives af en analog spænding. AC komponent af denne spænding gør det muligt at udføre en bane med den fokuserede laserstråle, dvs en sinus og en cosinus bølge påføres X og Y scanning spejle vil tillade udførelse af en cirkulær bane. DC offset signalet lettere at ændre positionen af kredsløbet centrum. Når en bane, bestemmes og bølgeform til AC signalet er konfigureret, feedback-systemet behov for at opdatere kun DC-komponenten af signalet.
En software i stand til at læse det fluorescerende signal opsamlet fra detektorerne er nødvendig for at styre scannere og detektorerne, at beregne positionen af partiklen og opdatere DC fraindstillet. For en succesfuld tilbagemelding imaging et omhyggeligt valg af Orbit parametre (størrelse og timing) er påkrævet, og disse parametre skal justeres på grundlag af de særlige kendetegn ved de fluorescerende partikler, at det er nødvendigt at spore.
De fysiske og matematiske grundlag for teknikken blev beskrevet tidligere 4,5 for både 2D og 3D-applikationer. I denne protokol vi kort beskrive de vigtigste hardwarekomponenter opsætningen, og mere detaljeret valget af parametre og af prøveforberedelse kræves for en typisk eksperiment tillader os efter forskydningen af en lysosom ved en høj tidslig opløsning i en levende celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvefremstilling
- Oprethold CHOK1-celler i vævskulturkolber ved hjælp DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og 100 IE / ml penicillin 50 ug / ml streptomycin. Inkubér cellerne i 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
- Høst og derefter pladen CHOK1 celler på en 14 mm i diameter mikro-godt med en overflade tykkelse på 0,16 mm. Seed celler for optimal tæthed til billeddannelse, omkring 60-70% sammenflydning.
- Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2. Vaskes cellerne tre gange i HBSS (Hank saltopløsning), og inkuber cellerne i en opløsning indeholdende 50 nM lysoTracker DND26 grøn og 150 nM af tubulin tracker grøn. Cellerne inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Valgfrit trin: Før inkubation udføre en supplerende pletten med en mitokondrie matrix farvning farvestof (25 Nm).
- Vaskes cellerne tre gange i HBSS for at fjerne eventuelt ubundet farvestof. Tilføj frisk DMEM vækstmedium før imaging cellerne.
2. Mikroskop konfigurationer
Mikroskopet for partikel sporing beskrevet i videoen protokollen er monteret på rammen af en kommercielt tilgængelig inverteret mikroskop (figur 4). Men kommercielle moduler til 3D orbital partikel sporing er nu tilgængelige.
- Brug en sammenhængende Chameleon-Ultra II Ti: Sa femtosekund laser excitationslyskilde, med en justerbar udgangseffekt bølgelængdeområdet mellem 690 nm-1.040 nm.
- Sørg for, at laserstrålen er placeret i den bageste port mikroskopet med IR-belagte spejle. Laserstrålen dæmpes ved hjælp af en roterende halvbølge plade efterfulgt af en calcit lineære polarisator. Dæmpe strålen, så at den gennemsnitlige effekt ved prøven er mellem 0,5 og 2 mW.
BEMÆRK: laserstrålen reflekteres af et par galvanometer-motoriske aktiverede spejle, der tillader kontrol af position og bane af den fokuserede stråle i prøveplanet. I entypisk konfiguration den kollimeret laserstråle spændende af galvanometret spejle udvides (10X), der passerer gennem en stråle expander, inden de kommer ind på bagsiden af mikroskopet mål efter refleksion på kort-pass dichroic spejl. - Saml fluorescens lys fra prøven ved at placere en høj numerisk apertur vand målsætning (60X, NA 1.2) ind i strålegangen. Vælg en fluorescens filter terning i henhold til de ønskede emissionsbølgelængder i enten en eller to kanaler konfiguration. Ansæt emission båndpasfiltre til at vælge yderligere spektralområde af den udsendte fluorescens.
- Anbring prøven på en motoriseret trin og justere fint bevægelse af mikroskopet mål ved hjælp af en objektiv piezo-controller.
- Rette lyset fra filteret terning i fotomultiplikatorrørene hvor signalet diskriminerede og sendes til en digital I / O datafangst kortet.
BEMÆRK: Computer genererede bølgeformer er den analoge udgang på I / O-kortet og er provided til scannere styreelektronikken. Foton optælling input fra fotoforstærkerne og udgangssignalet til scannerne måles og styres via I / O-kort af laboratoriet til fluorescens Dynamics SimFCS software.
3. Imaging
- Anbring cellerne på scenen og fokusere ved hjælp af transmitteret lys belysning.
- Skift til rasterskandering billeddannelse til at identificere de celler, der har inkorporeret farvestof og at visualisere de underliggende mikrotubuli. Identificer det oprindelige område, hvor vesikel bevægelse er til stede.
- Når en isoleret vesikel er identificeret, skal du indstille følgende parametre for orbital sporing:
- Vælg radius af kredsløb til at definere størrelsen af den cirkulære scanning efter størrelsen af partiklen, der spores. For et punkt emitter indstille radius af kredsløb svarende til taljen af punktspredningsfunktionen (PSF) i exciteringsstrålen at maksimere følsomhed og respons.
- Indstil det aksialeafstand til at definere afstanden mellem de to baner, der udføres for at lokalisere partiklen position langs den aksiale retning. Indstil den aksiale afstand til 1,5-3 gange PSF taljen.
- Definer opholdstid i forhold til lysstyrken af partiklen til at indstille tiden brugt på hvert punkt af kredsløb, som også vil bestemme foto-blegning sats. Brug en opholdstid mellem 10-100 usek.
- Indstil antallet af point i hver bane til 64 eller 128 for at give orbit perioder i størrelsesordenen 4-32 msek og giver en høj tidslig opløsning til bestemmelse af partiklens position.
- Skift DC offset signal til spejle for at centrere strålen på partiklen gennem den grafiske brugergrænseflade via en markør markering i raster-scannet billede.
- Begynde at spore ved at skifte mikroskopet mode fra raster-billeddannelse til orbital scanning.
- Aktiver feedback og indsamling af data.
4. trajectrisk analyse
- Bruge softwaren til at vise fluorescens opsamles ved hvert punkt langs kredsløb og på hvert tidspunkt i form af et 'intensitet tæppe «. Intensiteten opsamlet langs tæppet giver oplysninger om vekselvirkningen af partikel med andre lyse objekter. Brug software til at vise både bane oplysninger (dvs. DC forskydning over tid x, y scannere og z -piezo) samt fluorescensintensiteten opsamlet fra fotomultiplikatorrøret over tid i form af tidsserier.
- Brug tidsserie repræsentation og "intensitet tæppe 'oplysninger til at vælge kun et område af interesse i bane.
- Brug software til at vise en 2D projektion af den valgte del af partiklens bane. Vælg de relevante kontroller til farvekode bane ifølge partikel fluorescens intensitet.
- Vælg muligheden for at vise partiklen bane i 3D, og farvekode det ifølge fluorescensintensiteten. Drej bane i 3D ved hjælp af knapperne til at visualisere funktionerne lysosomet bevægelse langs mikrotubuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge denne protokol hurtigt 3D enkelt partikel sporing kan udføres inde i levende celler ved hjælp af en modificeret to-foton mikroskop for at spore forskydning af fluorescensmærkede lysosomer. Forsøget udføres består spore en isoleret lysosom bevæger inde i cellen efter endosomet modningsprocessen 9. De lysosomer blev farvet ved anvendelse af et fluorescerende grønt farvestof og exciteret ved 930 nm, der udnytter to-foton excitation. Vore data viser, at det er muligt at opnå x, y, z forskydning baner med en tidsmæssig opløsning på 32 ms (figur 1a). Gulvtæppet analyse viser intensitet registreres langs hver bane over tid (figur 1b). Under sporing den integrerede intensitet af den udsendte fluorescens kan optages (figur 2a). Den rekonstruerede 3D bane viser en rettet bevægelse, som kan forventes fra en vesikel bevæger sig på mikrotubulære netværk. Endditionally, er det muligt at korrelere 3D bane til en rasterskandering billede af det omgivende område (2b figur). Dette bekræfter bevægelse af partiklen langs retningen af en mikrotubulus bundt.
Cellerne blev yderligere farvet med en rød markør for mitokondrier til at optage eventuel interaktion af vesiklen med disse organeller under deres bevægelse. Det er muligt at korrelere 3D bane af partiklen i cellen (figur 3a) til intensitet tæppe optaget fra mitotracker fluorescensemission (figur 3b). Dette giver os mulighed for at registrere nærhed vekselvirkninger mellem vesikel med mitokondrie netværk som en funktion af deres position i cellen. Emissionen toppunktet i "mitokondrier kanal" ikke giver funktionel information om den måde, de organeller interagere. Det kan give kun oplysninger om tidspunktet for deres interaktionog den relative rumlige position af det fluorescerende objekt med hensyn til partikel, der spores. Denne relative position er udvundet fra den vinkel i kredsløb, hvor spidsværdien registreres. Der kan konstateres en skematisk repræsentation af mikroskopet vi anvendt til at udføre dette eksperiment i figur 4.
Figur 1. Forskydning vs tid baner og intensitet tæppe. a) x, y og z lysosom forskydning versus tid spor. b) intensitet bane (dvs. intensiteten opsamlet langs hver cirkulær bane lodrette akse er tid) giver oplysninger om fluorescens omgivelser partiklen. Lyspunkter uden for boxed svarer til vekselvirkninger mellem partikel med andre lyse objekter, som er knyttet til spring i bane som th e kredser re-centre på den klareste fluorescens kilde. Det indrammede område svarer til den del af banen mellem to spring.
Figur 2. Efter 3D bane en lysosom. a) 3D-rekonstruktion af en del af banen for en lysosom opsamlet ved hjælp af partikel sporing. Den bane er farvekodet for fluorescensintensitet opsamles fra partikel (rød, høj, blå, lave fotontællinger). Akser skalaer er i nm. Bemærk, at x, y, z-akserne har forskellige intervaller. B) 2D projektion af 3D-bane, som viser en overlejring af bane oven på mikrotubulus afbildes i et raster-scan umiddelbart efter bane blev opsamlet. C) Mitokondrier farvet med mitotracker .
Ad 3 "src =" / filer / ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Udvidelse orbital sporing til mere end en kanal (excitation ved 930 nm). a) 3D-bane af et lysosom i cellen. b) Intensitet tæppe i den grønne kanal (fluorescens opsamles i denne kanal bruges til sporing). c) Intensitet tæppe i den røde kanal, hvor mitokondrier blev farvet med et rødt fluorescerende matrix målrettet farvestof. De regioner, hvor bane kommer i kontakt med mitokondrier (pilespidser) vises som intensitet bump i gulvtæppet, da strålen kredser omkring lysosomet sender i mitokondrie-matrix.
Figur 4. Skema af forsøgsopstillingen: modificeret to-foton mikroskop. Skematisk fremstilling af laseren set-up: 2-Photon Ti: Sa laser med en række 690-1,040 nm var osudgave, en polarisator og en halv waveplate anvendes til at styre strøm til magnetisering. Alle de andre elementer er angivet i figuren ved hjælp af de angivne forkortelser. Vi brugte en 60X objektiv med en NA på 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trods de enorme fremskridtene i fluorescensmikroskopi teknikker og besætninger i de seneste år, opnåede baner fluorescerende partikler i tre dimensioner med en høj tidsmæssig opløsning er forblevet en udfordring på området. Hvis høj tidsmæssig opløsning er opnået sporing partikler i to dimensioner, udvidelse til den aksiale retning bringer typisk en drastisk reduktion i frekvensgangen af systemet 10.
I denne video-protokol fokuserede vi på den demonstrative anvendelse spore en individuel partikel i tre dimensioner i en levende celle med en høj tidsopløsning (32 msek i dette eksperiment) ved hjælp af en to-foton mikroskop. Den nødvendige for at udføre et sådant eksperiment setup er typisk til rådighed for laboratorier, der udfører laser scanning mikroskopi. Begge instrumenter add-ons til 3D orbital sporing samt kontrol software er tilgængelige på markedet, commercial laserscanningmikroskoper såsom dem, der fremstilles af Olympus. Anvendelsen af en pulseret høj effekt infrarød laserkilde, hvor det er muligt, er fordelagtigt i udformningen af forsøgsopstillingen, da det ikke kræver de scanning af den udsendte fluorescens. Endvidere blev det demonstreret i fortiden, at infrarøde stråling er mere godartet mod cellen, under særlige betingelser 11, i betragtning af at ud af fokus fluorescens og foto-blegning.
Selvom hurtig sporing af et fluorescerende partikel i to dimensioner kan udføres ved hjælp af en følsom kamera, kan fraværet af enhver tre-dimensionelle information ofte være begrænsende i fortolkningen af den biofysiske betydning af bane oplysninger. For eksempel vesikler bevæger sig langs mikrotubuli ofte køre op mod mikrotubuli vejkryds regioner 8,12. I denne situation, anvendelse af en 3D-sporing teknik overvinder grænse for anvendelse af 2D projektioner af en 3D-struktur.
På grund af den tid respons på vores mål nanopositioner piezo-enhed, er den periode, hvor bevægelse i z-aksen begrænset til omkring 30 ms, mens der i x, y retninger det kan gå ned til nogle få millisekunder. Lokaliseringen Metodens præcision skalaer som signal til støjforhold 4,5. Den eneste synlige begrænsning af metoden, dvs tabet af et globalt syn på miljøet af partiklen, kompenseres af muligheden for at rekonstruere en tidsmæssig intensitet tæppe 13, opsporing historie samspillet mellem den fluorescerende partikel med tilgrænsende fluorescerende kilder vise enten den samme eller en anden spektralemission.
Vi viser, at bevægelsen af lysosomer, vesikler, der gennemgår rettet bevægelse langs mikrotubuli, drevet af enten kinesins eller dyneins kan følges inden for en levende celle efter farvning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt farvestof. For nylig 2D sporing af lysosomer var corropstemt at den super-opløsning billeddannelse af det mikrotubulære netværk, i bestræbelserne på at afsløre de ruter, vesiklerne tager på mikrotubuli-mikrotubuli vejkryds 8. 3D baner lysosomerne vise en mere kompleks adfærd end ensrettet bevægelse. Selv om en gennemsnitlig rettet bevægelse kan observeres, bøjning, vridning og mulige rotationer langs tubuli kan observeres fra disse baner.
Vi har identificeret to kritiske trin i at udføre disse eksperimenter: for det første er det nødvendigt at opnå en mærkning tæthed af lysosomerne der er samtidig høj nok til at opnå flotte farvede partikler, og at der på samme tid giver en tæthed af partikler med lav nok til at tillade sporing af individuelle partikler. I tilfælde af to krydsende partikler, kan mikroskopet skifte fra en partikel til en anden, mens der spores. Det andet kritiske trin vedrører valget af pixel opholdstid, der giver en rimelig balance værelem højt signal-støjforhold og sporing hastighed til. Vi har observeret, at sporing hastighed i størrelsesordenen 32 msek pr sporing cyklus er typisk tilstrækkelig til at følge lysosomer undergår hurtigt rettet bevægelse ved hastigheder under 1 um / sek.
Sammenfattende orbital sporing gør det muligt at måle i tre dimensioner, og med en tidsmæssig opløsning på <40 msek den intracellulære bevægelse af fluorescensmærkede vesikler. 3D orbital sporing har potentialet til at blive ansat i fremtiden for studiet af forskellige meget dynamiske cellulære processer sådanne os studiet af kromatin dynamik realtid transskription og formidling af plasmoniske nanopartikler i den intracellulære medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
