Abstract
Het doel van deze video protocol te bespreken hoe uitvoeren en analyseren van een driedimensionaal fluorescerende orbitale particle tracking-experiment met een aangepaste twee-foton microscoop 1. In tegenstelling tot conventionele benaderingen (raster scan of brede veld op basis van een stapel van frames), de 3D-orbitale tracking kan lokaliseren en te volgen met een hoge ruimtelijke (10 nauwkeurigheid nm) en temporele resolutie (50 Hz frequentierespons) de 3D-verplaatsing van een bewegende fluorescerende deeltjes op lengteschalen van honderden micron 2. De methode is gebaseerd op een terugkoppelalgoritme dat de hardware van een twee-foton laser scanning microscoop om een cirkelbaan uitvoeren rond het object besturingselementen worden gevolgd: het terugkoppelingsmechanisme de fluorescerende voorwerp in het midden te bewerkstelligen door de verplaatsing van de aftastbundel 3-5. Om de voordelen van deze techniek tonen, volgden wij een snel bewegende organel, het lysosoom, in aliving cel 6,7. Cellen werden volgens standaardprotocollen, en gekleurd met een commercieel lysosoom kleurstof. We bespreken kort de hardwareconfiguratie en gedetailleerder de besturingssoftware, een 3D orbitale tracking-experiment uitgevoerd in levende cellen. We bespreken in detail de parameters vereist om de scanning microscoop bedienen en kan de beweging van de bundel in een gesloten baan rond de deeltjes. We slot tonen hoe deze werkwijze effectief kan worden gebruikt om de snelle beweging van een gemerkt lysosoom langs microtubules in 3D spoor binnen een levende cel. Lysosomen kan bewegen met een snelheid in het bereik van 0,4-0,5 um / sec, kenmerkend weergeven van een gerichte beweging langs het microtubule netwerk 8.
Introduction
Een groot aantal benaderingen ontwikkeld om datum fluorescerende deeltjes sporen in drie dimensies met behulp van een microscoop. De meeste benaderingen afhankelijk van het gebruik van snelle camera ideaal te sporen in twee dimensies, meestal in combinatie met aangepaste wijzigingen van de emissie optiek van de microscoop volgen verwezenlijking in de axiale richting. Laser scanning microscopen (hetzij confocale of twee fotonen) gewoonlijk een fluorescerend deeltje door het uitvoeren van een tijdsvolgorde van z-stacks volgen, hoewel dit proces typisch tijdrovend en levert redelijk tijdsresolutie (10 Hz) indien het deeltje wordt bijgehouden is in het centrum van een raster imaging gebied gehouden door actief terugkoppelingsmechanisme 2.
Het idee van vast blijven zitten aan het deeltje is de basis van de orbitale volgmethode. In plaats van een raster scan een cirkelbaan wordt uitgevoerd rond de fluorescerende deeltjes. De intensiteit van de fluorescentie langsde baan nauwkeurig lokaliseert het deeltje positie 4.
De gelokaliseerde positie van het deeltje kan dan worden gebruikt om de microscoop scanners en re-center de baan van het deeltje stand bedienen. De galvanometer scanners van de microscoop worden aangedreven door een analoge spanning. De AC component van deze spanning maakt het uitvoeren van een baan met de gefocusseerde laserbundel, bijvoorbeeld een sinus en cosinus golf toegepast op de X en Y aftastspiegels zal uitvoeren een cirkelbaan. De DC offset van het signaal vergemakkelijkt de positie van de baan centrum. Zodra een baan periode wordt vastgesteld en de golfvorm van het AC-signaal is geconfigureerd, het feedback systeem moet alleen de DC-component van het signaal werken.
Een software kan het fluorescerende signaal vanuit het detectors lezen moet de scanners en de detectoren controleren, om de positie van het deeltje berekenen en actualiseren de DC offingesteld. Voor een succesvolle feedback afbeelden van een zorgvuldige keuze van de baan parameters (grootte en timing) vereist en deze parameters moeten worden aangepast op basis van de eigenschappen van de fluorescerende deeltjes die het noodzakelijk volgen is.
De fysische en wiskundige fundamenten van de techniek werden in het verleden 4,5 beschreven voor zowel 2D-en 3D-toepassingen. In dit protocol beschrijven we kort de belangrijkste hardware componenten van de installatie, en in meer detail de keuze van de parameters en het monster voorbereiding die nodig is voor een typisch experiment waardoor we na de verplaatsing van een lysosoom bij een hoge temporele resolutie binnen een levende cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Monstervoorbereiding
- Aanvullen CHOK1 cellen in weefselkweek kolven met DMEM aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 100 IU / ml penicilline 50 ug / ml streptomycine. Incubeer de cellen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
- Oogst en plaat CHOK1 cellen op een 14 mm diameter micro-goed met een oppervlak dikte van 0,16 mm. Zaad cellen voor optimale dichtheid voor imaging, rond 60-70% samenvloeiing.
- Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C, 5% CO2. Was de cellen drie keer in HBSS (Hank gebufferde zoutoplossing) en incubeer cellen in een oplossing die 50 nM Lysotracker DND26 groene en 150 nM van tubuline tracker green. Incubeer cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Optionele stap: Vóór incubatie uitvoeren tegen vlek met een mitochondriale matrix kleuring kleurstof (25 nM).
- Was de cellen drie keer in HBSS aan een ongebonden kleurstof te verwijderen. Voeg verse DMEM groeimedium voorafgaand aan IMAGing van de cellen.
2 Microscoop configuraties
De microscoop voor het deeltje volgen in de video protocol beschreven is gemonteerd op het frame van een commercieel beschikbare omgekeerde microscoop (figuur 4). Echter commerciële modules 3D orbitale deeltjes volgen zijn nu beschikbaar.
- Gebruik een Coherent Kameleon-Ultra II Ti: Sa femtosecondlaser excitatielichtbron, met een instelbare uitgang in het golflengtegebied tussen 690 nm-1040 nm.
- Zorg ervoor dat de laserstraal wordt uitgelijnd in de achterkant haven van de microscoop met IR-gecoate spiegels. De laserstraal wordt verzwakt met draaibare halvegolflengteplaat gevolgd door een lineaire polarisator calciet. Dempen van de balk, zodat het gemiddelde vermogen van het monster tussen 0,5 en 2 mW.
OPMERKING: De laserbundel wordt gereflecteerd door een paar galvanometer-motor aangedreven spiegels die de controle van de positie en de baan van de gefocusseerde bundel op het monstervlak mogelijk. In eentypische configuratie de gecollimeerde laserbundel verlaten van de galvanometer spiegels wordt geëxpandeerd (10X) die door een bundelexpander, voordat de achterzijde van het microscoopobjectief na reflectie voor kort door dichroïsche spiegel. - Verzamel het fluorescentielicht van het monster door een hoge numerieke apertuur water doelstelling (60x NA 1,2) in de lichtweg. Kies een fluorescentie-filter blok volgens de gewenste emissiegolflengte in een of twee kanaalconfiguratie. Tewerk emissie banddoorlaatfilters verder selecteren spectrale bereik van de uitgestraalde fluorescentie.
- Plaats het monster op een gemotoriseerde podium, en de fijne bewegingen van de microscoop objectief met behulp van een objectieve piëzo-controller aan te passen.
- Direct het licht van de filter kubus in fotomultiplicatorbuizen waar het signaal wordt onderscheiden en naar een digitale I / O data acquisitie kaart.
OPMERKING: De computer produceerde golfvormen zijn de analoge uitgang van de I / O-kaart en zijn provided aan de scanners elektronica. De foton telingang van de fotomultipliers en het uitgangssignaal de scanners worden gemeten en bestuurd via de I / O-kaart door het Laboratorium voor fluorescentie SimFCS Dynamics software.
3 Imaging
- Plaats de cellen op het podium en scherpstellen met doorvallende licht.
- Schakel over naar rasterscan beeldvorming om de cellen die de kleurstof hebben opgenomen te identificeren en de onderliggende microtubuli visualiseren. Identificeer het eerste gebied waar blaasje beweging aanwezig is.
- Zodra een geïsoleerde blaasje wordt geïdentificeerd, stelt u de volgende parameters voor orbitale volgen:
- Selecteer de straal van de baan om de grootte van de circulaire scan volgens de grootte van het deeltje wordt bijgehouden definiëren. Voor een punt emitter stelt de straal van de baan gelijk is aan de taille van de puntspreidingsfunctie (PSF) van de activeringsbundel gevoeligheid en respons te verhogen.
- Stel de axialeom de afstand tussen de twee banen die zijn uitgevoerd om het deeltje positie langs de axiale richting lokaliseren definiëren. Stel de axiale afstand tot 1,5-3 maal de PSF taille.
- Definieer de verblijftijd op basis van de helderheid van het deeltje naar de tijd besteed aan elk punt van de baan, die ook de foto-bleken rate zal bepalen stellen. Gebruik een verblijftijd tussen 10-100 msec.
- Stel het aantal punten in elke baan tot 64 of 128 tot periodes baan op in de orde van 4-32 msec en bieden een hoge temporele resolutie voor het bepalen van het deeltje positie.
- Wijzig de DC offset signaal naar de spiegels om de bundel op het deeltje te centreren door de grafische user interface via een cursor selectie in beeld-raster gescand.
- Begin het bijhouden door het schakelen van de microscoop modus van raster-imaging aan orbitale scannen.
- Activeer de feedback en het verzamelen van gegevens.
4 Trajectheugen Analyse
- Gebruik de programmatuur aan die bij ieder punt langs de baan en op elk tijdstip in de vorm van een "intensiteit carpet 'fluorescentie geven. De langs het tapijt verzameld intensiteit geeft informatie over de interactie van het deeltje met andere heldere objecten. Gebruik de software om zowel het traject gegevens (tijd van de x, y scanners en de z -piezo namelijk de DC-verschuiving) en de fluorescentie-intensiteit vanuit het fotovermenigvuldigingsbuis tijd in de vorm van tijdreeksen weergegeven.
- Gebruik de tijdreeksen vertegenwoordiging en de 'intensiteit tapijt' informatie om slechts een regio van belang in het traject te kiezen.
- Gebruik de software om een 2D-projectie van de gekozen deel van het partikeltraject geven. Selecteer de juiste controles om de kleur-code het traject volgens het deeltje fluorescentie-intensiteit.
- Selecteer de optie voor het weergeven partikel traject in 3D, en de kleur-code is volgens de fluorescentie-intensiteit. Draai het traject in 3D met behulp van de knoppen aan de kenmerken van het lysosoom beweging langs de microtubuli te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens dit protocol snel 3D deeltje volgen kan worden uitgevoerd in levende cellen met een gemodificeerd twee-foton microscoop om de verplaatsing van fluorescent gelabelde lysosomen volgen. Het experiment uitgevoerd bestaat uit het volgen een geïsoleerde lysosoom verplaatsen in de cel na het endosoom rijpingsproces 9. De lysosomen werden gekleurd met een fluorescerende groene kleurstof en opgewonden bij 930 nm benutten 2-foton excitatie. Onze gegevens tonen aan dat het mogelijk is om x, y, z verplaatsing trajecten te verkrijgen met een tijdsresolutie van 32 msec (figuur 1a). Het tapijt analyse toont de intensiteit opgenomen langs elke baan in de tijd (Figuur 1b). Tijdens het volgen van de geïntegreerde intensiteit van de geëmitteerde fluorescentie kan worden opgenomen (figuur 2a). De gereconstrueerde 3D-traject geeft een gerichte beweging, zoals kan worden verwacht van een blaasje bewegen op het microtubuli-netwerk. Eendditionally is het mogelijk om de 3D traject beeld een raster scan van de regio (figuur 2b) te correleren. Dit bevestigt de beweging van de deeltjes in de richting van een microtubule bundel.
De cellen werden tevens gekleurd met een rode marker voor mitochondriën eventuele interactie van de vesicle met deze organellen opnemen tijdens hun beweging. Het is mogelijk om de 3D baan van het deeltje in de cel (figuur 3a) in de intensiteit tapijt opgenomen van de Mitotracker fluorescentie-emissie (figuur 3b) correleren. Hierdoor kunnen we de nabijheid interacties van de vesicle nemen met het mitochondriale netwerk als functie van hun positie binnen de cel. De emissie piek opgetekend in de "mitochondriën kanaal" niet functionele informatie over de manier waarop de organellen interactie geven. Het kan alleen informatie geven over de tijd van hun interactieen de relatieve ruimtelijke positie van de fluorescerende voorwerp ten opzichte van het deeltje worden opgenomen. Deze relatieve positie wordt gewonnen uit de hoek binnen de baan waar de emissie piek wordt geregistreerd. Een schematische weergave van de microscoop gebruikten we dit experimenteel nagaan waarneembaar in figuur 4.
Figuur 1 Verplaatsing vs tijd trajecten en intensiteit tapijt. a) x, y en z lysosoom verplaatsing versus tijd sporen. b) De intensiteit traject (dat wil zeggen de langs elke cirkelbaan verticale as verzameld intensiteit tijd) geeft informatie over de fluorescentie omgeving van het deeltje. Lichtpuntjes buitenkant van de doos overeen met interacties van het deeltje met andere heldere objecten, en worden geassocieerd met sprongen in de baan als th e banen re-centra op de helderste fluorescentie bron. De boxed gebied overeen met het gedeelte van het traject tussen twee sprongen.
Figuur 2 Na de 3D-traject van een lysosoom. a) 3D-reconstructie van een gedeelte van de baan van een lysosoom verzameld middels particle tracking. Het traject heeft een kleurcode voor de fluorescentie-intensiteit verzameld van het deeltje (rood, hoog, blauw, lage foton tellingen). Assen schalen zijn in nm. Merk op dat x, y, z assen verschillende reeksen. B) 2D projectie van het 3D traject weergeven van een overlay van de baan boven de microtubule afgebeeld in een raster direct scannen nadat de bal werd verzameld. C) Mitochondria gekleurd met Mitotracker .
re 3 "src =" / files / ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg "/>
Figuur 3 Uitbreiding van de orbitale tracking meerdere kanalen (excitatie bij 930 nm). a) 3D baan van een lysosoom in de cel. b) Intensiteit tapijt in het groene kanaal (in dit kanaal verzamelde fluorescentie wordt gebruikt voor het volgen). c) Intensiteit tapijt in het rode kanaal, waar mitochondria werden gekleurd met een fluorescerende matrix gerichte kleurstof. De gebieden waar de bal in contact komt met de mitochondria (pijlpunten) verschijnen intensiteit hobbels in het tapijt, de lichtstraal die rond het lysosoom overgaat in de mitochondriale matrix.
Figuur 4 Schema's van de experimentele opstelling: aangepaste twee-foton microscoop. Schematische weergave van de laser set-up: een 2-Photon Ti: Sa laser met een bereik 690-1,040 nm was onsed, een polarisator en een halve golfplaat worden gebruikt om de excitatie stroom regelen. Alle andere items worden weergegeven in de figuur met behulp van de aangegeven afkortingen. We gebruikten een 60X objectief met een NA van 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de enorme vooruitgang van fluorescentiemicroscopie technieken en instrumentatie in de afgelopen jaren, bereiken banen van fluorescerende deeltjes in drie dimensies met een hoge tijdsresolutie is een uitdaging in het veld blijft. Indien hoge tijdsresolutie is tracking-deeltjes bereikt in twee dimensies, verlenging van de axiale richting brengt typisch een drastische vermindering van de frequentierespons van het systeem 10.
In deze video-protocol hebben we binnen de demonstratieve toepassing van het bijhouden van een individueel deeltje in drie dimensies binnen een levende cel met een hoge tijdsresolutie (32 msec in dit experiment) met twee-foton microscoop. De vereiste opstelling voor het uitvoeren van een dergelijk experiment is meestal beschikbaar voor laboratoria die laser scanning microscopie. Zowel instrument add-ons voor 3D orbitale bijhouden alsook de controle-software zijn beschikbaar op de markt, voor Commercial laser scanning microscoop, zoals die geproduceerd door Olympus. Het gebruik van een gepulseerd high power infrarood laserbron, indien beschikbaar, voordelig in het ontwerp van de experimentele opstelling omdat het niet de-scanning van de geëmitteerde fluorescentie vereist. Verder werd in het verleden aangetoond dat infrarood straling is meer goedaardige naar de cel, onder bepaalde voorwaarden 11, gezien de reductie van onscherpe fluorescentie en foto-bleken.
Hoewel snel volgen van een fluorescerende deeltjes in twee dimensies kan worden uitgevoerd met behulp van een gevoelige camera, kan het ontbreken van een drie-dimensionale informatie zijn vaak beperkende interpretatie van de biofysische betekenis van het traject informatie. Bijvoorbeeld, blaasjes verplaatsen langs microtubuli vaak stuiten microtubuli kruising regio 8,12. In deze situatie is het gebruik van een 3D-tracking-techniek overwint de grens van het gebruik van 2D-projectie van een 3D-structuur.
Vanwege de tijd respons van onze doelstelling nanopositioner piëzo-apparaat, wordt de periode van de beweging in de z-as beperkt tot ongeveer 30 msec, terwijl in de x, y-richting kan het gaan om een paar msec. De lokalisatie precisie van de methode schalen als de signaalruisverhouding 4,5. De enige schijnbare beperking van de werkwijze, dat wil zeggen dat van een algemeen beeld van de omgeving van het deeltje, wordt gecompenseerd door de mogelijkheid reconstrueren temporele intensiteit tapijt 13 over de geschiedenis van de interactie van de fluorescerende deeltjes met naburige fluorescerende bronnen weergeven van ofwel dezelfde of verschillende spectrale emissie.
We laten zien dat de beweging van lysosomen, blaasjes die gericht ondergaan beweging langs microtubuli, aangedreven door ofwel kinesins of dyneins, kan worden gevolgd binnen een levende cel na kleuring met behulp van een los verkrijgbare kleurstof. Onlangs, 2D volgen van lysosomen was corropgetogen naar de super-resolutie beeldvorming van het microtubuli-netwerk, in de inspanning van het detecteren van de routes die de blaasjes te nemen op microtubuli-microtubuli kruispunten 8. 3D trajecten van de lysosomen vertonen een meer complex gedrag dan unidirectionele beweging. Hoewel een gemiddelde gerichte beweging kan worden waargenomen, buigen, draaien en mogelijke rotaties langs de tubuli worden waargenomen uit deze trajecten.
We hebben twee kritische stappen in het uitvoeren van deze experimenten onderscheiden: ten eerste moet een etiket dichtheid van de lysosomen die tegelijkertijd hoog genoeg helder gekleurde deeltjes te verkrijgen bereiken, en dat tegelijkertijd zorgt voor een dichtheid van deeltjes low hebben een volgen van individuele deeltjes mogelijk. Bij twee elkaar kruisende deeltjes, kan de microscoop van het ene deeltje naar een andere tijdens het traceren. De tweede kritische stap betreft de keus van de pixelverblijftijd, waardoor een redelijk evenwicht zijntween hoge signaal-ruisverhouding en volgsnelheid. We hebben waargenomen dat het registreren snelheid in de orde van 32 msec per cyclus volgen doorgaans voldoende om lysosomen ondergaan snelle gerichte beweging bij snelheden tot 1 um / sec volgen.
Samengevat, orbitaal tracking kan meten in drie dimensies en met een tijdsresolutie van <40 msec de intracellulaire beweging van fluorescent gemerkte vesicles. De 3D orbitale selectie heeft het potentieel om te worden gebruikt in de toekomst voor de studie van verschillende hoogdynamische cellulaire processen ons de studie van de dynamiek van chromatine real-time transcriptie en diffusie van plasmonische nanodeeltjes in het intracellulaire medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
