Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

Abstract

L'objectif de ce protocole vidéo est de discuter de la façon d'effectuer et d'analyser une expérience fluorescente en trois dimensions suivi de particules orbital en utilisant un microscope à deux photons modifié ^1. Contrairement aux approches classiques (de balayage de trame ou à grand champ basé sur une pile de cadres), le suivi orbitale 3D permet de localiser et de suivre avec une grande spatiale (10 précision nm) et la résolution temporelle (réponse en fréquence de 50 Hz) le déplacement 3D de une particule fluorescente déplacer sur la longueur des échelles de centaines de microns ^2. La méthode est basée sur un algorithme de contre-réaction qui commande le matériel de deux photons microscope à balayage laser pour effectuer une orbite circulaire autour de l'objet à suivre: le mécanisme de rétroaction maintient l'objet fluorescent dans le centre de commande du déplacement de le faisceau de balayage ^5.3. Pour démontrer les avantages de cette technique, nous avons suivi un organite se déplaçant rapidement, le lysosome, dans alcellule iving ^6,7. Les cellules ont été étalées selon des protocoles standard, et colorées à l'aide d'un colorant dans le commerce lysosome. Nous discutons brièvement la configuration matérielle et plus en détail le logiciel de contrôle, à réaliser une expérience de suivi orbitale 3D à l'intérieur des cellules vivantes. On discute en détail les paramètres nécessaires afin de contrôler le microscope à balayage et permettre le mouvement de la poutre sur une orbite fermée autour de la particule. Nous concluons en démontrant comment cette méthode peut être utilisée efficacement pour suivre le mouvement rapide d'un lysosome marqué le long des microtubules en 3D dans une cellule vivante. Les lysosomes peuvent se déplacer à des vitesses de l'ordre de 0,4-0,5 um / s, en affichant un mouvement généralement dirigé le long du réseau de microtubules ^8.

Introduction

Un grand nombre d'approches ont été développées à ce jour pour suivre les particules fluorescentes dans trois dimensions à l'aide d'un microscope. La plupart des approches reposent sur l'utilisation de caméras rapides, parfaitement adapté pour suivre en deux dimensions, typiquement combinées avec les adaptations personnalisées de l'optique d'émission du microscope pour réaliser un suivi dans le sens axial. microscopes à balayage laser (soit confocale ou deux photons) conventionnelle peut suivre une particule fluorescente en effectuant une séquence temporelle de z-piles, même si ce processus est généralement beaucoup de temps, et donne la résolution de temps raisonnable (10 Hz) que si la particule étant suivi est conservé dans le centre d'une petite région de formation d'image tramée par un mécanisme de rétroaction actif ^2.

L'idée de l'immobilisation de la particule est la base de la méthode de suivi orbital. Au lieu d'une trame numériser une orbite circulaire est réalisée autour de la particule fluorescente. L'intensité de la fluorescence le long del'orbite localise précisément la position des particules ^4.

La position localisée de la particule peut ensuite être utilisé pour actionner les scanners de microscope et recentrer les orbites de la position de la particule. Les scanners galvanométriques du microscope sont entraînés par une tension analogique. La composante alternative de cette tension permet d'effectuer une orbite avec le faisceau laser focalisé, c'est à dire un sinus et une onde cosinus appliquée à des miroirs X et Y balayage permettant d'effectuer une orbite circulaire. Le décalage en courant continu du signal facilite le changement de la position du centre de l'orbite. Une fois la période de l'orbite est déterminée et la forme d'onde pour le signal en courant alternatif est configuré, le système de rétroaction a besoin pour mettre à jour uniquement la composante continue du signal.

Un logiciel capable de lire le signal fluorescent recueillies par les détecteurs est nécessaire pour contrôler les scanners et les détecteurs, de calculer la position de la particule et mettre à jour la DC horsdéfinir. Pour un retour réussi imagerie d'un choix judicieux des paramètres orbitaux (taille et de synchronisation) est nécessaire et ces paramètres doivent être ajustés en fonction des caractéristiques des particules fluorescentes, il est nécessaire de suivre.

Les fondements physiques et mathématiques de la technique ont été décrites dans le passé ^{de 4,5} pour les applications 2D et 3D. Dans ce protocole, nous décrivons brièvement les principaux composants matériels de l'installation, et plus en détail le choix des paramètres et la préparation de l'échantillon nécessaire pour une expérience typique qui nous a permis suite au déplacement d'un lysosome à une haute résolution temporelle dans une cellule vivante.

Protocol

Préparation de l'échantillon 1

1. Maintenir des cellules CHOK1 dans des flacons de culture de tissus à l'aide de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal et 100 UI / ml de pénicilline 50 pg / ml de streptomycine. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 5% _de CO2 à 37 ° C.
2. Récolte et ensuite sur l'assiette cellules CHOK1 un diamètre de micro-puits de 14 mm avec une épaisseur de 0,16 mm de surface. cellules de semences pour la densité optimale pour l'imagerie, environ 60-70% de confluence.
3. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C, 5% CO _2. Laver les cellules trois fois dans du HBSS (solution saline tamponnée de Hank), et incuber les cellules dans une solution contenant 50 nM de Lysotracker DND26 vert et 150 nM de la tubuline traqueur vert. Incuber les cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Etape facultative: Avant l'incubation, effectuer une tache supplémentaire avec un colorant matrice de coloration mitochondriale (25 nM).
4. Laver les cellules trois fois dans du HBSS pour éliminer tout colorant non lié. Ajouter milieu de croissance DMEM frais avant imagtion des cellules.

2. Configurations microscope

Le microscope pour le suivi des particules décrites dans le protocole vidéo est montée sur le châssis d'un microscope inversé disponible dans le commerce (Figure 4). Cependant modules commerciaux pour le suivi des particules orbitale 3D sont maintenant disponibles.

1. Utilisez un II cohérente Chameleon Ultra-Ti: source de lumière d'excitation laser femtoseconde Sa, avec une gamme accordable sortie d'onde comprise entre 690 nm-1040 nm.
2. Assurez-vous que le faisceau laser soit aligné sur l'orifice arrière du microscope en utilisant un miroir à revêtement IR. Le faisceau laser est atténué à l'aide d'une lame demi-onde tournante suivie d'un polariseur linéaire de calcite. Atténuer le faisceau de telle sorte que la puissance moyenne de l'échantillon est compris entre 0,5 et 2 mW.
   NOTE: Le faisceau laser est réfléchi par une paire de miroirs actionnés galvanomètre moteurs qui permettent le contrôle de la position et de la trajectoire du faisceau focalisé dans le plan de l'échantillon. Dans unconfiguration typique du faisceau laser collimaté sortant de miroirs de galvanomètre agrandi (10X) passant à travers un élargisseur de faisceau, avant d'entrer à l'arrière de l'objectif de microscope, après réflexion sur courte passe-miroir dichroïque.
3. Collecter la lumière de fluorescence provenant de l'échantillon en plaçant un objectif de l'eau à grande ouverture numérique (60X, NA 1,2) dans le trajet de la lumière. Choisir un cube de filtre de fluorescence en fonction de la longueur d'onde d'émission souhaitées dans une ou l'autre configuration d'un ou deux canaux. Utiliser des filtres passe-bande d'émission pour sélectionner en outre la gamme spectrale de la fluorescence émise.
4. Placer l'échantillon sur une platine motorisée, et ajuster l'amende mouvement de l'objectif de microscope à l'aide d'un piézo-contrôleur objectif.
5. Diriger la lumière à partir du cube de filtre dans des tubes photomultiplicateurs où le signal est discriminé et envoyé à une carte E / S d'acquisition de données numériques.
   REMARQUE: Ordinateur généré des formes d'onde sont la sortie analogique de la carte E / S et sont provided pour les scanners de contrôle électronique. L'entrée de comptage de photons à partir des photomultiplicateurs et le signal de sortie pour les scanners sont mesurés et contrôlés par l'intermédiaire de la carte d'E / S par le Laboratoire de logiciel de dynamique de fluorescence SimFCS.

3. Imaging

1. Placez les cellules sur la scène et de se concentrer en utilisant un éclairage lumière transmise.
2. Mettre à balayage de trame imagerie pour identifier les cellules qui ont incorporé le colorant et de visualiser les microtubules sous-jacents. Identifier la zone initiale où le mouvement des vésicules est présent.
3. Une fois une vésicule isolé est identifié, définissez les paramètres suivants pour le suivi orbital:
   1. Sélectionner le rayon de l'orbite de définir la taille du balayage circulaire en fonction de la taille de la particule est suivie. Pour un émetteur ponctuel, définir le rayon de l'orbite égale à la taille de la fonction de flou (PSF) du faisceau d'excitation pour maximiser la sensibilité et la réponse.
   2. Réglez le axialdistance pour définir la distance entre les deux orbites qui sont exécutées pour localiser la position de la particule suivant la direction axiale. Réglez la distance axiale à 1,5-3 fois la taille de la PSF.
   3. Définir la durée de séjour en fonction de la luminosité de la particule pour définir le temps consacré à chaque point de l'orbite, ce qui permettra également de déterminer le taux de photo-blanchiment. Utilisez un temps d'arrêt entre 10-100 microsecondes.
   4. Définissez le nombre de points dans chaque orbite à 64 ou 128 pour obtenir des périodes orbitales de l'ordre de 4-32 ms et fournir une haute résolution temporelle pour déterminer la position de la particule.
4. Changer le signal de décalage à courant continu envoyée à miroirs afin de centrer le faisceau sur la particule par l'intermédiaire de l'interface utilisateur graphique par l'intermédiaire d'un curseur de sélection dans l'image de balayage de trame.
5. Commencer à suivre en changeant de mode de raster-imagerie microscope à balayage orbital.
6. Activer la collecte de commentaires et données.

4. TrajectAnalyse ory

1. Utilisez le logiciel pour afficher la fluorescence collectées à chaque point le long de l'orbite et à chaque point de temps sous la forme d'un «tapis d'intensité». L'intensité recueillie sur le tapis contient des informations sur l'interaction de la particule avec d'autres objets lumineux. Utiliser le logiciel pour afficher à la fois les informations de trajectoire (c'est à dire le déplacement continu au cours du temps de la x, scanners y et des z -piezo) ainsi que l'intensité de fluorescence collecté par le tube photomultiplicateur au cours du temps sous forme de séries chronologiques.
2. Utiliser la représentation de série de temps et l'information "d'intensité de tapis» à sélectionner uniquement une région d'intérêt dans la trajectoire.
3. Utiliser le logiciel pour afficher une projection 2D de la partie sélectionnée de la trajectoire des particules. Sélectionnez les contrôles appropriés à code couleur de la trajectoire selon l'intensité de fluorescence des particules.
4. Sélectionnez l'option pour afficher la pagearticle trajectoire en 3D, et un code couleur en fonction de l'intensité de fluorescence. Tournez la trajectoire en 3D en utilisant les contrôles de visualiser les caractéristiques de la motion de lysosome le long des microtubules.

Representative Results

Selon ce protocole suivi rapide de particules isolées 3D peut être effectué à l'intérieur de cellules vivantes à l'aide d'un microscope à deux photons à jour pour suivre le déplacement des lysosomes marquées par fluorescence. L'expérience réalisée consiste en un suivi de lysosome isolée se déplaçant à l'intérieur de la cellule après le processus de maturation de l'endosome ^9. Les lysosomes ont été colorées en utilisant un colorant vert fluorescent et excités à 930 nm exploitant 2-photon excitation. Nos données montrent qu'il est possible d'obtenir x, y, z des trajectoires de déplacement avec une résolution temporelle de 32 ms (figure 1A). L'analyse de la moquette affiche l'intensité enregistrée le long de chaque orbite au cours du temps (figure 1b). Pendant le suivi de l'intensité intégrée de la fluorescence émise est enregistrée (figure 2a). La trajectoire 3D reconstruite affiche un mouvement dirigé, comme on peut s'y attendre d'une vésicule se déplaçant sur le réseau de microtubules. An outre, il est possible d'établir une corrélation entre la trajectoire en 3D pour une image de balayage de trame de la région environnante (figure 2b). Ceci confirme le déplacement de la particule le long de la direction d'un faisceau de microtubules.

Les cellules ont été colorées en outre avec un marqueur rouge pour les mitochondries pour enregistrer interaction éventuelle de la vésicule de ces organites au cours de leur mouvement. Il est possible d'établir une corrélation entre la trajectoire en 3D de la particule à l'intérieur de la cellule (figure 3a) pour le tapis de l'intensité enregistrée à partir de l'émission de fluorescence de Mitotracker (Figure 3b). Cela nous permet d'enregistrer les interactions de proximité de la vésicule avec le réseau mitochondrial en fonction de leur position au sein de la cellule. Le pic d'émission enregistrée dans le "canal de mitochondries" ne donne pas d'informations fonctionnelles sur la façon dont les organites interagissent. Il peut fournir que des informations sur le moment de leur interactionet la position spatiale relative de l'objet fluorescent par rapport à la particule étant suivi. Cette position relative est extrait à partir de l'angle à l'intérieur de l'orbite où le pic d'émission est enregistrée. Une représentation schématique du microscope, nous avons utilisé pour réaliser cette expérience, on peut observer sur la figure 4.

Figure 1 Déplacement vs trajectoires de temps et tapis d'intensité. a) x, y et z par rapport à un déplacement de lysosome traces de temps. b) L'intensité de la trajectoire (par exemple l'intensité recueillie le long de chaque axe vertical de l'orbite circulaire est de temps) fournit des informations sur l'environnement de fluorescence de la particule. Les points lumineux à l'extérieur de la boîte correspondent à des interactions de la particule avec d'autres objets lumineux, et sont associées à des sauts dans la trajectoire que e e orbites recentre sur la source de fluorescence brillante. La région encadrée correspond à la partie de la trajectoire entre deux sauts.

Figure 2: la suite de la trajectoire 3D d'un lysosome. a) la reconstruction en 3D d'une partie de la trajectoire d'un lysosome recueillies en utilisant le suivi des particules. La trajectoire est codé en couleur pour l'intensité de fluorescence recueilli de la particule (rouge, élevé, bleu, une faible numération de photons). Échelles des axes sont en nm. Notez que x, y, z axes ont différentes plages. Saillie b) 2D de la trajectoire en 3D, l'affichage d'une superposition de la trajectoire au-dessus de la microtubule imagé dans un balayage de trame, immédiatement après la trajectoire a été recueilli. C) Les mitochondries colorées avec Mitotracker .

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L'extension de la figure 3 orbital suivi à plus d'un canal (excitation à 930 nm). a) la trajectoire en 3D d'un lysosome dans la cellule. b) Intensité tapis dans le canal vert (la fluorescence recueillie dans cette voie est utilisée pour le suivi.) c) Intensité tapis dans le canal rouge, où les mitochondries ont été colorées avec une matrice fluorescente rouge colorant ciblée. Les régions où la trajectoire entre en contact avec les mitochondries (têtes de flèches) apparaissent sous forme de bosses d'intensité dans le tapis, comme le faisceau en orbite autour de la traverse lysosome dans la matrice mitochondriale.

Figure 4: Schéma du dispositif expérimental: modifié à deux photons microscope. Représentation schématique du laser mis en place: un 2-Photon laser Ti: Sa avec une gamme 690-1,040 nm nous étaited, un polariseur et une lame demi-onde sont utilisées pour contrôler la puissance d'excitation. Tous les autres éléments sont répertoriés dans la figure en utilisant les abréviations indiquées. Nous avons utilisé un objectif 60X avec un NA de 1,2.

Discussion

Malgré les énormes progrès des techniques de fluorescence en microscopie et instrumentations au cours des dernières années, la réalisation de trajectoires de particules fluorescentes en trois dimensions avec une résolution temporelle est restée un défi dans le domaine. Si une haute résolution temporelle a été atteinte particules de repérage à deux dimensions, l'extension à la direction axiale apporte généralement une réduction drastique de la réponse en fréquence du système ^10.

Dans cette vidéo, nous nous sommes concentrés protocole sur l'application démonstrative de suivre une particule individuelle en trois dimensions dans une cellule vivante avec une haute résolution temporelle (32 ms dans cette expérience) à l'aide d'un microscope à deux photons. La configuration requise pour effectuer une telle expérience est généralement disponible pour les laboratoires qui effectuent la microscopie à balayage laser. Les deux instruments add-ons pour le suivi orbitale 3D ainsi que le logiciel de commande sont disponibles sur le marché, pour commercial microscopes à balayage laser tels que ceux fabriqués par Olympus. L'utilisation d'une source laser infrarouge de forte puissance pulsé, le cas échéant, est avantageux dans la conception du dispositif expérimental car il ne nécessite pas de balayage dé de la fluorescence émise. En outre, il a été démontré dans le passé que l'irradiation infrarouge est plus bénigne vers la cellule, dans des conditions spécifiques ^11, compte tenu de la réduction de la fluorescence de mise au point et de photo-blanchiment.

Bien que rapide suivi d'une particule fluorescente à deux dimensions peut être réalisée en utilisant une caméra sensible à l'absence de toute information en trois dimensions peut être souvent limiter l'interprétation de la signification de la biophysique informations de trajectoire. Par exemple, les vésicules se déplaçant le long des microtubules se heurtent fréquemment à des régions microtubules d'intersection ^8,12. Dans cette situation, l'utilisation d'une technique de poursuite 3D permet de surmonter la limitation de l'utilisation de projections en 2D d'une structure 3D.

En raison de la réponse temporelle de notre dispositif nanopositionneur piézo objectif, la période du mouvement de l'axe z est limitée à environ 30 ms, tandis que dans les directions x, y, il peut descendre à quelques ms. La précision de la localisation de la méthode des échelles que le rapport signal à bruit de ^4,5. La seule limitation apparente de la méthode, à savoir la perte d'une vision globale de l'environnement de la particule, est compensée par la possibilité de reconstruire un tapis d'intensité temporelle ^13, retraçant l'histoire des interactions de la particule fluorescente avec des sources fluorescentes voisins, l'affichage soit la même ou une émission spectrale différente.

Nous montrons que le mouvement des lysosomes, des vésicules qui subissent dirigés mouvement le long des microtubules, alimenté soit par kinésines ou dynéines, peut être suivie, dans une cellule vivante après coloration à l'aide d'un colorant disponible dans le commerce. Récemment, un suivi en 2D des lysosomes a correxalté à la super-résolution de l'imagerie du réseau de microtubules, de l'effort de détecter les voies que les vésicules prennent aux intersections des microtubules microtubules ^8. Trajectoires 3D des lysosomes affichent un comportement plus complexe que le mouvement unidirectionnel. Bien qu'un moyen dirigé mouvement peut être observé, flexion, de torsion et de rotations possibles le long des tubules peuvent être observées à partir de ces trajectoires.

Nous avons identifié deux étapes critiques dans l'exécution de ces expériences: d'abord, il est nécessaire de parvenir à une densité de marquage des lysosomes qui est en même temps suffisamment élevé pour obtenir des particules de couleurs vives colorées, et qui en même temps offre une densité de particules de faible suffisant pour permettre le suivi des particules individuelles. Dans le cas de deux particules de passage, le microscope peut passer d'une particule à l'autre tout en suivant. La deuxième étape critique concerne le choix du temps de séjour de pixels, ce qui permet un équilibre raisonnable soitinterpoler haut rapport signal sur bruit et de la vitesse de suivi de piste. Nous avons observé que la vitesse de suivi de l'ordre de 32 ms par cycle de suivi sont généralement suffisantes pour suivre les lysosomes subissant le mouvement dirigé rapide à des vitesses inférieures à 1 um / s.

En résumé, le suivi orbital permet de mesurer en trois dimensions et avec une résolution temporelle de 40 ms <l de mouvement intracellulaire des vésicules marquées par fluorescence. Le suivi orbitale 3D a le potentiel pour être utilisé à l'avenir pour l'étude des différents processus cellulaires très dynamiques tels nous l'étude de la dynamique de la chromatine en temps réel la transcription et de diffusion de nanoparticules plasmoniques dans le milieu intracellulaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
Tubuline tracker Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Coherent Chamelon- ultra II TI	Coherent
Glan Taylor Calcite Polarizer	Melles Griot	03PTA001
Galvanometer-motor mirror	Cambridge Technologies	M 6350
Dichroic mirror	Chroma Technologies	700 DCSPXR
Motorized stage	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H7422P-40
Data acquisition card	IO tech	PCI 1128-4000
Imaging software	LFD	Global for images-SimFCS