Introduction
Le compartiment axonal des neurones montre un grand degré d'indépendance fonctionnelle du compartiment somato-dendritique. Dans les neurones de projection, les axones contiennent la majeure partie de la protéine de 1,2 neuronale. L'étude de la physiologie et la physiopathologie des axones a pris de l'ampleur dans la communauté des neurosciences car des études récentes ont montré que la dysfonction axonale précoce semble être une caractéristique commune des maladies neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques 3. Il semble probable qu'une meilleure compréhension des mécanismes de axonales exclusive dans des conditions normales et pathologiques fera la lumière sur les événements précoces qui conduisent un dysfonctionnement.
Le présent protocole décrit comment utiliser les inserts de culture portant une membrane poreuse (filtre) pour obtenir de grandes quantités de matériau pur axonale qui est approprié pour l'analyse biochimique et immunocytochimique. L'utilisation de cartouches filtrantes pour étudier la biologie axonale a été mis en œuvre par Steward et4 collègues et d'autres développés par Twiss et ses collègues 5 à sa configuration actuelle. La technique est maintenant en cours d'utilisation par des groupes qui étudient différents aspects de axonale et dendritique biologie, avec de légères modifications dans chaque cas à accueillir pour la population de neurones étudiés, les traitements effectués et le type d'analyses biochimiques utilisés 6-9. Le présent protocole n'a pas l'intention d'accueillir toutes les alternatives pour une telle variété d'applications, mais plutôt de fournir une approche simple qui convient à la plupart des applications. En particulier, le protocole décrit ici utilise un revêtement triple qui maximise le rendement des axones pour les analyses biochimiques et est le plus approprié pour étudier axonales revêtements de dégénérescence-autres décrits dans la littérature produite moins axones qui se rétractent et dégénèrent rapidement en cas de privation de facteurs trophiques 9.
Dans cette procédure, les corps cellulaires neuronaux restent isolés au sommet de la wh de filtreaxones ile passent à travers les pores et se développent le long de sa surface inférieure. Axones purs (gratuite, la glie et les neurones contaminants du corps cellulaire) qui se développent sur la surface inférieure du filtre peuvent être collectés pour des analyses biochimiques ou peuvent être fixés in situ et examinés par des techniques immunocytochimiques 9. Le procédé repose sur l'utilisation de neurones sensoriels embryonnaires du ganglion de la racine dorsale (DRG). DRG embryonnaires sont largement utilisés pour étudier la biologie axonale car neurites de ces cellules subissent une croissance rapide et robuste in vitro lorsqu'il est maintenu dans facteur de croissance nerveuse (NGF), et parce qu'ils subissent rapidement la dégénérescence lorsqu'ils sont privés de ce facteur. En outre, les neurones DRG manquent dendrites, de sorte que tous les neurites recueillies par cette méthode sont purement axones.
inserts de filtre représentent un grand avantage par rapport aux autres approches utilisées pour étudier les axones. Des études reposant sur l'utilisation de la microscopie à différencier les processus se produisant dans le corps cellulaire de celles dans unXons fournissent des informations biochimiques limitée. Comme autre exemple, les systèmes de culture compartimentés (par exemple, les chambres de Campenot 10 ou dispositifs microfluidiques 11) sont utiles pour les approches d'imagerie et de traitement différencié des compartiments cellulaires, mais ne fournissent que des petites quantités de matériel axonal, empêchant l'utilisation de ces techniques pour les analyses biochimiques qui nécessitent des quantités relativement importantes de l'échantillon. En outre, leur utilisation nécessite une formation importante ainsi que des dispositifs spécialisés, et ils prennent beaucoup de temps. Une autre approche souvent utilisée pour isoler les axones à partir d'explants est de supprimer manuellement un centre d'explantation (contenant les corps cellulaires neuronaux) avant la collecte de l'échantillon axonale. Même si cela peut produire de grandes quantités de préparations axonales enrichi, les axones de cette préparation peuvent être enveloppés dans des cellules gliales et éliminer rapidement les corps des 20 explants consécutivement à partir de 6 puits (à titre d'exemple d'une expérience minimum) prend du temps et à la limite de la faisabilité.
En revanche, la méthode présentée ici produit des préparations axonales abondante et pure qui peut être ensuite analysé par pratiquement n'importe quelle technique biochimique qui est couramment utilisé pour analyser les lysats de cellules entières, comme Western blot, immunoprécipitation 6, transfert de Northern 5 par spectrométrie de masse 6, la purification de l'ARN 7,12,13, entre autres. En outre, le protocole peut être appliqué à immunofluorescence (IF) techniques, comme il est possible de fixer les axones en croissance dans le côté inférieur du filtre à examiner plus en détail les IF. Cette approche facilite grandement l'analyse des processus spécifiques axonales car il n'y a pas de corps cellulaires dans la préparation finale. C'est un avantage important car un signal haute immunofluorescence de corps cellulaires mine souvent l'examen et l'analyse d'un signal faible provenant de structures minces tels que des axones.
Deux applications du procédé de culture pour étudier la dégénérescence axonale are décrit; un modèle de taille de développement et un modèle de dégénérescence induite par une lésion (communément appelée dégénérescence comme wallérienne). La modélisation de l'élagage de développement est basé sur le fait que les neurones sensoriels in vivo en concurrence pour des montants de NGF cible dérivé et ceux ne recevant pas assez dégénéré de support neurotrophique 14 limiter. Ce phénomène peut être mimée dans des cultures de DRG embryonnaires par le retrait de NGF à partir du milieu de culture, ce qui, comme cela se passe in vivo, déclenche une dégénérescence axonale suivie de destruction du corps de la cellule. Pour modéliser la dégénérescence wallérienne, la partie supérieure du filtre avec les corps cellulaires est grattée. Les axones qui avaient poussé sur le côté inférieur du filtre séparées physiquement les corps cellulaires et subir par la suite, le processus dégénératif rapide et stéréotypé appelé dégénérescence wallérienne 15, nommé d'après A. Waller qui a le premier signalé le phénomène en 1850 16.
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Protocol
REMARQUE: Les procédures suivantes sont conformes aux lignes directrices approuvées par le Conseil canadien de protection des animaux. Tous les efforts sont faits pour minimiser la douleur et la détresse des animaux pendant les procédures.
1. Revêtement de filtres
REMARQUE: Lorsque les inserts de filtre de culture sont placés dans des puits de plaques à puits multiples, deux compartiments sont définis: le compartiment supérieur est au-dessus de la région de l'insert et le compartiment inférieur est l'une au-dessous de l'insert Figure 1A.ab. Les explants sont ensemencées dans le compartiment supérieur où qu'ils attachent à la partie supérieure du filtre; de nombreux axones se développent à travers le filtre et s'étendent sur la face inférieure du filtre, dans le compartiment inférieur Figure 1A.c. Les volumes de travail standard (c'est à dire pour appliquer la solution de revêtement, les lavages, les milieux de culture, etc) sont de 2 ml pour le compartiment inférieur et 1 ml pour le compartiment supérieur et vont être mentionné dans le protocole "; Volumes standard ". Ajouter solutions en commençant par le compartiment de fond en plaçant la pointe de la pipette dans l'espace entre l'insert et le côté du puits. En outre, l'inclinaison de l'insert d'un côté tandis que la distribution de la solution pour empêcher des bulles d'être piégé dans le fond du filtre.
- Lancer le revêtement des filtres la veille placage. En vertu de la culture de tissus hotte stérile, placer 24 cartouches filtrantes mm dans une plaque à 6 puits de réception. Incuber les inserts de poly-D-lysine dans l'eau (1 mg / ml) pendant 1 heure à température ambiante en utilisant des volumes standard: 2 ml dans le compartiment inférieur et de 1 ml dans la partie supérieure.
- Aspirer la poly-D-lysine et rincer une fois avec de l'eau. Aspirer l'eau, fermer le couvercle et laisser les plaques sécher dans la hotte O / N. Pendant l'aspiration de liquides, veillez à retirer un reste de liquide qui se retrouve piégé directement sous le filtre.
- Le lendemain matin, diluer la laminine dans l'eau (10 pg / ml), mélanger et chaud à 37 ° C. Incuber inserts avec la laminine 1 h dans cell incubateur à 37 ° C, en utilisant des volumes standard.
- Aspirer la laminine et le collagène ajouter dans de l'eau (0,1 mg / ml) et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Dans ce cas, utiliser 2 ml pour le compartiment inférieur et 2 ml pour le compartiment supérieur.
- Aspirer le collagène et laver une fois avec de l'eau stérile. Les filtres sont maintenant prêts à recevoir des milieux de culture et des explants DRG, comme décrit à l'étape 3.
2. Dissection embryonnaire ganglion de racine (DRG) explants
- Anesthésier une souris femelle enceinte de 13 jours par une injection IP de Avertin (250 mg / kg). Attendez 10-15 minutes et vérifier l'absence de réflexes de retrait de la cornée et la pédale. Une fois les réflexes sont absents, effectuer dislocation cervicale.
- Désinfecter tous les instruments chirurgicaux et abdomen de la femelle avec 70% d'éthanol. Permettre aux instruments à sécher. Maintenir la peau de l'abdomen et de couper à travers les couches de peau et de muscle pour exposer la cavité abdominale.
- Enlever l'utérus en détachant du col de l'utérus et des ovaires. Dans un sterile capot, retirez les embryons de l'utérus avec des ciseaux et les recueillir dans une boîte de Pétri remplie avec les médias de L15 glacée. Garder sur la glace.
REMARQUE: Se reporter aux rapports techniques précédentes pour plus de détails sur la façon d'obtenir des embryons de 13 jours de gestation 17,18. - Sous le microscope, jeter l'embryon d'un côté et utiliser de petits ciseaux à ressort pour enlever la tête. Faire une incision le long des côtés latéraux pour annuler la poitrine, le ventre, les membres et la queue. Gardez le dos contenant la colonne vertébrale, poser face ventrale et retirez tous les organes viscéraux.
- Avec de petits ciseaux à ressort, exposer la moelle épinière ensemble en coupant la colonne vertébrale de sa face ventrale le long de la ligne médiane. Maintenez la carcasse vers le bas avec une paire de pinces (n ° 3) et utiliser une deuxième paire de tenir la moelle épinière par son aspect le plus rostral.
- Lentement et doucement tirer sur le cordon loin de la cavité vertébrale et pincer DRG de la moelle épinière à l'aide de pinces ultra-minces (# 5). Groupe GHM à percevoir surle fond de la boîte.
- Recueillir DRG groupés par aspiration avec une pipette 200 ul qui a été coupé pour agrandir son ouverture. Placez les DRG dans un tube et laisser sur la glace jusqu'à ce que la collecte des DRG est terminée.
NOTE: conseils Blanc / transparentes sont préférés car DRG ne collent pas aux parois de cette pointe (par rapport à pointes jaunes standards). Conseils de chasse avec les médias avant l'utilisation empêche en outre DRG de coller à ses murs.
3. Semis et entretien de ganglion de racine explants sur les filtres
- Ajouter un média DRG complet à 37 ° C pour les inserts enrobés utilisant des volumes standard. Compléter le support de compartiment inférieur avec 15 ng / ml de NGF, tout en gardant le compartiment supérieur NGF libre.
NOTE: Bien que le NGF diffuse efficacement à travers le filtre et sa concentration s'équilibre en quelques heures, nous avons observé que l'application de NGF pour le compartiment inférieur juste avant le semis augmente significativement le rendement de axonale sur le bOttom surface du filtre. - Transférer les DRG du tube aux filtres en utilisant une pipette de 1000 pi avec une pointe taillée pour agrandir son ouverture.
- Dessiner le média dans l'embout 2-3x avant de recueillir les DRG. Cela les empêche de coller sur la face intérieure de la pointe. La même astuce peut être réutilisée pour tous les puits. L'utilisation de conseils non coloré (contre pointes bleues standards) réduit DRG coller à la surface de la pointe.
- Pour transférer des DRG, mettre la pipette à 800 pi. Aspirer environ 200 pi de milieu de la face supérieure du filtre, puis aller dans le tube contenant DRG et la pipette un petit volume de haut en bas - pour remettre en suspension les GHM qui ont coulé au fond. Aspirer la totalité du volume et DRG de pipette submergeant la pointe au milieu de la pièce.
- Une fois tous les inserts sont chargés, fermez le couvercle de la plaque et agiter la plaque 10x, tapotant sur le banc de la hotte entre chaque tourbillon. Ces mouvements augmenter le rendement des axones en aidant les explants DRG évier etattacher au filtre. Cela permet aussi de distribuer des explants uniformément de sorte que les axones de différents explants ne se chevauchent pas.
REMARQUE: La procédure de l'ensemencement d'explant est décrit dans les étapes précédentes augmente de manière significative le taux global de fixation de l'explant au substrat (jusqu'à 75%). Plus important encore, la procédure de pipetage facilement explants empêche de flotter sur la surface du support, au lieu de tomber au fond de l'insert. - Pour les analyses biochimiques, les GHM de semences de un embryon (environ 30) par filtre. Pour les analyses morphologiques, utilisez la moitié ou un tiers des DRG d'un embryon (10-15). Cette décision doit être prise avant la collecte des DRG dans des tubes, de sorte que tous les DRG d'un tube sont ensemencées dans un seul puits (si elle est de 30, 15 ou 10 DRG).
- Maintenir les cultures dans un incubateur de cellules à 37 ° C, changer de support tous les 2-3 jours. Pour changer de support, aspirer le compartiment supérieur en premier, suivi par le compartiment inférieur. Ajouter un milieu frais en volume standards en commençant par le compartiment inférieur.
REMARQUE: Pour éviter cellules / axones de séchage, ne pas changer de support en plus de 3 inserts en même temps. DRG cultivés sur des filtres en présence de NGF s'étendront axones longs, atteignant jusqu'à 2 mm après 2 jours de culture.
4. Trophique Facteur traitement retrait
Retrait NGF induit une dégénérescence axonale à la fragmentation axonale (déterminé par contraste de phase et β-III-tubuline SI) qui apparaît d'abord autour de 12 heures après le retrait. Fragmentation complète est obtenue en 36 heures. Combien de temps la dégénérescence est laissée se dérouler pendant doit être choisi par l'utilisateur final selon le protocole expérimental.
- Après la phase d'extension axonale 2 jours, modifiez les médias de compartiments supérieurs et inférieurs aux médias qui manque NGF et contient des anticorps anti-NGF (1 pg / ml) pour séquestrer tout en restant (ou produit de façon endogène) NGF.
- Retour à plaques incubateur de cellules (37 ° C) pour permettreNGF dégénérescence induite par le sevrage se dérouler pendant le temps désiré.
- Procéder à l'extraction des protéines (étape 6) pour examen par western blot ou d'examiner directement les filtres IF (étape 7).
5. Axonale Transection pour induire wallérienne dégénérescence
Cette procédure laisse les axones sur le côté inférieur du filtre détachés de leur corps cellulaire, mais sinon intacte. Par la suite, ces axones lancer rapidement la dégénérescence wallérienne. Fragmentation axonale (matérialisés par contraste de phase ou β-III-tubuline SI) apparaît pour la première de 3 heures après résection; de 9 heures, les axones sont totalement fragmenté et sont détachées du filtre. Combien de temps la dégénérescence est laissée se dérouler pendant doit être choisi par l'utilisateur final selon le protocole expérimental.
- Grattez la partie supérieure du filtre, contenant des explants DRG cultivés, avec une cellule-grattoir. Assurer l'élimination complète du matériel supérieur en déplaçant grattoir en X, Y et circulairedirections.
- Jeter le support du compartiment supérieur contenant les explants flottants qui ont été grattées du filtre et remplacer par 1 ml de milieu de DRG préchauffé, complet contenant NGF (10 ng / ml).
- Retour plaque à la cellule incubateur (37 ° C) pour permettre la dégénérescence wallérienne de procéder pour le temps choisi par l'utilisateur final.
- Procéder à l'extraction des protéines (étape 6) pour examen par western blot ou d'examiner directement les filtres IF (étape 7).
6. Extraction des protéines des échantillons axonales
- Remplir des tubes de prélèvement (1,5 ml) avec 75 ul de tampon d'échantillon de Laemmli. Garder les tubes sur la glace alors que la récolte des axones de l'ensemble des filtres.
- Laver le filtre avec des explants de DRG dans du PBS et gratter la partie supérieure du filtre. Retirez le cache de la plaque, nettoyer la partie supérieure du filtre avec un applicateur coton-tige et aspirer toute PBS supplémentaire sur les côtés supérieur et inférieur.
- Placez insert à l'enverssur un établi et couper le filtre de l'insertion à l'aide d'un scalpel. Tenez le filtre avec une pince, de bas en haut. Effectuer une coupe à partir de la périphérie vers le centre du filtre avec des ciseaux.
- Placer le filtre sur le dessus du tube de collecte, et avec une pince, appuyez sur le centre du filtre dans le tube. Tout en faisant cela, un entonnoir doit former. Pousser le filtre en forme d'entonnoir à la partie inférieure du tube de sorte qu'il est immergé dans le tampon d'échantillon de Laemmli.
- Extraction de la protéine complète en faisant bouillir les tubes pour 4 min. Retirez le filtre en utilisant une pince à placer à l'envers dans le haut du tube et effectuer un bref essorage (2000 g pendant 15 secondes). Jeter les filtres séchés.
- Résoudre 10 ul de la préparation de protéine axonale dans une SDS-PAGE suivie par western blot pour détecter les protéines d'intérêt.
NOTE: En tant que référence, une préparation axonale à partir de 20 explants cultivés pendant 2 jours et lysées dans 100 ul de tampon de lyse RIPA aura une concentration en protéines de 4 à 6ug / ul.
7. Immunofluorescence examen des axones sur les filtres
Les étapes suivantes décrivent les manipulations générales à effectuer si la coloration sur les cartouches filtrantes, illustrés par la détection de β-III-tubuline. Fixateur, temps d'incubation, les concentrations et les autres indications doivent être optimisés pour d'autres paires antigène-anticorps.
- Utiliser utilisés précédemment plaques à 6 puits, soigneusement nettoyés, pour les incubations et les lavages suivants des inserts.
- Laver rapidement inserts en PBS. Les fixer dans fraîchement préparé paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante sur agitateur.
- Après fixation, racler et nettoyer la face supérieure de l'insert de recueillir les axones qui se sont développées exclusivement sur la surface inférieure du filtre. Procéder à des incubations standard pour SI.
- Incuber les inserts dans une solution de blocage (TBS, 0,05% de Tween 20, 5% de lait écrémé), en utilisant des volumes standard, pendant 1 heure à température ambiante avec agitation douce.
- Transfert insère à l'anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage (anti-β-tubuline III-, 1:5000), en utilisant des volumes standard. Incuber O / N (environ 18 heures) à 4 ° C avec agitation douce.
- Laver le premier anticorps à deux reprises dans du PBS (2 x 10 min à température ambiante).
- Transfert insère à des anticorps secondaires fluorescents conjugué dilué dans du tampon de blocage (anticorps de chèvre anti-souris, 1:2000), en utilisant des volumes standard. Incuber couverte de la lumière pendant 2 heures à température ambiante avec agitation douce.
- Laver 3x anticorps secondaire dans du PBS (3 x 10 min à température ambiante).
- Après SI est terminée, prendre sortie d'insertion, videz PBS à partir du dernier lavage et nettoyer le dessus du filtre avec un applicateur coton-tige. Aspirer tout liquide à partir des côtés supérieur et inférieur.
- Lieu insérer à l'envers sur le banc, et coupé le filtre de l'insert avec un scalpel.
- Tenez le filtre avec une pince, la baisse, et placer sur la microscopie diapositive. Recouvrir d'une lamelle et mou fluorescent compatiblemédias nting. Laissez sécher à plat dans la chambre froide, couverte de la lumière. Examiner et capturer des images en utilisant un microscope à fluorescence.
NOTE: En cas de stockage à 4 ° C et à l'abri de la lumière, ces préparations peuvent être conservés pendant des semaines avec une perte minimale de fluorescence. - OPTION: Sinon, SI peut être effectuée sur des filtres qui ont été retirés de l'insert. Pour ce faire, gratter et nettoyer la face supérieure des filtres directement après fixation.
- Prenez filtres sur les inserts avec un scalpel et place des filtres axones-up pointu sur le fond d'une plaque à six puits.
- Ensuite, effectuez les incubations pour SI comme indiqué dans 7,4-7,8 et 7.11. L'avantage de cette solution est qu'il permet d'économiser les réactifs, puisque, par exemple, les volumes d'incubation peut aller jusqu'à 500 pi (comparativement à 3 ml utilisés lorsque les filtres sont directement colorées sur les inserts comme indiqué dans 7.1 à 7.11).
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Representative Results
Explants de ganglions de la racine dorsale de souris E13.5 poussent de manière séquentielle sur des filtres largement recouvertes de poly-D-lysine, la laminine et le collagène (figure 1B, à gauche), atteignant jusqu'à 2 mm dans les 2 jours de culture. Cette combinaison de substrat donne une croissance particulièrement exubérante; autres combinaisons donnent axones qui sont considérablement plus courte (figure 1B, à droite). En outre, les GHM entretenus sur les filtres s'étendent de plus en plus que les axones DRG cultivés sur plastique figure 1C.
Les filtres avec des pores de 1 um de diamètre, utilisé dans ce protocole, de retenir les corps cellulaires sur le côté supérieur du filtre, tout en permettant neurites de croître à travers les pores et s'étendent sur la surface inférieure. Ceci est clairement démontré par microscopie à épifluorescence de filtres colorés pour les noyaux (DAPI) et β-III-tubuline figure 1D. Dans les filtres intactes, il est possible d'observer des noyaux cellulaires, à la fois à partir de neurones et noncellules neuronales, concentrés dans le centre d'expiant et certains irradiation de lui. Toutefois, lorsque la partie supérieure du filtre est grattée, les noyaux sont partis et que les axones peuvent être détectés, sur la face inférieure des filtres.
La figure 1E montre un exemple d'un fond de filtre qui a initialement subi la croissance d'environ 17 explants. Dans cet exemple, la face supérieure a été nettoyé avant la fixation et par conséquent le signal d'immunofluorescence représente axones purs sur le côté inférieur du filtre. L'extraction des protéines à partir de préparations axonales (côté fond du filtre) sont dépourvues de protéines nucléaires figure 1F, ce qui démontre que la préparation est exempte de corps cellulaires. En variante, lorsque l'on travaille avec extraction de l'ARN, il est possible de confirmer la pureté de la préparation axonale par la comparaison de la présence d'ARNm différentiellement localisées (c.-à-γ-actine) entre les lysats de cellules entières et des préparations axonales (comme montré par d'autres 5
Élagage développement des neurones sensoriels peut être modélisé dans les filtres soumis à la privation facteur trophique. Après 2-3 jours de l'extension de l'axone en présence de NGF, le milieu est changé en une absence de NGF et contenant un anticorps anti-NGF qui se séquestrer tout en restant NGF Figure 2A. Aux points temporels désirés, les filtres sont traités pour la biochimie ou immunocytochimie.
La figure 2B montre des exemples typiques de côtés inférieurs de filtres colorés pour β-III-tubuline avant et après la privation. Après 12 heures de privation, il ya peu de fragmentation axonale, bien que certains axones commencent à montrer des perles. Cependant, une vaste dégénérescence axonale est atteint après 36 de privation.
La dégénérescence wallérienne induite par transection axone des neurones sensoriels est facilement modelable dans des explants cultivés sur des filtres en raclant le côté supérieur du filtre, laissant derrière lui la po distalertion des axones qui se sont développées sur le côté inférieur du filtre à la figure 3A. figure 3B montre des exemples typiques des côtés inférieurs des filtres colorés pour les β-III tubuline avant et après axotomie en-filtre. À 3 h après axotomie, il ya peu de fragmentation, bien que certains axones commencent à montrer des perles. De 7,5 heures, la plupart des axones sont fragmentés ou complètement disparu. Le prétraitement des explants avec le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD +, 5 mM, 30 min prétraitement) protège contre la dégénérescence wallérienne induite sur les filtres, comme c'est le cas dans d'autres in vitro et dans des modèles in vivo 19.
Figure 1. Filtrer les inserts produisent de grandes quantités de préparations axonales pures. A) Un schéma d'un insert (a), d'un insert dans un puits (b) et l'configuration finale avec des explants de DRG (c). B) Le revêtement séquentiel de filtres avec des poly-D-lysine, la laminine et le collagène des résultats dans des explants qui se développent de plus en plus longs axones par rapport à ceux qui sont cultivés avec de la poly-D-lysine seule ou poly-D -lysine et de collagène. Les images ont été produites par de carrelage qui se chevauchent, des images à faible grossissement en utilisant un logiciel d'imagerie. C) Dans les mêmes conditions de revêtement de substrat, explants DRG entretenus sur les filtres montrent la croissance axonale beaucoup plus exubérant que explants cultivés sur plastique. D) La préparation axonale obtenues par grattage la face supérieure du filtre est dépourvue de noyaux de cellules. E) Exemples d'axones qui proviennent de environ 17 explants et cultivés dans la partie inférieure d'un filtre de 24 mm. Autant que 30 explants peuvent facilement se développer dans ces préparations, ce qui donne suffisamment de matière pour axonale approches biochimiques communes. F) Immunotransferts de lysats Coll ecte de couvercles filtrants contre les fonds démontrent que l'histone H3, un marqueur nucléaire, se limite à la cime des filtres. La teneur en protéine totale a été normalisé dans les différents échantillons. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. L'étude de la dégénérescence axonale induite par le retrait de facteur trophique dans des cartouches filtrantes. A) Schéma décrivant une expérience NGF privation typique. explants DRG se développent de vastes axones en présence de NGF, et dégénèrent sur privation de NGF. B) Des images représentatives à différents grossissements (5X et 20X objectifs) de préparations axonales des explants maintenus dans NGF ou privées de NGF pour 12 ou 36 heures."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. L'étude de la dégénérescence axonale wallérienne induite par résection axonale dans des cartouches filtrantes. A) Schéma décrivant une expérience de axotomy typique. Axon sectionnement est réalisé par grattage de la partie supérieure du filtre, laissant axones sectionnés (dépourvus de corps cellulaires) sur la face inférieure. B) Des images représentatives de préparations axonales des explants intactes ou après 3 ou 7,5 heures après résection de la présence ou de l'absence 5 mM de NAD +. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les paramètres importants à prendre en considération lors de l'adaptation de cette technique comprennent la population neuronale qui sera étudié, le substrat, la taille des pores du filtre et la zone de surface. Tous ces paramètres auront une incidence sur la spécificité, la qualité et la quantité de la préparation des neurites obtenu, et doivent être soigneusement examiné par l'utilisateur final. Dans les exemples présentés dans ce protocole, l'utilisation de neurones DRG a l'avantage d'étendre seulement axones, donnant ainsi une (spécifique) préparation axonale pure.
La croissance axonale des DRG embryonnaires est très rapide par rapport aux neurones du système nerveux central, ce qui permet échantillons axonales qui sera établi après seulement 2 jours de culture. La taille des pores de 1 um s'est avéré suffisamment petite pour empêcher les corps cellulaires de migrer dans la surface inférieure tout en permettant un passage efficace des axones en croissance. Par rapport à de plus petites tailles disponibles (soit 0,4 um), il n'impose pas de sélectivité pour les axones minces.Pour l'étude des explants de DRG, l'insert de filtre de 24 mm (pour une utilisation dans des plaques 6 puits) produit des quantités suffisantes de l'échantillon de protéine axonale pour la plupart des techniques, y compris l'immunoprécipitation, ce qui nécessite souvent une grande quantité de l'apport de protéines. Toutefois, de plus petites tailles (c.-à-inserts de filtre pour plaques à 12 puits) sont appropriés pour certaines applications, en particulier si l'utilisation de cellules et / ou immunocytochimie dissociées.
Bien que la garniture de filtre isole efficacement neurites à partir des corps cellulaires en examen, il est important de noter que les deux compartiments ont le même milieu de culture, ce qui limite les manipulations expérimentales à des traitements de cellules entières. D'autres approches d'isolement, y compris les chambres de Campenot compartimentées ou chambres microfluidiques, permettent un traitement différencié des différents compartiments. L'expérimentateur doit déterminer laquelle de ces techniques d'isolement de cellules compartiment est le plus approprié pour son propre protocole expérimental spécifique.
Bien entendu, la capacité d'isolation des éléments filtrants peut être avantageux au-delà de la dégénérescence axonale. Par exemple, la régénération de la biochimie de cônes de croissance peut être facilementétudié par raclage de la face inférieure de filtres avec des explants de DRG cultivés. En quelques heures, les neurones de DRG axotomisés se régénérer cônes de croissance dans le côté inférieur des filtres qui, tel que décrit dans le présent protocole, peut ensuite être isolé pour la purification des protéines de régénération du cône de croissance. De plus, les échantillons axonales obtenus par ce procédé peuvent être analysés par des méthodes biochimiques autres que le transfert de Western. Par exemple, les axones peuvent être lysées dans du RIPA ou CHAPS tampons de lyse pour obtenir un échantillon de protéine qui peut être en outre soumis à une immunoprécipitation ou des expériences pulldown 9. En variante, des échantillons peuvent être traités axonales pour l'extraction d'ARN, comme décrit précédemment 5.
L'avantage du système de culture présenté n'est pas limitée aux neurones sensoriels. Par exemple, les neurones corticaux s'étendront dendrites et des axones qui formeront des synapses sur la face inférieure du filtre 7. Ainsi, des échantillons de neurites purs (enrichis de synapses) peuvent être Isolated de corps cellulaires pour les analyses biochimiques détaillées des processus qui se déroulent exclusivement dans les synapses. L'utilisation de cette technique est simple et n'a pas d'étapes critiques en circulation. Cependant, la longueur des axones et la morphologie est très sensible à la qualité du revêtement des filtres. Par conséquent, il faut prendre soin d'utiliser des solutions de revêtement frais et homogènes pour les montants indiqués de temps à obtenir des échantillons axonales robustes et cohérentes. L'utilisation généralisée de cette technique contribuera à faire progresser notre connaissance de la physiologie des axones, dans des circonstances normales et dans la maladie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
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| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
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References
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