Introduction
न्यूरॉन्स की axonal डिब्बे शारीरिक अथवा मानव शरीर संबंधी अर्थ में समास रूप वृक्ष के समान डिब्बे से कार्यात्मक स्वतंत्रता की एक बड़ी डिग्री से पता चलता है. प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में, axons neuronal प्रोटीन 1,2 के सबसे होते हैं. हाल के अध्ययनों से जल्दी axonal शिथिलता neurodegenerative रोगों और neuropsychiatric विकारों 3 की एक आम सुविधा प्रतीत होता है कि पता चला है क्योंकि axons की फिजियोलॉजी और pathophysiology के अध्ययन तंत्रिका विज्ञान समुदाय में रफ्तार पकड़ ली है. यह सामान्य और रोग की शर्तों के तहत axonal अनन्य तंत्र की एक बेहतर समझ शिथिलता ड्राइव कि प्रारंभिक घटनाओं पर प्रकाश डाला जाएगा कि संभावना लगती है.
वर्तमान प्रोटोकॉल जैव रासायनिक के लिए उपयुक्त है और immunocytochemical विश्लेषण करती है कि शुद्ध axonal सामग्री की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक झरझरा झिल्ली (फिल्टर) असर संस्कृति आवेषण का उपयोग कैसे करें. फिल्टर का उपयोग axonal जीव विज्ञान प्रथम प्रबंधक द्वारा लागू किया गया था अध्ययन करने के लिए सम्मिलित करता है औरआगे अपने मौजूदा विन्यास को Twiss और उनके सहयोगियों ने 5 द्वारा विकसित सहयोगियों 4 और. तकनीक का अध्ययन न्यूरॉन्स की आबादी के लिए समायोजित करने के लिए प्रत्येक मामले में मामूली संशोधनों के साथ, axonal और dendrite जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन समूहों द्वारा वर्तमान उपयोग में है, प्रदर्शन उपचार और जैव रासायनिक विश्लेषण के प्रकार 6-9 इस्तेमाल किया. वर्तमान प्रोटोकॉल आवेदनों की एक ऐसी किस्म के लिए सभी विकल्पों को समायोजित करने का इरादा है, बल्कि सबसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है कि एक साधारण दृष्टिकोण प्रदान नहीं करता है. विशेष रूप से, यहां वर्णित प्रोटोकॉल वापस लेना और पौष्टिकता संबंधी कारकों 9 से वंचित जब तेजी से पतित कि कम axons उत्पादित जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए axonal उपज अधिकतम और साहित्य में वर्णित axonal अध: पतन दूसरे कोटिंग्स अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त है कि एक ट्रिपल कोटिंग का उपयोग करता है.
इस प्रक्रिया में, neuronal सेल निकायों फिल्टर क ऊपर पृथक रहनाइले axons छिद्रों के माध्यम से गुजरती हैं और इसके नीचे की सतह के साथ बड़े होते हैं. फिल्टर के नीचे की सतह पर होते हैं कि (glia और neuronal सेल शरीर प्रदूषणों से मुक्त) शुद्ध axons जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है या बगल में तय की और immunocytochemical तकनीकों 9 द्वारा जांच की जा सकती है. प्रक्रिया पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) से भ्रूण संवेदी न्यूरॉन्स के उपयोग पर निर्भर करता है. इस पहलू से वंचित जब वे तेजी से अध: पतन से गुजरना क्योंकि भ्रूण DRGs व्यापक रूप से तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) में बनाए रखा जब इन कोशिकाओं से neurites विट्रो में तेजी से और मजबूत वृद्धि से गुजरना क्योंकि axonal जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और कर रहे हैं. इस विधि द्वारा एकत्रित सभी neurites विशुद्ध रूप से axons हैं इतना है कि इसके अलावा, DRG न्यूरॉन्स, डेन्ड्राइट की कमी है.
फ़िल्टर सम्मिलित करता axons का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों की तुलना में एक महान लाभ का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रक्रियाओं एक में उन से सेल सोमा में होने वाली अंतर करने माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर निर्भर अध्ययनxons सीमित जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करते हैं. एक अन्य उदाहरण के रूप में बंटे संस्कृति प्रणालियों (जैसे, Campenot कक्षों 10 या microfluidic उपकरणों 11) इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए और सेल के डिब्बों के अंतर के इलाज के लिए उपयोगी होते हैं लेकिन आवश्यकता होती है जो जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इन तकनीकों का उपयोग precluding axonal सामग्री की ही छोटी मात्रा में उपलब्ध कराने नमूने की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में. इसके अलावा, उनके उपयोग महत्वपूर्ण प्रशिक्षण के साथ ही विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और वे समय लेने वाली हैं. अक्सर explants से axons अलग करने के लिए इस्तेमाल किया एक और दृष्टिकोण को मैन्युअल axonal नमूना संग्रह से पहले (neuronal सेल निकायों युक्त) एक explant केंद्र को दूर करने के लिए है. इस अक्षतंतु समृद्ध तैयारी की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं, इस तैयारी में axons glia में छा और तेजी से (एक न्यूनतम प्रयोग का एक उदाहरण के रूप में) 6 कुओं से लगातार 20 explant के शव को हटाने जा सकता है समय लेने वाली है और व्यवहार्यता की सीमा पर.
इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तुत विधि तो पश्चिमी धब्बा, immunoprecipitation 6, उत्तरी धब्बा 5 मास स्पेक्ट्रोमेट्री 6, शाही सेना शुद्धि जैसे आमतौर पर पूरे सेल lysates का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि लगभग किसी भी जैव रासायनिक तकनीक, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है कि प्रचुर मात्रा में और शुद्ध axonal तैयारियों का उत्पादन 7,12,13, दूसरों के बीच में. इसके अलावा, प्रोटोकॉल इसे आगे तो उन्हें जांच के लिए फिल्टर के नीचे की ओर में बढ़ रही axons ठीक करने के लिए संभव है, के रूप में (यदि) तकनीक immunofluorescence के लिए लागू किया जा सकता है. कोई सेल शरीर अंतिम तैयारी में है क्योंकि वहाँ यह दृष्टिकोण बहुत axonal विशेष प्रक्रियाओं के विश्लेषण की सुविधा. सेल शरीर से एक उच्च Immunofluorescent संकेत अक्सर परीक्षा और ऐसे axons के रूप में पतली संरचनाओं से होने वाले एक कमजोर संकेत के विश्लेषण को नजरअंदाज बाद से यह एक महत्वपूर्ण लाभ है.
Axonal अध: पतन की गिरफ्तारी का अध्ययन करने के लिए संस्कृति विधि के दो आवेदनई वर्णित; विकास छंटाई और चोट प्रेरित अध: पतन का एक मॉडल की एक मॉडल (सामान्यतः के रूप में Wallerian अध: पतन के लिए कहा गया है). विकास छंटाई की मॉडलिंग vivo में संवेदी न्यूरॉन्स लक्ष्य प्राप्त NGF की मात्रा और पर्याप्त neurotrophic समर्थन पतित 14 प्राप्त करने में विफल रही उन सीमित करने के लिए प्रतिस्पर्धा है कि इस तथ्य पर आधारित है. इस घटना विवो में होता है, सेल शरीर के विनाश के द्वारा पीछा axonal अध: पतन की शुरुआत करता है, जो संस्कृति मीडिया से NGF वापस लेने के द्वारा भ्रूण डीआरजी संस्कृतियों में मजाक उड़ाया जा सकता है. Wallerian अध: पतन मॉडल के लिए, सेल शरीर के साथ फिल्टर के ऊपर की ओर दूर scraped है. शारीरिक रूप से सेल शरीर से अलग कर दिया और उसके बाद पहली बार 1850 16 में घटना की सूचना दी जो ए वालर के नाम पर रखा Wallerian अध: पतन 15 के रूप में जाना तेजी से और stereotypic अपक्षयी प्रक्रिया से गुजरना बन फिल्टर के नीचे की ओर पर हो गई थी कि axons.
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Protocol
नोट: निम्न प्रक्रियाओं पशु की देखभाल के कनाडा परिषद द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे हैं. सभी प्रयासों की प्रक्रिया के दौरान दर्द और जानवरों के संकट को कम करने के लिए किया जाता है.
फिल्टर 1. कोटिंग
नोट: संस्कृति फिल्टर आवेषण बहु अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में रखा जाता है, दो डिब्बों में परिभाषित कर रहे हैं: शीर्ष कम्पार्टमेंट डालने ऊपर क्षेत्र है और नीचे डिब्बे डालने चित्रा 1A.ab नीचे से एक है. Explants वे फिल्टर के ऊपर की ओर करने के लिए देते हैं, जहां शीर्ष कम्पार्टमेंट में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं; कई axons फिल्टर के माध्यम से हो जाना और नीचे कम्पार्टमेंट चित्रा 1A.c भीतर, फिल्टर के नीचे की ओर का विस्तार. (यानी कोटिंग समाधान, washes, संस्कृति मीडिया, आदि लागू करने के लिए) मानक काम कर संस्करणों नीचे डिब्बे के लिए 2 मिलीलीटर और शीर्ष कम्पार्टमेंट के लिए 1 मिलीलीटर हैं और "के रूप में प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट होने जा रहे हैं; मानक संस्करणों ". डालने और अच्छी तरह से पक्ष के बीच की खाई में पिपेट की नोक रखकर नीचे डिब्बे के साथ शुरू समाधान जोड़ें. फिल्टर के तल पर फंस जाने से बुलबुले को रोकने के लिए समाधान वितरण, जबकि इसके अलावा, एक तरफ डालने झुकाव.
- फिल्टर चढ़ाना पहले दिन कोटिंग प्रारंभ करें. बाँझ टिशू कल्चर हुड के तहत, 6 अच्छी तरह से प्राप्त की थाली में 24 मिमी फिल्टर आवेषण जगह है. नीचे डिब्बे में 2 मिलीग्राम और ऊपर में 1 मिलीलीटर: मानक संस्करणों का उपयोग आरटी पर 1 घंटे के लिए पानी में पाली डी lysine (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ आवेषण सेते हैं.
- महाप्राण पाली-D-lysine और पानी के साथ एक बार कुल्ला. महाप्राण पानी, ढक्कन बंद और हुड हे / एन में सूखे की प्लेटें छोड़ तरल पदार्थ की आकांक्षा के दौरान, सीधे फिल्टर के तहत फंस जाता है कि तरल पदार्थ की एक अवशेष को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें.
- अगली सुबह, पानी में laminin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) पतला मिश्रण और गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल में 1 घंटा laminin साथ आवेषण सेतेमानक संस्करणों का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर एल इनक्यूबेटर,.
- महाप्राण laminin और पानी में कोलेजन (0.1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. इस मामले में शीर्ष कम्पार्टमेंट के लिए नीचे डिब्बे के लिए 2 मिलीग्राम और 2 मिलीलीटर का उपयोग करें.
- महाप्राण कोलेजन और बाँझ पानी के साथ एक बार धोने. चरण 3 में वर्णित के रूप में फिल्टर, अब संस्कृति मीडिया और डीआरजी explants प्राप्त करने के लिए तैयार हैं.
2. विदारक भ्रूण पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) Explants
- Avertin (250 मिलीग्राम / किग्रा) के एक आईपी इंजेक्शन द्वारा एक 13 दिन की गर्भवती महिला माउस anesthetize. 10-15 मिनट रुको और corneal और पेडल वापसी सजगता की कमी के लिए जाँच करें. सजगता अनुपस्थित रहे हैं एक बार, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं.
- 70% इथेनॉल के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों और महिला के पेट कीटाणुरहित. उपकरणों सूखे की अनुमति दें. पेट की त्वचा पकड़ो और उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों की परतों के माध्यम से काटा.
- ग्रीवा और अंडाशय से detaching द्वारा गर्भाशय निकाल दें. एक Steri मेंLe हुड, कैंची से गर्भाशय से भ्रूण को हटा दें और ठंडा L15 मीडिया के साथ भरा एक पेट्री डिश में उन्हें इकट्ठा. बर्फ पर रखें.
नोट: हमल 17,18 के 13 दिन के भ्रूण को प्राप्त करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए पिछले तकनीकी रिपोर्ट का संदर्भ लें. - खुर्दबीन के तहत, एक ओर भ्रूण लेट गया और सिर को दूर करने के लिए छोटे वसंत कैंची का उपयोग करें. पार्श्व पक्षों के साथ एक चीरा छाती, पेट, पैर और पूंछ त्यागने के लिए सुनिश्चित करें. सभी आंत अंगों को उदर पक्ष रखना और हटाने, रीढ़ युक्त वापस रखो.
- छोटे वसंत कैंची के साथ, midline के साथ अपने उदर पक्ष से स्पाइनल कॉलम में कटौती करके पूरे रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश. संदंश की एक जोड़ी (# 3) के साथ शव को दबाए रखें और इसकी सबसे व्याख्यान चबूतरे वाला पहलू से रीढ़ की हड्डी में रखने के लिए एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें.
- और धीरे धीरे दूर कशेरुकी गुहा से कॉर्ड खींच और अति पतली संदंश (# 5) का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी से DRGs चुटकी. समूह DRGs पर एकत्र होडिश के नीचे.
- अपने उद्घाटन विस्तार करने के लिए काट दिया गया है कि एक 200 μl विंदुक टिप के साथ aspirating द्वारा समूहीकृत DRGs लीजिए. एक ट्यूब में DRGs प्लेस और डीआरजी संग्रह समाप्त हो गया है जब तक बर्फ पर छोड़ दें.
नोट: DRGs इस टिप की दीवारों के लिए छड़ी नहीं है क्योंकि (मानक पीला सुझावों की तुलना में) सफेद / पारदर्शी सुझावों पसंद कर रहे हैं. मीडिया के साथ फ्लशिंग सुझावों का उपयोग करने से पहले आगे इसकी दीवारों से चिपके से DRGs से बचाता है.
फ़िल्टर पर 3. सीडिंग और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि explants के रखरखाव
- मानक संस्करणों का उपयोग लेपित आवेषण को 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरा डीआरजी मीडिया जोड़ें. NGF मुक्त शीर्ष कम्पार्टमेंट रखते हुए, NGF के 15 एनजी / एमएल के साथ नीचे कम्पार्टमेंट मीडिया के पूरक है.
नोट: NGF कुशलतापूर्वक फिल्टर भर diffuses और अपनी एकाग्रता घंटे के भीतर equilibrates हालांकि, हम सीधे बोने से पहले नीचे डिब्बे में NGF लागू करने में काफी बी पर axonal पैदावार बढ़ जाती है कि मनायाफिल्टर के ottom सतह. - अपने उद्घाटन विस्तार करने के लिए छंटनी की एक टिप के साथ एक 1000 μl विंदुक का उपयोग फिल्टर करने के लिए ट्यूब से DRGs स्थानांतरण.
- DRGs एकत्रित पहले टिप 2-3X में मीडिया ड्रा. इस टिप के भीतर की ओर से चिपके से उन्हें रोकता है. उसी टिप सभी कुओं के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है. (मानक नीले सुझावों बनाम) uncolored सुझावों का उपयोग टिप सतह को डीआरजी चिपके कम कर देता है.
- , DRGs हस्तांतरण 800 μl में पिपेट सेट करने के लिए. महाप्राण फिल्टर के ऊपर की ओर से मीडिया के लगभग 200 μl, तो डीआरजी युक्त ट्यूब में जाना और ऊपर और नीचे एक छोटी मात्रा पिपेट - नीचे करने के लिए डूब चुके हैं कि DRGs resuspend. पूरी मात्रा और डालने के बीच में नोक submerging पिपेट DRGs aspirate.
- एक बार सभी आवेषण लोड कर रहे हैं, थाली ढक्कन बंद और प्लेट 10x चक्कर आने, प्रत्येक ज़ुल्फ़ के बीच हुड बेंच पर धीरे यह दोहन. इन आंदोलनों की मदद से axonal उपज बढ़ाने के डीआरजी explants सिंक औरफिल्टर करने के लिए देते हैं. यह भी अलग explants से axons ओवरलैप नहीं है कि इतनी समान रूप से explants वितरित में मदद करता है.
नोट: पिछले चरण में वर्णित explant बोने प्रक्रिया काफी सब्सट्रेट (75%) को explant लगाव के समग्र दर बढ़ जाती है. सबसे महत्वपूर्ण, pipetting प्रक्रिया तत्काल मीडिया की सतह पर तैर के बजाय डालने की तह तक डूब से explants से बचाता है. - जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए, फिल्टर प्रति (30) के चारों ओर एक भ्रूण से बीज DRGs. रूपात्मक विश्लेषण के लिए, आधा या एक भ्रूण (10-15) से DRGs का एक तिहाई या तो उपयोग करें. एक ट्यूब के सभी DRGs (यह 30, 15, या 10 DRGs है कि क्या) एक ही कुएं में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं इतना है कि यह निर्णय, ट्यूबों में DRGs एकत्रित पहले किया जाना चाहिए.
- हर 2-3 दिनों मीडिया से बदल रहा है, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में संस्कृतियों को बनाए रखने. , मीडिया को बदलने के पहले शीर्ष कम्पार्टमेंट निकालना, नीचे कम्पार्टमेंट द्वारा पीछा किया. मानक मात्रा में जोड़ें ताजा मीडियानीचे डिब्बे के साथ शुरू है.
नोट: सूखने से कोशिकाओं / axons रोकने के लिए, एक ही समय में अधिक से अधिक 3 आवेषण में मीडिया को बदल नहीं है. NGF की उपस्थिति में फिल्टर पर हो DRGs संस्कृति में 2 दिनों के बाद 2 मिमी तक पहुँचने के बाद, लंबे axons का विस्तार होगा.
4. पोषण से संबंधित फैक्टर निकासी उपचार
NGF वापसी कि पहले वापसी के बाद लगभग 12 घंटे प्रकट होता है (यदि चरण विपरीत और β-III ट्यूबिलिन द्वारा निर्धारित) axonal विखंडन के साथ axonal अध: पतन को प्रेरित करता है. पूरी विखंडन 36 घंटा द्वारा हासिल की है. अध: पतन प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार अंत उपयोगकर्ता द्वारा चुना जाना है के लिए आगे बढ़ने के लिए छोड़ दिया जाता है कब तक.
- 2 दिन axonal विस्तार के चरण के बाद, NGF का अभाव है और किसी भी शेष (या endogenously उत्पादित) NGF पृथक विरोधी NGF एंटीबॉडी (1 ग्राम / एमएल) होता है कि मीडिया के लिए ऊपर और नीचे के डिब्बों से मीडिया बदल जाते हैं.
- अनुमति देने के लिए सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए प्लेटें लौटेंसमय के वांछित राशि के लिए आगे बढ़ने के लिए NGF वापसी प्रेरित अध: पतन.
- वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा परीक्षा के लिए प्रोटीन निष्कर्षण (6 चरण) के लिए आगे बढ़ें या सीधे अगर (7) द्वारा फिल्टर की जाँच करें.
5. Axonal transection Wallerian अध: पतन प्रेरित करने के लिए
यह प्रक्रिया अपने सेल शरीर से अलग फिल्टर के नीचे के हिस्से में axons छोड़ देता है, लेकिन अन्यथा बरकरार. इसके बाद, इन axons तेजी Wallerian अध: पतन आरंभ. पहले transection के बाद 3 घंटे से दिखाई देता है (यदि चरण विपरीत या β-III ट्यूबिलिन इसका सबूत है) axonal विखंडन; 9 घंटा से, axons पूरी तरह से खंडित कर रहे हैं और फिल्टर से अलग कर रहे हैं. अध: पतन प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार अंत उपयोगकर्ता द्वारा चुना जाना है के लिए आगे बढ़ने के लिए छोड़ दिया जाता है कब तक.
- एक सेल खुरचनी के साथ बढ़ी डीआरजी explants युक्त, फिल्टर के ऊपर की ओर परिमार्जन. एक्स, वाई और परिपत्र में खुरचनी ले जाकर शीर्ष सामग्री का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करेंदिशाओं.
- फिल्टर से scraped और NGF (10 एनजी / एमएल) युक्त पूर्व गर्म, पूरा डीआरजी मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित किया गया है कि फ्लोटिंग explants युक्त शीर्ष डिब्बे से मीडिया त्यागें.
- Wallerian अध: पतन अंत उपयोगकर्ता द्वारा चुने हुए समय की राशि के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) सेल को थाली लौटें.
- वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा परीक्षा के लिए प्रोटीन निष्कर्षण (6 चरण) के लिए आगे बढ़ें या सीधे अगर (7) द्वारा फिल्टर की जाँच करें.
Axonal नमूने की 6. प्रोटीन निष्कर्षण
- Laemmli नमूना बफर के 75 μl के साथ संग्रह ट्यूबों (1.5 एमएल) भरें. फिल्टर के पूरे सेट से axons कटाई जबकि बर्फ पर ट्यूबों रखें.
- पीबीएस में डीआरजी explants साथ फिल्टर धो लें और फिल्टर के ऊपर की ओर परिमार्जन. , थाली से डालने निकालें एक कपास टिप applicator के साथ फिल्टर के ऊपर की ओर साफ और ऊपर और नीचे के हिस्से से किसी भी अतिरिक्त पीबीएस महाप्राण.
- सम्मिलित उल्टा रखेंबेंच पर नीचे और एक तेज स्केलपेल का उपयोग डालने से बाहर फिल्टर काटा. संदंश, नीचे से ऊपर के साथ फिल्टर पकड़ो. कैंची के साथ फिल्टर के केंद्र के लिए परिधि से एक कटौती करें.
- संग्रह ट्यूब के शीर्ष पर जगह फिल्टर, और संदंश के साथ, ट्यूब नीचे फिल्टर के केंद्र दबाएँ. जबकि यह कर, एक कीप फार्म चाहिए. यह Laemmli नमूना बफर में डूबे हुए है कि इतनी ट्यूब के नीचे करने के लिए कीप के आकार फिल्टर पुश.
- 4 मिनट के लिए ट्यूब उबलते द्वारा पूरी प्रोटीन निष्कर्षण. ट्यूब के शीर्ष में ऊपर से नीचे के लिए यह जगह संदंश का उपयोग और एक संक्षिप्त स्पिन (15 सेकंड के लिए 2,000 XG) प्रदर्शन फिल्टर निकालें. सूखे फिल्टर त्यागें.
- ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट के बाद एसडीएस पृष्ठ में axonal प्रोटीन तैयारी की 10 μl का समाधान करें.
नोट: एक संदर्भ के रूप में, 2 दिनों के लिए बढ़ा है और RIPA के 100 μl में lysed 20 explants से एक axonal तैयारी बफर 4-6 की एक प्रोटीन एकाग्रता होगा lysisमाइक्रोग्राम / μl.
फ़िल्टर पर axons की 7. Immunofluorescence परीक्षा
निम्नलिखित कदम β-III ट्यूबिलिन का पता लगाने के द्वारा उदाहरण फिल्टर सम्मिलित करता है, पर धुंधला यदि प्रदर्शन करने के लिए सामान्य जोड़तोड़ की रूपरेखा. लगानेवाला, ऊष्मायन बार, सांद्रता और अन्य ब्यौरे अन्य प्रतिजन प्रतिरक्षी जोड़े के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- आवेषण के निम्न washes और incubations के लिए अच्छी तरह से साफ पहले से इस्तेमाल किया 6 अच्छी तरह प्लेटें, का उपयोग.
- संक्षेप में पीबीएस में सम्मिलित करता धो लो. हिलनेवाला पर आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में हौसले से तैयार 4% paraformaldehyde में उन्हें ठीक.
- निर्धारण के बाद, परिमार्जन और फिल्टर के नीचे की सतह पर विशेष रूप से बढ़ी axons कि एकत्र करने के लिए डालने के ऊपर की ओर साफ. यदि मानक incubations के साथ आगे बढ़ें.
- कोमल झटकों के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए, मानक संस्करणों का उपयोग कर, (टीबीएस, 0.05% बीच 20, 5% दूध स्किम) अवरुद्ध समाधान में सम्मिलित करता सेते हैं.
- स्थानांतरण मानक संस्करणों का उपयोग कर, बफर (एंटी β-III ट्यूबिलिन, 1:5,000) अवरुद्ध में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी को सम्मिलित करता है. कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस हे / एन (~ 18 घंटे) सेते हैं.
- पीबीएस (आरटी पर 2 एक्स 10 मिनट) में दो बार पहले एंटीबॉडी धो लें.
- स्थानांतरण मानक संस्करणों का उपयोग कर, (, 1:2,000 बकरी विरोधी माउस) अवरुद्ध बफर में पतला फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए सम्मिलित करता है. कोमल झटकों के साथ आरटी पर 2 घंटे के लिए प्रकाश से कवर सेते हैं.
- पीबीएस (आरटी पर 3 एक्स 10 मिनट) में माध्यमिक एंटीबॉडी 3x धो लें.
- यदि पूर्ण होने के बाद, बाहर डालने ले पिछले धोने से पीबीएस दूर डालना और एक कपास टिप applicator के साथ फिल्टर के ऊपर की ओर साफ. ऊपर और नीचे के हिस्से से किसी भी तरल aspirate.
- जगह बेंच पर ऊपर से नीचे डालें, और एक तेज छुरी के साथ डालने के बाहर फिल्टर काटा.
- संदंश के साथ फिल्टर पकड़ नकारात्मक पहलू है, और माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर जगह है. एक coverslip और फ्लोरोसेंट संगत समझौता ज्ञापन के साथ ओवरलेnting मीडिया. प्रकाश से कवर ठंडे कमरे में शुष्क फ्लैट, चलो. जांच करने और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों पर कब्जा.
नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रकाश से रक्षा करते हैं, तो इन तैयारियों प्रतिदीप्ति का कम से कम नुकसान के साथ हफ्तों के लिए रखा जा सकता है. - वैकल्पिक: वैकल्पिक रूप से, यदि डालने से हटा दिया गया है कि फिल्टर पर प्रदर्शन किया जा सकता है. ऐसा करने के लिए, परिमार्जन और सीधे निर्धारण के बाद फिल्टर के ऊपर की ओर साफ.
- एक छह अच्छी तरह से थाली के तल पर एक तेज छुरी और जगह फिल्टर axons अप के साथ आवेषण के बाहर फिल्टर लो.
- 7.4-7.8 और 7.11 में संकेत के रूप में बाद में, अगर incubations प्रदर्शन करते हैं. इस विकल्प का लाभ उदाहरण के लिए, ऊष्मायन संस्करणों (7.1-7.11 रूप में दिखाया गया फिल्टर सीधे सम्मिलित करता है पर दाग रहे हैं इस्तेमाल किया जब 3 मिलीलीटर की तुलना में) 500 μl के लिए नीचे जा सकते हैं, क्योंकि यह, अभिकर्मकों बचाता है.
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Representative Results
E13.5 चूहों से पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि explants संस्कृति में 2 दिनों के भीतर 2 मिमी तक पहुँचने, फिल्टर पर बड़े पैमाने पर पाली डी lysine, laminin और कोलेजन (चित्रा 1 बी, बाएं) के साथ लेपित क्रमिक रूप से बढ़ता है. इस सब्सट्रेट संयोजन विशेष रूप से विपुल विकास पैदावार; अन्य संयोजन काफी कम कर रहे हैं कि axons उपज (चित्रा 1 बी, दाएं). इसके अलावा, फिल्टर पर बनाए रखा DRGs प्लास्टिक चित्रा 1C पर हो DRGs से अधिक है और लंबे समय तक axons का विस्तार.
इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता व्यास में 1 माइक्रोन, neurites छिद्रों के माध्यम से हो जाना और नीचे की सतह पर विस्तार करने की अनुमति है, जबकि फिल्टर के ऊपरी ओर सेल शरीर को बनाए रखने के pores के साथ फिल्टर. यह स्पष्ट रूप से नाभिक (DAPI) और β-III ट्यूबिलिन चित्रा -1 के लिए दाग फिल्टर की epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाया गया है. बरकरार फिल्टर में यह न्यूरॉन्स से और गैर दोनों, सेल नाभिक निरीक्षण करने के लिए संभव हैयह से explant केंद्र और कुछ irradiating में केंद्रित neuronal कोशिकाओं,. फिल्टर के ऊपर की ओर scraped है हालांकि, जब नाभिक फिल्टर नीचे की ओर चला गया, और axons पता लगाया जा सकता है कि केवल हैं.
चित्रा 1E मूल रूप से लगभग 17 explants के विकास निरंतर एक फिल्टर है कि नीचे के एक उदाहरण से पता चलता है. इस उदाहरण में, ऊपर की ओर निर्धारण से पहले साफ कर दिया है और इसलिए Immunofluorescent संकेत फिल्टर के नीचे के हिस्से में शुद्ध axons का प्रतिनिधित्व करता था. Axonal तैयारी (फिल्टर के नीचे की ओर) से प्रोटीन निष्कर्षण तैयारी सेल शरीर के लिए स्वतंत्र है, प्रदर्शन है कि परमाणु प्रोटीन चित्रा 1F से रहित हैं. शाही सेना निकासी के साथ काम कर जब वैकल्पिक रूप से, यह दूसरों के 5 द्वारा दिखाया के रूप में (विभिन्न स्थानीयकृत mRNAs की उपस्थिति पूरे सेल lysates और axonal तैयारियों के बीच (यानी γ-actin) की तुलना द्वारा axonal तैयारी की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए संभव है
संवेदी न्यूरॉन्स के विकास छंटाई पौष्टिकता संबंधी कारक के अभाव के अधीन फिल्टर में मॉडलिंग की जा सकती. NGF की उपस्थिति में अक्षतंतु विस्तार के 2-3 दिनों के बाद, मीडिया एक NGF कमी और किसी भी शेष NGF 2A चित्रा एकांत में रहना होगा कि एक विरोधी NGF एंटीबॉडी युक्त करने के लिए बदल गया है. वांछित समय बिंदुओं पर, फिल्टर जैव रसायन या immunocytochemistry के लिए कार्रवाई कर रहे हैं.
चित्रा 2B अभाव से पहले और बाद β-III ट्यूबिलिन के लिए दाग फिल्टर के नीचे के हिस्से का विशिष्ट उदाहरण से पता चलता है. कुछ axons beading दिखाने के लिए शुरू हालांकि अभाव के 12 घंटे के बाद थोड़ा axonal विखंडन, वहाँ है. हालांकि, व्यापक axonal अध: पतन के अभाव के 36 के बाद हासिल की है.
संवेदी न्यूरॉन्स के अक्षतंतु transection द्वारा प्रेरित Wallerian अध: पतन आसानी से बाहर का पीओ पीछे छोड़ रहा है, फिल्टर के ऊपर की ओर scraping द्वारा फिल्टर पर हो explants में मॉडलिंग की हैफिल्टर चित्रा 3 ए के नीचे की ओर बढ़ी कि axons की rtion. 3B चित्रा से पहले और में फिल्टर axotomy के बाद β-III ट्यूबिलिन के लिए दाग फिल्टर के नीचे के हिस्से का विशिष्ट उदाहरण से पता चलता है. कुछ axons beading दिखाने के लिए शुरू हालांकि axotomy के बाद 3 घंटे में, छोटे विखंडन, वहाँ है. 7.5 घंटे तक, सबसे axons खंडित या पूरी तरह से चला रहे हैं. यह इन विट्रो में और vivo मॉडल 19 में अन्य के रूप में करता nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +, 5 मिमी, 30 मिनट pretreatment) के साथ explants के pretreatment, फिल्टर पर प्रेरित Wallerian अध: पतन से बचाता है.
चित्रा 1. तक आवेषण शुद्ध axonal तैयारी की बड़ी मात्रा में उत्पादन. एक कुएं में एक डालने के एक डालने के (ए) के ए) एक स्कीमा, (ख) औरडीआरजी explants (ग). बी) अकेले पाली डी lysine या पाली-D के साथ हो उन लोगों की तुलना में अधिक है और लंबे समय तक axons बढ़ने कि explants में पाली डी lysine, laminin और कोलेजन परिणामों के साथ फिल्टर की अनुक्रमिक कोटिंग के साथ अंतिम विन्यास -लाइसिन और कोलेजन. छवियों को एक ही सब्सट्रेट कोटिंग शर्तों के तहत इमेजिंग सॉफ्टवेयर. सी) का उपयोग अतिव्यापी, कम बढ़ाई चित्र खपरैल द्वारा तैयार किए गए, फिल्टर पर बनाए रखा डीआरजी explants) प्लास्टिक. डी पर हो explants की तुलना में काफी अधिक विपुल axonal विकास दिखाने scraping द्वारा प्राप्त axonal तैयारी फिल्टर के ऊपर की ओर सेल नाभिक लगभग 17 explants से प्रारंभ हुआ और एक 24 मिमी फिल्टर के नीचे की ओर पर हो कि axons की. ई) उदाहरण से रहित है. जितना 30 explants आसानी से आम जैव रासायनिक तरीकों के लिए पर्याप्त axonal सामग्री उपज, इन तैयारियों में विकसित कर सकते हैं. Lysates के एफ) Immunoblots coll ected पैंदा बनाम फिल्टर सबसे ऊपर से histone H3, एक परमाणु मार्कर, फिल्टर सबसे ऊपर तक ही सीमित है कि प्रदर्शित करता है. कुल प्रोटीन सामग्री विभिन्न नमूने भर सामान्यीकृत था. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. Axonal अध: पतन का अध्ययन फिल्टर आवेषण में पौष्टिकता संबंधी कारक वापसी से प्रेरित. एक) स्कीमा एक ठेठ NGF अभाव प्रयोग रूपरेखा. डीआरजी explants) NGF में बनाए रखा या 12 या 36 घंटे के लिए NGF से वंचित explants से axonal तैयारी के विभिन्न आवर्धन पर प्रतिनिधि छवियों (5X और 20X उद्देश्यों) NGF की उपस्थिति में व्यापक axons हो जाना, और NGF अभाव. बी पर पतित."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. फिल्टर आवेषण में axonal transection द्वारा प्रेरित Wallerian axonal अध: पतन का अध्ययन. एक) स्कीमा एक ठेठ axotomy प्रयोग रूपरेखा. एक्जॉन विच्छेद, फिल्टर के ऊपर की ओर scraping. बी नीचे की ओर कटे axons (सेल शरीर से रहित) छोड़कर) बरकरार explants से axonal तैयारी के प्रतिनिधि छवियों या उपस्थिति या अनुपस्थिति में transection के बाद 3 या 7.5 घंटा के बाद से हासिल की है NAD + के 5 मिमी की. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस तकनीक आदत डाल जब खाते में लेने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों का अध्ययन किया जाएगा कि neuronal आबादी, सब्सट्रेट, फिल्टर के छेद के आकार और सतह क्षेत्र शामिल हैं. इन सभी मापदंडों प्राप्त neurite तैयारी की विशिष्टता, गुणवत्ता और मात्रा को प्रभावित करेगा, और अंत उपयोगकर्ता द्वारा ध्यान से विचार किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत उदाहरण में, DRG न्यूरॉन्स का उपयोग इस प्रकार एक शुद्ध (विशिष्ट) axonal तैयारी दे रही है, केवल axons को विस्तार देने का लाभ दिया है.
भ्रूण DRGs की axonal विकास बहुत तेजी से axonal नमूने संस्कृति में केवल 2 दिन के बाद तैयार रहने की इजाजत दी, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से न्यूरॉन्स की तुलना में है. 1 माइक्रोन के छेद के आकार से बढ़ रही axons की कुशल यात्रा की अनुमति है, जबकि नीचे की सतह में पलायन से सेल शरीर को रोकने के लिए पर्याप्त रूप से छोटे साबित हो गया है. उपलब्ध छोटे आकार (यानी 0.4 माइक्रोन) की तुलना में यह पतली axons के लिए चयनात्मकता लागू नहीं करता है.डीआरजी explants के अध्ययन के लिए, (6 कुओं प्लेटों में इस्तेमाल के लिए) 24 मिमी फिल्टर डालने अक्सर प्रोटीन इनपुट की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है जो immunoprecipitation, सहित ज्यादातर तकनीक, के लिए axonal प्रोटीन के नमूने के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पादन होता है. हालांकि, छोटे आकार (12 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए यानी फिल्टर डालता है) विशेष रूप से अलग कोशिकाओं और / या immunocytochemistry का उपयोग करते हैं, तो कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं.
फिल्टर डालने कुशलता परीक्षा के लिए सेल शरीर से neurites आइसोलेट्स हालांकि, यह दोनों डिब्बों पूरे सेल उपचार करने के लिए प्रयोगात्मक जोड़तोड़ सीमित, एक ही संस्कृति मीडिया का हिस्सा है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. बंटे Campenot कक्षों या microfluidic संगठनों सहित अन्य अलगाव दृष्टिकोण, विभिन्न डिब्बों का अंतर उपचार के लिए अनुमति देते हैं. प्रयोगकर्ता अपनी विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए सबसे उपयुक्त है इन सेल डिब्बे अलगाव तकनीक का जो यह निर्धारित करना चाहिए.
बेशक, फिल्टर आवेषण के अलगाव क्षमता axonal अध: पतन से परे फायदेमंद हो सकता है. उदाहरण के लिए, विकास शंकु regenerating के जैव रसायन आसानी से किया जा सकता हैबढ़ी डीआरजी explants साथ फिल्टर के नीचे की ओर scraping द्वारा अध्ययन किया. घंटे के भीतर, axotomized DRG न्यूरॉन्स, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, तो विकास शंकु प्रोटीन regenerating की शुद्धि के लिए अलग किया जा सकता है कि फिल्टर के नीचे की ओर में विकास शंकु पुनर्जन्म होगा. इसके अलावा, इस विधि द्वारा प्राप्त axonal नमूने पश्चिमी सोख्ता के अलावा अन्य जैव रासायनिक तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, axons आगे immunoprecipitation या pulldown प्रयोगों 9 के अधीन किया जा सकता है कि एक प्रोटीन नमूना प्राप्त करने के लिए RIPA या CHAPS सेल बफ़र्स में lysed किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, axonal नमूने पहले 5 वर्णित के रूप में, शाही सेना निकासी के लिए कार्रवाई की जा सकती.
प्रस्तुत संस्कृति प्रणाली का लाभ संवेदी न्यूरॉन्स तक सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, cortical न्यूरॉन्स फिल्टर 7 के नीचे के हिस्से में synapses बनेगी कि dendrites और axons का विस्तार होगा. इस प्रकार, (synapses के साथ समृद्ध) शुद्ध neurite नमूने ISOLAT किया जा सकता हैsynapses में विशेष रूप से उस जगह ले प्रक्रियाओं की विस्तृत जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए सेल शरीर से एड. इस तकनीक का उपयोग आसान है और कोई बकाया महत्वपूर्ण कदम है. हालांकि, axonal लंबाई और आकारिकी फिल्टर की कोटिंग की गुणवत्ता के लिए काफी संवेदनशील है. इसलिए, देखभाल मजबूत और लगातार axonal नमूने प्राप्त करने के लिए समय का संकेत मात्रा के लिए ताजा और समरूप कोटिंग समाधान का उपयोग करने के लिए लिया जाना चाहिए. इस तकनीक का व्यापक प्रयोग सामान्य परिस्थितियों और बीमारी में, axons की शरीर क्रिया विज्ञान के हमारे ज्ञान अग्रिम में मदद मिलेगी.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
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