Introduction
El compartimiento axonal de las neuronas muestran un alto grado de independencia funcional del compartimiento somato-dendrítica. En las neuronas de proyección, los axones contienen la mayor parte de la proteína de 1,2 neuronal. El estudio de la fisiología y la patofisiología de los axones ha cobrado fuerza en la comunidad de las neurociencias porque los estudios recientes han demostrado que la disfunción axonal temprana parece ser una característica común de las enfermedades neurodegenerativas y trastornos neuropsiquiátricos 3. Parece probable que una mejor comprensión de los mecanismos-axonales exclusiva en condiciones normales y patológicas arrojará luz sobre los primeros eventos que conducen a la disfunción.
El presente protocolo describe cómo utilizar insertos de cultivo que lleva una membrana porosa (filtro) para obtener grandes cantidades de material axonal pura que es adecuado para la bioquímica y análisis inmunocitoquímico. El uso de filtro inserta estudiar biología axonal fue implementado por primera vez por Steward y4 colegas y seguirá trabajando Twiss y sus colegas 5 a su configuración actual. La técnica está ahora en uso actual por grupos que estudian diversos aspectos de la biología axonal y dendrita, con ligeras modificaciones en cada caso para adaptarse a la población de neuronas estudiados, los tratamientos realizados y el tipo de análisis bioquímicos utilizados 6-9. El presente protocolo no tiene intención de dar cabida a todas las alternativas para una variedad de aplicaciones tales, sino más bien proporcionar un enfoque simple que es adecuado para la mayoría de aplicaciones. En particular, el protocolo descrito aquí utiliza un revestimiento de triple que maximiza el rendimiento axonal para los análisis bioquímicos y es más adecuado para estudiar axonales revestimientos-degeneración otra descritos en la literatura producida menos axones que se retraen y degeneran más rápido cuando se le priva de factores tróficos 9.
En este procedimiento, los cuerpos celulares neuronales permanecen aislados en la cima de las qu filtroaxones ile pasan a través de los poros y crecen a lo largo de su superficie inferior. Axones Pure (libres de células gliales y contaminantes del cuerpo celular neuronal) que crecen en la superficie inferior del filtro pueden ser recogidos para análisis bioquímicos o se pueden fijar in situ y se examinaron mediante técnicas inmunocitoquímicas 9. El procedimiento se basa en el uso de las neuronas sensoriales embrionarias a partir de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). GRD embrionarias son ampliamente utilizados para estudiar la biología axonal porque neuritas de estas células experimentan un crecimiento rápido y robusto in vitro cuando se mantiene en factor de crecimiento nervioso (NGF), y porque se someten a la degeneración rápidamente cuando se le priva de este factor. Además, las neuronas DRG carecen de dendritas, de manera que todas las neuritas recogidos por este método son puramente axones.
Elementos filtrantes representan una gran ventaja en comparación con otros métodos utilizados para estudiar los axones. Estudios dependen de la utilización de la microscopía para diferenciar los procesos que ocurren en el soma celular de las de unXons proporcionan información bioquímica limitada. Como otro ejemplo, los sistemas de cultivo compartimentadas (por ejemplo, cámaras Campenot 10 o dispositivos de microfluidos 11) son útiles para los enfoques de formación de imágenes y para el tratamiento diferencial de los compartimentos de la célula, pero proporcionan sólo pequeñas cantidades de material axonal, lo que impide el uso de estas técnicas para los análisis bioquímicos que requieren cantidades relativamente grandes de muestra. Además, su uso requiere una formación importante, así como dispositivos especializados, y son mucho tiempo. Otro enfoque a menudo se utiliza para aislar los axones de explantes es quitar manualmente un centro de explante (que contiene los cuerpos celulares neuronales) antes de la recogida de muestras axonal. Aunque esto puede producir grandes cantidades de preparaciones del axón enriquecido, los axones en esta preparación pueden ser envueltos en glía y eliminar rápidamente los cuerpos 20 de explantes consecutivamente de 6 pozos (como un ejemplo de un experimento mínimo) es que consume tiempo y en el límite de la viabilidad.
En contraste, el método presentado aquí produce preparaciones axonales abundantes y puros que se pueden analizar por prácticamente cualquier técnica bioquímica que se utiliza comúnmente para analizar lisados de células enteras, como western blot, inmunoprecipitación 6, transferencia de Northern 5 espectrometría de masas 6, la purificación del ARN 7,12,13, entre otros. Además, el protocolo se puede aplicar a inmunofluorescencia (IF) técnicas, ya que es posible fijar los axones que crecen en el lado inferior del filtro de examinar más a ellos por SI. Este enfoque facilita en gran medida el análisis de los procesos axonales-específica ya que no hay cuerpos celulares en la preparación final. Esta es una ventaja significativa ya que una señal de alta inmunofluorescencia desde los cuerpos celulares a menudo socava examen y análisis de una señal más débil procedente de estructuras delgadas tales como los axones.
Dos aplicaciones del método de cultivo para estudiar AR degeneración axonalE descrito; un modelo de la poda de desarrollo y un modelo de degeneración inducida por la lesión (comúnmente conocida como degeneración walleriana). El modelado de la poda de desarrollo se basa en el hecho de que las neuronas sensoriales in vivo compiten para limitar cantidades de NGF derivado de la diana y aquellos que no lo suficiente para recibir degenerada apoyo neurotrófico 14. Este fenómeno se puede imitar en cultivos de DRG embrionarias mediante la retirada de NGF del medio de cultivo, que, como sucede in vivo, inicia la degeneración axonal seguida de la destrucción cuerpo de la célula. Para modelar la degeneración walleriana, la parte superior del filtro con los cuerpos celulares se raspa. Los axones que habían crecido en el lado inferior del filtro se separan físicamente de los cuerpos celulares y se someten a partir de entonces el proceso degenerativo rápida y estereotipado conocida como degeneración walleriana 15, el nombre de A. Waller que informó por primera vez el fenómeno en 1850 16.
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Protocol
NOTA: Los siguientes procedimientos están en conformidad con las directrices aprobadas por el Consejo Canadiense de los Animales. Se hacen todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el sufrimiento de los animales durante los procedimientos.
1. Revestimiento de Filtros
NOTA: Cuando insertos de filtro de cultivo se colocan en pocillos de placas de múltiples pocillos, dos compartimentos se definen: el compartimento superior es la región por encima de la pieza de inserción y el compartimento inferior es el uno debajo del inserto de la Figura 1A.ab. Los explantes se sembraron en el compartimento superior donde se unen a la parte superior del filtro; muchos axones crecen a través del filtro y se extienden en el lado inferior del filtro, dentro de la parte inferior del compartimiento de la figura 1A.c. Los volúmenes de trabajo estándar (es decir, para la aplicación de la solución de recubrimiento, lavados, medios de cultivo, etc) son de 2 ml para el compartimiento inferior y 1 ml para el compartimiento superior y van a ser mencionada en el protocolo como "; Volúmenes estándar ". Añadir soluciones de partida con el compartimento inferior mediante la colocación de la punta de la pipeta en la brecha entre el inserto y el lado del pozo. Además, la inclinación de la inserción a un lado mientras que la dispensación de la solución para evitar las burbujas de ser atrapado en la parte inferior del filtro.
- Comience el recubrimiento de los filtros el día antes de chapado. Bajo el tejido campana de cultivo estéril, colocar 24 mm inserciones de filtro en una placa de 6 pocillos de recepción. Incubar insertos con poli-D-lisina en agua (1 mg / ml) durante 1 hora a TA usando volúmenes estándar: 2 ml en el compartimento inferior y 1 ml en la parte superior.
- Aspirar poli-D-lisina y se lava una vez con agua. Aspirar el agua, cierre la tapa y deje los platos a secar en la campana de O / N. Durante la aspiración de líquidos, asegúrese de eliminar un remanente de líquido que queda atrapado directamente debajo del filtro.
- A la mañana siguiente, diluir la laminina en agua (10 mg / ml), mezclar y caliente a 37 ° C. Incubar insertos con laminina 1 hr en cell incubadora a 37 ° C, utilizando volúmenes estándar.
- Laminina Aspirar y añadir colágeno en agua (0,1 mg / ml) e incubar durante 1 hora a TA. En este caso, utilizar 2 ml para el compartimiento inferior y 2 ml para el compartimento superior.
- Colágeno Aspirar y lavar una vez con agua estéril. Los filtros están ahora listos para recibir medios de cultivo y explantes de DRG, como se describe en el PASO 3.
2. Dissecting Embryonic Ganglio de raíz dorsal (GRD) explantes
- Anestesiar a un ratón hembra embarazada de 13 días por una inyección IP de Avertin (250 mg / kg). Espere 10 a 15 minutos y compruebe si hay falta de reflejos de retirada de la córnea y de pedal. Una vez que los reflejos están ausentes, realice dislocación cervical.
- Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos y abdomen de una mujer con etanol al 70%. Permitir que los instrumentos se sequen. Manteniendo la piel del abdomen y cortar a través de las capas de piel y músculo para exponer la cavidad abdominal.
- Extirpar el útero separando del cuello del útero y los ovarios. En un esterilizadorle capó, la toma de embriones del útero con tijeras y recogerlas en una placa de Petri llena de medios L15 helada. Mantener en hielo.
NOTA: Consulte los informes técnicos previos para más detalles sobre cómo obtener embriones de 13 días de gestación 17,18. - Bajo el microscopio, se encontraba el embrión en un lado y el uso de pequeñas tijeras de primavera para quitar de la cabeza. Hacer una incisión a lo largo de los lados laterales para descartar el pecho, el vientre, las extremidades y la cola. Mantenga la parte posterior que contiene la columna vertebral, sentar lado ventral hacia arriba y retire todos los órganos viscerales.
- Con pequeñas tijeras de primavera, exponer toda la médula espinal mediante la reducción de la columna vertebral desde su lado ventral a lo largo de la línea media. Sujete la carcasa inferior con un par de pinzas (# 3) y el uso de un segundo par de celebrar la médula espinal por su aspecto más rostral.
- Lenta y suavemente jale el cable alejado de la cavidad vertebral y evitar el paso de los GRD de la médula espinal utilizando fórceps ultrafinas (# 5). Grupo de los GRD que se recaude enla parte inferior del plato.
- Recoger GRD agrupados por aspiración con una pipeta 200 l que ha sido cortado para ampliar su apertura. Coloca los GRD en un tubo y dejar en hielo hasta que se termine la colección DRG.
NOTA: Se prefieren las blancas puntas / transparentes porque GRD no se adhieren a las paredes de este consejo (en comparación con las puntas amarillas estándar). Consejos de lavado con medios antes de su uso previene más GRD se adhiera a sus paredes.
3. Siembra y mantenimiento del Ganglio de raíz dorsal explantes de Filtros
- Añadir media DRG completa a 37 ° C a los insertos recubiertos utilizando volúmenes estándar. Complementar los medios compartimiento inferior con 15 ng / ml de NGF, mientras se mantiene el compartimento superior libre de NGF.
NOTA: Si bien el NGF se difunde de manera eficiente a través del filtro y su concentración se equilibra dentro de horas, hemos observado que la aplicación de NGF al compartimiento inferior directamente antes de la siembra aumenta significativamente el rendimiento axonal en el BOttom superficie del filtro. - Transfiera los GRD del tubo a los filtros con una pipeta 1.000 l con una punta recortada para ampliar su apertura.
- Dibujar recursos en la punta de 2 a 3 veces antes de la recogida de los GRD. Esto evita que se pegue a la cara interna de la punta. La misma punta puede ser re-utilizado para todos los pozos. El uso de puntas sin color (frente a puntas azules estándar) reduce la adherencia a la superficie DRG punta.
- Para transferir los GRD, establezca la pipeta de 800 l. Aspirar aproximadamente 200 l de los medios de comunicación desde la parte superior del filtro, y luego ir al tubo que contiene DRG-y una pipeta un volumen pequeño de arriba a abajo - para volver a suspender los GRD que se han hundido hasta el fondo. Aspirar todo el volumen y GRD de pipeta sumergiendo la punta en el centro de la pieza de inserción.
- Una vez que todas las partes movibles se cargan, cierre la tapa de la placa y agitar la placa de 10x, golpeándolo suavemente en el banco campana entre cada remolino. Estos movimientos aumentan el rendimiento axonal ayudando explantes de DRG fregadero yadjuntar al filtro. Esto también ayuda a distribuir uniformemente explantes de modo que los axones de diferentes explantes no se superponen.
NOTA: El procedimiento de siembra explante se describe en los pasos anteriores aumenta significativamente la tasa global de unión explante al sustrato (hasta 75%). Más significativamente, el procedimiento de pipeteado evita fácilmente explantes de flotando en la superficie del medio en vez de hundirse hasta el fondo de la pieza de inserción. - Para los análisis bioquímicos, los GRD de semillas de un embrión (alrededor de 30) por filtro. Para los análisis morfológicos, utilice la mitad o un tercio de los GRD de un embrión (10-15). Esta decisión debe ser tomada antes de la recogida de los GRD en tubos, de modo que todos los GRD de un tubo se siembran en un único bien (ya sea 30, 15 o 10 GRD).
- Mantener culturas en un incubador de células a 37 ° C, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días. Para cambiar los medios de comunicación, aspirar el compartimento superior primero, seguido por el compartimento inferior. Añadir medio fresco en volumen estándars empezando por el compartimento inferior.
NOTA: Para evitar que células / axones se seque, no cambie los medios de comunicación en más de 3 inserciones al mismo tiempo. GRD cultivadas en filtros en presencia de NGF se extenderán los axones largos, alcanzando hasta 2 mm después de 2 días en cultivo.
4. Factor trófico Tratamiento Retiro
La retirada de NGF induce la degeneración axonal con la fragmentación axonal (determinado por contraste de fase y β-III-tubulina IF) que aparece por primera vez alrededor de 12 horas después de la retirada. Fragmentación completa se logra en un 36 hr. ¿Por cuánto tiempo se deja la degeneración de proceder para tiene que ser elegido por el usuario final de acuerdo con el diseño experimental.
- Después de la fase de extensión axonal 2-día, cambio de medio de compartimentos superior e inferior de los medios de comunicación que carece de NGF y contiene anticuerpos anti-NGF (1 mg / ml) para secuestrar cualquier NGF restante (o producido endógenamente).
- Placas de retorno a la incubadora de células (37 ° C) para permitirNGF degeneración inducida por la retirada de proceder para la cantidad de tiempo deseada.
- Proceder a la extracción de proteínas (paso 6) para su análisis por Western blot o examinar directamente los filtros de IF (paso 7).
5. Axonal transección para inducir walleriana Degeneración
Este procedimiento deja los axones en el lado inferior del filtro separados de su cuerpo celular, pero por lo demás intacto. A partir de entonces, estos axones iniciar rápidamente la degeneración walleriana. Fragmentación axonal (evidenciado por contraste de fase o β-III-tubulina SI) aparece por primera vez por 3 horas después de la sección; por 9 horas, los axones son completamente fragmentada y se separan del filtro. ¿Por cuánto tiempo se deja la degeneración de proceder para tiene que ser elegido por el usuario final de acuerdo con el diseño experimental.
- Raspe el lado superior del filtro, que contiene los explantes de DRG cultivadas, con una célula-rascador. Asegurar la eliminación completa del material superior por raspador se mueve en X-, Y-y circularlas direcciones.
- Deseche los medios de comunicación desde el compartimiento superior que contiene los explantes flotantes que han sido tomadas por raspado del filtro y reemplazar con 1 ml de medio DRG pre-calentado, completo que contiene NGF (10 ng / ml).
- Placa de retorno a la celda incubadora (37 ° C) para permitir la degeneración walleriana de proceder para la cantidad de tiempo seleccionado por el usuario final.
- Proceder a la extracción de proteínas (paso 6) para su análisis por Western blot o examinar directamente los filtros de IF (paso 7).
6. Extracción de proteínas de muestras axonales
- Llenar los tubos de recogida (1,5 ml) con 75 l de tampón de muestra Laemmli. Mantener los tubos en hielo durante la cosecha axones de todo el conjunto de filtros.
- Lavar el filtro con explantes de DRG en PBS y raspar el lado superior del filtro. Extraiga la tapa de la placa, limpiar la parte superior del filtro con un aplicador de punta de algodón y aspire cualquier PBS extra de los lados superior e inferior.
- Coloque inserción al revéssobre un banco y corte el filtro de la inserción utilizando un bisturí afilado. Mantenga el filtro con pinzas, de abajo hacia arriba. Haga un corte desde la circunferencia al centro del filtro con unas tijeras.
- Coloque el filtro en la parte superior del tubo de recogida, y con unas pinzas, pulse el centro del filtro por el tubo. Mientras hace esto, debe formar un embudo. Empuje el filtro en forma de embudo para la parte inferior del tubo de modo que se sumerge en el tampón de muestra de Laemmli.
- Extracción de la proteína completa por ebullición los tubos durante 4 min. Retirar el filtro utilizando pinzas para colocar boca abajo en la parte superior del tubo y la realización de un breve centrifugado (2000 xg durante 15 seg). Deseche los filtros secos.
- Resolver 10 l de la preparación de proteína axonal en un SDS-PAGE seguida de Western blot para detectar las proteínas de interés.
NOTA: Como referencia, una preparación axonal de 20 explantes cultivados durante 2 días y se lisaron en 100 l de tampón de lisis RIPA tendrá una concentración de proteína de 4-6g / l.
7. Examen de inmunofluorescencia de los axones en los filtros
Los pasos siguientes describen las manipulaciones generales para llevar a cabo si la tinción de elementos filtrantes, ejemplificadas por la detección de β-III-tubulina. Fijador, tiempos de incubación, las concentraciones y los demás datos deben ser optimizados para otros pares de antígeno-anticuerpo.
- Utilizar placas de 6 pocillos utilizados anteriormente, limpiar a fondo, para los siguientes lavados e incubaciones de los insertos.
- Lavar brevemente insertos en PBS. Fijarlos en recién preparada de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a TA en un agitador.
- Después de la fijación, raspar y limpiar el lado superior de la pieza de inserción para recoger los axones que crecieron exclusivamente en la superficie inferior del filtro. Proceda con incubaciones estándar para IF.
- Incubar insertos en solución de bloqueo (TBS, 0,05% de Tween 20, leche descremada 5%), el uso de volúmenes estándar, durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
- Transferencia inserta al anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo (anti-β-III-tubulina, 1:5.000), usando volúmenes estándar. Incubar O / N (~ 18 h) a 4 ° C con agitación suave.
- Lavar el primer anticuerpo dos veces en PBS (2 X 10 min a TA).
- Transferencia inserta a anticuerpos secundarios fluorescentes conjugado diluido en tampón de bloqueo (cabra anti-ratón, 1:2000), usando volúmenes estándar. Incubar protegido de la luz durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave.
- Lavar el 3x anticuerpo secundario en PBS (3 x 10 min a TA).
- Después de IF es completa, tome Salida de inserción, vaciar PBS desde el último lavado y limpie la parte superior del filtro con un aplicador de punta de algodón. Aspirar el líquido de los lados superior e inferior.
- Lugar inserte al revés en el banco, y cortó el filtro del inserto con un bisturí afilado.
- Mantenga el filtro con una pinza, la baja, y colocarla sobre el portaobjetos de microscopía. Overlay con un cubreobjetos y mou compatible fluorescentemedios nting. Deje secar extendido en cuarto frío, protegido de la luz. Examinar y capturar imágenes con un microscopio fluorescente.
NOTA: Cuando se almacena a 4 ° C y protegido de la luz, estas preparaciones se pueden mantener durante semanas con una mínima pérdida de fluorescencia. - OPCIONAL: Como alternativa, si se puede realizar en los filtros que se han eliminado de la inserción. Para hacer eso, raspar y limpiar la parte superior de los filtros directamente después de la fijación.
- Tome filtros de los insertos con un bisturí y colocar filtros en punto axones-up en la parte inferior de una placa de seis pocillos.
- Después, realizar incubaciones de SI como se indica en 7.4 a 7.8 y 7.11. La ventaja de esta alternativa es que ahorra reactivos, ya que, por ejemplo, volúmenes de incubación puede bajar a 500 l (en comparación con los 3 ml utilizados cuando los filtros se tiñeron directamente en los insertos como se muestra en 7.1 a 7.11).
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Representative Results
Explantes de ganglios de la raíz dorsal de ratones E13.5 crecen extensamente sobre filtros secuencialmente recubiertos con poli-D-lisina, la laminina y el colágeno (Figura 1B, izquierda), que alcanzan hasta 2 mm dentro de 2 días en cultivo. Esta combinación de sustrato produce un crecimiento especialmente exuberante; otras combinaciones producen axones que son considerablemente más corto (Figura 1 B, derecha). Por otra parte, los GRD mantenidos en los filtros se extienden más y más largos que los axones DRG cultivadas en la Figura 1C de plástico.
Los filtros con poros de 1 micra de diámetro, que se utiliza en este protocolo, retener cuerpos celulares en el lado superior del filtro, al tiempo que permite el crecimiento de neuritas a través de los poros y se extienden en la superficie inferior. Esto se muestra claramente por microscopía de epifluorescencia de filtros teñidos para núcleos (DAPI) y β-III-tubulina Figura 1D. En filtros intactos es posible observar los núcleos celulares, tanto de las neuronas y nocélulas neuronales, concentrados en el centro de explante y algunos de irradiación de ella. Sin embargo, cuando se raspa el lado superior del filtro, los núcleos se han ido y sólo los axones pueden ser detectados, en el lado inferior filtros.
La figura 1E muestra un ejemplo de una parte inferior del filtro que originalmente sostenido el crecimiento de aproximadamente 17 explantes. En este ejemplo, el lado superior se limpió antes de la fijación y por lo tanto la señal de inmunofluorescencia representa axones puros en el lado inferior del filtro. La extracción de proteínas a partir de preparaciones axonal (lado inferior del filtro) carecen de proteínas nucleares Figura 1F, lo que demuestra que la preparación esté libre de cuerpos celulares. Alternativamente, cuando se trabaja con la extracción de ARN, es posible confirmar la pureza de la preparación axonal mediante la comparación de la presencia de ARNm diferencialmente localizados (es decir, γ-actina) entre lisados de células enteras y preparaciones axonales (como se muestra por otros 5
Poda del Desarrollo de las neuronas sensoriales se puede modelar en filtros sometidos a la privación del factor trófico. Después de 2-3 días de la extensión de axones en presencia de NGF, los medios de comunicación se cambia a uno que carece de NGF y que contiene un anticuerpo anti-NGF que secuestrar cualquier resto de NGF Figura 2A. En los puntos de tiempo deseados, los filtros se procesaron para la bioquímica o la inmunocitoquímica.
La Figura 2B muestra ejemplos típicos de los lados inferiores de filtros teñidos para β-III-tubulina antes y después de la privación. Después de 12 horas de privación hay poca fragmentación axonal, aunque algunos axones empiezan a mostrar pedrería. Sin embargo, la extensa degeneración axonal se logra después de 36 de la privación.
Degeneración walleriana inducida por transección axón de las neuronas sensoriales se modela fácilmente en explantes cultivados en filtros por raspado de la parte superior del filtro, dejando atrás el PO distalRTion de los axones que crecían en el lado inferior del filtro de la Figura 3A. Figura 3B muestra ejemplos típicos de los lados inferiores de filtros teñidos para β-III-tubulina antes y después de la axotomía en-filtro. A las 3 horas después de la axotomía, hay poca fragmentación, aunque algunos axones comienzan a mostrar rebordear. Por 7,5 horas, la mayoría de los axones están fragmentados o desaparecido por completo. Pretratamiento de los explantes con nicotinamida adenina dinucleótido (NAD +, 5 mM, 30 min de tratamiento previo) protege de la degeneración walleriana inducida en filtros, como lo hace en otro in vitro y en modelos in vivo 19.
Figura 1. Inserciones Filtrar producen grandes cantidades de preparados axonales puras. A) Un esquema de un inserto (a), de un inserto en un pozo (b) y elconfiguración final con explantes de DRG (c). B) el recubrimiento secuencial de filtros con poli-D-lisina, laminina y colágeno resultados en explantes que crecen más y más largos axones en comparación con las cultivadas con poli-D-lisina solo o poli-D -lisina y colágeno. Las imágenes fueron producidas por el suelo de baldosas superpuestas, bajo magnificación imágenes utilizando el software de imágenes. C) En las mismas condiciones de recubrimiento de sustrato, los explantes de DRG mantenidos en los filtros muestran el crecimiento axonal considerablemente más exuberante de los explantes cultivados en plástico. D) La preparación axonal obtenido por raspado el lado superior del filtro está desprovisto de los núcleos celulares. E) Ejemplo de axones que se originaron a partir de aproximadamente 17 explantes y se cultivan en el lado inferior de un filtro de 24 mm. Tanto como 30 explantes pueden crecer fácilmente en estas preparaciones, produciendo suficiente material de axonal para enfoques bioquímicos comunes. F) inmunotransferencias de lisados coll eja de las tapas de filtro contra fondos demuestran que la histona H3, un marcador nuclear, se limita a la parte superior del filtro. El contenido total de proteínas fue normalizada a través de las diferentes muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El estudio de la degeneración axonal inducida por la retirada del factor trófico en elementos filtrantes. A) Esquema de esbozar un experimento típico de NGF-privación. Explantes de DRG crecen extensos axones en presencia de NGF y degeneran en privación de NGF. B) Imágenes representativas en diferentes aumentos (5X y 20X objetivos) de las preparaciones axonal de explantes mantenidos en NGF o privadas de NGF durante 12 o 36 horas."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El estudio de la degeneración axonal walleriana inducida por transección axonal en elementos filtrantes. A) Esquema de esbozar un experimento típico axotomía. Axon corte se consigue mediante el raspado de la parte superior del filtro, dejando los axones cortados (desprovistos de cuerpos celulares) en el lado inferior. B) Imágenes representativas de preparaciones axonal de explantes intactos o después de 3 o 7,5 horas después de la sección en la presencia o ausencia de 5 mM de NAD +. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los parámetros más importantes a tener en cuenta para la adaptación de esta técnica incluyen la población neuronal que será estudiado, el sustrato, el tamaño de poro del filtro y superficie. Todos estos parámetros tendrán un impacto en la especificidad, la calidad y cantidad de la preparación de las neuritas obtenido, y deben ser cuidadosamente considerados por el usuario final. En los ejemplos presentados en este protocolo, el uso de las neuronas DRG tiene la ventaja de que se extiende sólo los axones, dando así una pura (específica) preparación axonal.
El crecimiento axonal de GRD de embriones se compara muy rápido a las neuronas del sistema nervioso central, lo que permite muestras axonales a ser preparados después de sólo 2 días en cultivo. El tamaño de poro de 1 m ha demostrado ser suficientemente pequeña para evitar que cuerpos de las células migren a la superficie inferior mientras que permite el paso eficiente de los axones en crecimiento. En comparación con los tamaños más pequeños disponibles (es decir, 0,4 micras) no impone la selectividad de los axones delgados.Para el estudio de los explantes de DRG, el inserto de filtro de 24 mm (para uso en placas de 6 pocillos) produce cantidades suficientes de muestra de proteína axonal para la mayoría de las técnicas, incluyendo inmunoprecipitación, que a menudo requiere una gran cantidad de entrada de la proteína. Sin embargo, los tamaños más pequeños (es decir, inserciones de filtro para placas de 12 pocillos) son adecuados para algunas aplicaciones, especialmente si el uso de células y / o inmunocitoquímica disociadas.
Aunque el inserto de filtro aísla de manera eficiente las neuritas de los cuerpos celulares para su examen, es importante tener en cuenta que ambos compartimentos comparten el mismo medio de cultivo, lo que limita las manipulaciones experimentales a tratamientos de células enteras. Otros enfoques de aislamiento, incluidas las cámaras Campenot compartimentadas o cámaras de microfluidos, permiten un tratamiento diferenciado de los distintos compartimentos. El experimentador debe determinar cuál de estas técnicas de aislamiento de células del compartimento es la más adecuada para su propio diseño experimental específico.
Por supuesto, la capacidad de aislamiento de los insertos de filtro puede ser ventajoso más allá de la degeneración axonal. Por ejemplo, la bioquímica de la regeneración de los conos de crecimiento puede ser fácilmenteestudiado por el raspado de la parte inferior de los filtros con explantes de DRG adultos. En cuestión de horas, las neuronas DRG axotomized se regenerarán los conos de crecimiento en la parte inferior de los filtros que, tal como se describe en este protocolo, se pueden aislar para la purificación de la regeneración de las proteínas del cono de crecimiento. Por otra parte, las muestras axonales obtenidos por este método pueden ser analizados por métodos bioquímicos distintos de Western Blot. Por ejemplo, los axones pueden ser lisadas en RIPA o CHAPS tampones de lisis para obtener una muestra de proteína que puede ser sometida además a inmunoprecipitación o experimentos desplegables 9. Alternativamente, las muestras axonales pueden ser procesados para extracción de ARN, tal como se describe anteriormente 5.
La ventaja del sistema de cultivo presentado no se limita a las neuronas sensoriales. Por ejemplo, las neuronas corticales se extenderán dendritas y axones que forman sinapsis en el lado inferior del filtro 7. Por lo tanto, las muestras de neuritas puros (enriquecidos con sinapsis) se pueden ISOLATed desde los cuerpos celulares para análisis bioquímicos detallados de los procesos que tienen lugar exclusivamente en las sinapsis. El uso de esta técnica es simple y no tiene pasos críticos en circulación. Sin embargo, la longitud axonal y la morfología es bastante sensible a la calidad del revestimiento de los filtros. Por lo tanto, se debe tener cuidado de usar soluciones de revestimiento frescas y homogéneos para las cantidades indicadas de tiempo para obtener muestras axonales robusto y consistente. El uso generalizado de esta técnica le ayudará a avanzar en nuestro conocimiento de la fisiología de los axones, en circunstancias normales y en la enfermedad.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
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References
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