Introduction
Il compartimento assonale dei neuroni mostra un buon grado di autonomia funzionale dal compartimento somato-dendritico. In neuroni di proiezione, assoni contengono la maggior parte della proteina 1,2 neuronale. Lo studio della fisiologia e fisiopatologia degli assoni ha avuto un impulso nella comunità neuroscientifica, perché recenti studi hanno dimostrato che inizi la disfunzione assonale sembra essere una caratteristica comune delle malattie neurodegenerative e dei disturbi neuropsichiatrici 3. Sembra probabile che una migliore comprensione dei meccanismi assonale esclusiva in condizioni normali e patologiche farà luce sui primi eventi che guidano erettile.
Il presente protocollo descrive come utilizzare inserti di coltura recanti una membrana porosa (filtro) per ottenere grandi quantità di materiale assonale puro che è adatto per biochimica e analisi immunocitochimica. L'uso del filtro inserti a studiare biologia assonale è stato realizzato da Steward ecolleghi 4 e ulteriormente sviluppati da Twiss e colleghi 5 alla sua configurazione attuale. La tecnica è ora in uso corrente da gruppi studiano diversi aspetti della assonale e dendrite biologia, con lievi modifiche in ciascun caso per ospitare per la popolazione di neuroni studiati, i trattamenti eseguiti e del tipo di analisi biochimiche usati 6-9. Il presente protocollo non intende accogliere tutte le alternative per una tale varietà di applicazioni, ma piuttosto di fornire un approccio semplice che è adatto per la maggior parte delle applicazioni. In particolare, il protocollo qui descritto utilizza un triplo strato che massimizza il rendimento assonale per le analisi biochimiche ed è più adatto per studiare i rivestimenti assonale degenerazione-altri descritti nella letteratura prodotta meno assoni che ritraggono e degenerano più rapidamente in caso di privazione di fattori trofici 9.
In questa procedura, corpi cellulari neuronali rimangono isolati in cima alle wh filtroassoni ile passano attraverso i pori e crescono lungo la sua superficie di fondo. Assoni puro (esente della glia e contaminanti corpo cellule neuronali) che si sviluppano sulla superficie inferiore del filtro possono essere raccolti per analisi biochimiche o possono essere fissati in situ ed esaminati mediante tecniche immunocitochimiche 9. La procedura si basa sull'utilizzo di neuroni sensoriali embrionali dai gangli della radice dorsale (DRG). DRG embrionali sono ampiamente usati per studiare biologia assonale perché neuriti da queste cellule subiscono quando mantenuto in fattore di crescita nervosa (NGF) crescita veloce e robusto in vitro, e perché rapidamente subiscono degenerazione quando privati di questo fattore. Inoltre, i neuroni DRG mancano dendriti, in modo che tutti i neuriti raccolti da questo metodo sono puramente assoni.
Inserti del filtro rappresentano un grande vantaggio rispetto ad altri approcci utilizzati per studiare gli assoni. Studi basandosi sull'uso di microscopia per differenziare i processi che si verificano nel soma cella da quelli di unXON forniscono informazioni biochimiche limitate. Come altro esempio, sistemi di coltura compartimenti (ad esempio, camere Campenot 10 o dispositivi microfluidici 11) sono utili per approcci di imaging e per il trattamento differenziato dei compartimenti cellulari ma forniscono solo piccole quantità di materiale assonale, precludendo l'uso di queste tecniche di analisi biochimiche che richiedono relativamente grandi quantità di campione. Inoltre, il loro uso richiede una formazione significativa così come i dispositivi specializzati, e sono in termini di tempo. Un altro approccio spesso utilizzato per isolare gli assoni da espianti è quello di rimuovere manualmente un centro di espianto (che contiene i corpi cellulari neuronali) prima della raccolta del campione assonale. Anche se questo può produrre grandi quantità di preparazioni assone arricchito, assoni di questa preparazione possono essere avvolti glia e rimuovere rapidamente organi 20 di espianto consecutivamente da 6 pozzetti (come esempio di un esperimento minima) richiede tempo e al limite della fattibilità.
Al contrario, il metodo presentato qui produce abbondanti e pure preparati assonale che possono poi essere analizzati da virtualmente qualsiasi tecnica biochimica che viene comunemente utilizzato per analizzare lisati di cellule intere, come western blot, immunoprecipitazione 6, northern blot 5 spettrometria di massa 6, purificazione dell'RNA 7,12,13, tra gli altri. Inoltre, il protocollo può essere applicato a tecniche di immunofluorescenza (IF), in quanto è possibile fissare assoni in crescita nella parte inferiore del filtro di esaminarli ulteriormente IF. Questo approccio facilita notevolmente l'analisi dei processi specifici assonale poiché non esistono corpi cellulari nella preparazione finale. Questo è un vantaggio significativo in quanto un segnale alto immunofluorescenza da corpi cellulari spesso pregiudica esame e l'analisi di un segnale più debole proveniente da strutture sottili come assoni.
Due applicazioni del metodo di coltura per studiare assonale degenerazione are descritto; un modello di potatura di sviluppo e un modello di degenerazione lesioni indotte (comunemente indicato come la degenerazione walleriana). La modellazione di potatura sviluppo si basa sul fatto che i neuroni sensoriali in vivo competono per limitare quantità di NGF-bersaglio derivato e quelli non ricevono abbastanza neurotrofico supporto degenerato 14. Questo fenomeno può essere imitato in colture DRG embrionali ritirando NGF dal terreno di coltura, che, come accade in vivo, avvia degenerazione assonale seguito dalla distruzione corpo cellulare. Per modellare degenerazione Wallerian, il lato superiore del filtro con i corpi cellulari viene raschiata via. Gli assoni che erano cresciute sul lato inferiore del filtro diventare fisicamente separati dai corpi cellulari e successivamente subire il processo degenerativo rapido e stereotipico noto come degenerazione Walleriana 15, dal nome A. Waller che per primo ha segnalato il fenomeno nel 1850 16.
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Protocol
NOTA: Le seguenti procedure sono conformi alle linee guida approvate dal Consiglio canadese dei Animal Care. Tutti gli sforzi sono fatti per minimizzare il dolore e la sofferenza degli animali durante le procedure.
1. Rivestimento di filtri
NOTA: Quando inserti del filtro cultura sono poste in pozzetti di piastre multi-pozzetto, due comparti sono definite: vano superiore è la regione sopra l'inserto ed il vano inferiore è quello sotto l'inserto Figura 1A.ab. Espianti vengono seminate nel vano superiore dove essi attribuiscono al lato superiore del filtro; molti assoni crescono attraverso il filtro e si estendono sul lato inferiore del filtro, all'interno del compartimento inferiore Figura 1A.c. I volumi di lavoro standard (ad esempio per l'applicazione di soluzione di rivestimento, lavaggi, terreni di coltura, ecc) sono 2 ml per il comparto inferiore e 1 ml per il comparto superiore e stanno ad essere indicato nel protocollo come "; Volumi standard ". Aggiungere soluzioni a partire con il vano inferiore posizionando la punta della pipetta nel divario tra l'inserto e il lato del bene. Inoltre, l'inserto, inclinarlo su un lato, mentre l'erogazione della soluzione per evitare bolle restino intrappolate sul fondo del filtro.
- Avviare rivestire i filtri il giorno prima placcatura. Sotto il cofano coltura tissutale sterili, collocare 24 cartucce filtranti mm in una piastra da 6 pozzetti ricezione. Incubare inserti con poli-D-lisina in acqua (1 mg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, usando volumi standard: 2 ml nel comparto inferiore e 1 ml in cima.
- Aspirare poli-D-lisina e lavare una volta con acqua. Aspirare acqua, chiudere il coperchio e lasciare le piastre ad asciugare al cofano O / N. Durante l'aspirazione di liquidi, assicurarsi di rimuovere un residuo di liquido che diventa intrappolato direttamente sotto il filtro.
- La mattina successiva, diluire laminina in acqua (10 mg / ml), mescolare e calda a 37 ° C. Incubare inserti con laminina 1 ora in cell incubatore a 37 ° C, utilizzando volumi standard.
- Aspirare laminina e collagene aggiungere in acqua (0,1 mg / ml) e incubare per 1 ora a RT. In questo caso utilizzare 2 ml per il comparto inferiore e 2 ml per vano superiore.
- Aspirare collagene e lavare una volta con acqua sterile. I filtri sono ora pronti a ricevere terreni di coltura e espianti DRG, come descritto nel passaggio 3.
2. Dissezione embrionali radice dorsale Ganglion (DRG) espianti
- Anestetizzare un 13-giorno incinta topo femmina da una iniezione IP di Avertin (250 mg / kg). Attendere 10-15 minuti e verificare per mancanza di riflessi di prelievo della cornea e pedali. Una volta che i riflessi sono assenti, eseguire dislocazione cervicale.
- Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici e addome femminile con il 70% di etanolo. Lasciare strumenti per asciugare. Tenere la pelle dell'addome e tagliare gli strati cutanei e muscolari per esporre la cavità addominale.
- Rimuovere l'utero staccando dal collo dell'utero e delle ovaie. In un steriLe cappuccio, rimuovere gli embrioni dall'utero con le forbici e raccoglierli in una capsula di Petri pieno di ghiaccio freddo L15 media. Tenere su ghiaccio.
NOTA: Fare riferimento a relazioni tecniche precedenti per ulteriori dettagli su come ottenere embrioni di 13 giorni di gestazione 17,18. - Sotto il microscopio, porre l'embrione da un lato e l'uso di piccole forbici a molla per rimuovere la testa. Fare un'incisione lungo i fianchi laterali per eliminare il petto, ventre, gli arti e la coda. Tenere la schiena che contiene la colonna vertebrale, laici lato ventrale e rimuovere tutti gli organi viscerali.
- Con piccole forbici a molla, esporre l'intero midollo spinale tagliando la colonna vertebrale dal suo lato ventrale lungo la linea mediana. Tenere la carcassa giù con un paio di pinze (# 3) e utilizzando una seconda coppia di tenere il midollo spinale dal suo aspetto più rostrale.
- Lentamente e delicatamente tirare il cavo lontano dalla cavità vertebrale e un pizzico fuori DRG dal midollo spinale con pinze ultra-sottile (# 5). Gruppo DRG devono essere raccolte suil fondo del piatto.
- Raccogliere DRG raggruppati aspirando con 200 microlitri pipetta punta che è stato tagliato per allargare la sua apertura. Mettere i DRG in un tubo e lasciare sul ghiaccio fino alla raccolta DRG è finito.
NOTA: consigli Bianco / trasparente sono preferiti perché DRG non si attaccano alle pareti di questa punta (rispetto alle punte gialle standard). Ha Flushing con i media prima dell'uso ulteriore impedisce DRG di attaccarsi alle sue mura.
3. Semina e manutenzione di radice dorsale Ganglio espianti su Filtri
- Aggiungere supporti DRG completa a 37 ° C per gli inserti rivestiti con volumi standard. Integrare il supporto comparto inferiore a 15 ng / ml di NGF, pur mantenendo il vano superiore NGF-free.
NOTA: Anche se NGF diffonde in modo efficiente attraverso il filtro e la sua concentrazione in equilibrio entro poche ore, abbiamo osservato che l'applicazione di NGF per il vano inferiore direttamente prima della semina aumenta significativamente il rendimento assonale sul bottom superficie del filtro. - Trasferire i DRG dal tubo ai filtri utilizzando una pipetta di 1.000 pl con una punta tagliata per ingrandire sua apertura.
- Disegnare supporto nella punta 2-3x prima di raccogliere i DRG. Questo impedisce loro di attaccarsi al lato interno della punta. La stessa punta può essere riutilizzato per tutti i pozzetti. L'uso di punte incolore (contro punte blu standard) riduce DRG si attacchi alla superficie punta.
- Per trasferire DRG, impostare la pipetta a 800 ml. Aspirare circa 200 ml di media dal lato superiore del filtro, quindi andare al tubo-DRG e pipetta contenente un piccolo volume su e giù - per risospendere DRG che hanno toccato il fondo. Aspirare l'intero volume e DRG pipette sommergere la punta al centro dell'inserto.
- Una volta che tutti gli inserti sono stati caricati, chiudere il coperchio piatto e agitare la piastra 10x, picchiettando delicatamente sul banco cofano tra ogni ricciolo. Questi movimenti aumentano la resa assonale aiutando espianti DRG lavello eallegare al filtro. Questo aiuta anche a distribuire uniformemente espianti modo che assoni di diversi espianti non si sovrappongano.
NOTA: La procedura semina espianto descritto nei passaggi precedenti aumenta significativamente il tasso globale di attaccamento espianto al substrato (fino al 75%). Più significativamente, la procedura di pipettaggio impedisce prontamente espianti dal galleggiante sulla superficie del supporto invece di affondare al fondo dell'inserto. - Per le analisi biochimiche, DRG seme da un embrione (circa 30) per filtro. Per le analisi morfologiche, utilizzare la metà o un terzo dei DRG da un embrione (10-15). Tale decisione deve essere presa prima di raccogliere i DRG in tubi, in modo che tutti i DRG di un tubo vengono seminate in un singolo bene (se si tratta di 30, 15, o 10 DRG).
- Mantenere culture in un incubatore cella a 37 ° C, a cambiare i media ogni 2-3 giorni. Per cambiare supporto, aspirare il vano superiore per primo, seguito dal comparto inferiore. Aggiungi mezzi freschi in volume standards partendo con il vano inferiore.
NOTA: per evitare cellule / assoni di asciugatura, non cambiare supporto in più di 3 inserti allo stesso tempo. DRG coltivate su filtri in presenza di NGF estenderà assoni lunghi, raggiungendo fino a 2 mm dopo 2 giorni di coltura.
4. Trofico Factor sospensione del trattamento
NGF ritiro induce degenerazione assonale con la frammentazione assonale (determinata dal contrasto di fase e β-III-tubulina IF) che appare prima di circa 12 ore dopo la sospensione. Frammentazione completo si ottiene con 36 hr. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall'utente finale secondo il disegno sperimentale.
- Dopo la assonale fase di estensione di 2 giorni, cambiano i media dai compartimenti superiori e inferiori a media che manca di NGF e contiene anticorpi anti-NGF (1 mg / ml) di sequestrare qualsiasi residuo (o produzione endogena) NGF.
- Piastre Return to incubatore cellulare (37 ° C) per consentireNGF degenerazione ritiro indotto a procedere per il tempo desiderato.
- Procedere alla estrazione delle proteine (fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7).
5. Assonale transezione per indurre degenerazione Walleriana
Questa procedura lascia gli assoni sul lato inferiore del filtro staccati dalla loro corpo cellulare, ma altrimenti intatto. Successivamente, questi assoni rapidamente avviare walleriana degenerazione. Frammentazione assonale (evidenziato dal contrasto di fase o β-III-tubulina IF) appare per la prima da 3 ore dopo resezione; da 9 ore, gli assoni sono completamente frammentati e si staccano dal filtro. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall'utente finale secondo il disegno sperimentale.
- Raschiare il lato superiore del filtro, contenente espianti DRG coltivate, con una cella-raschietto. Assicurare la completa rimozione di materiale superiore spostando raschietto in X, Y e circolareindicazioni.
- Eliminare il supporto dal vano superiore contenente gli espianti galleggianti che sono stati raschiati dal filtro e sostituire con 1 ml di pre-riscaldato, i media DRG completo contenente NGF (10 ng / ml).
- Piastra di ritorno alla cella incubatore (37 ° C) per consentire Wallerian degenerazione procedere per la quantità di tempo scelto dall'utente finale.
- Procedere alla estrazione delle proteine (fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7).
6. Proteine Estrazione di assonale Campioni
- Riempire tubi di raccolta (1,5 ml) con 75 ml di tampone campione Laemmli. Conservare le provette su ghiaccio mentre la raccolta assoni dall'intera serie di filtri.
- Lavare il filtro con espianti DRG in PBS e raschiare il lato superiore del filtro. Rimuovere l'inserto dalla piastra, pulire la superficie superiore del filtro con un applicatore con punta di cotone e aspirare qualsiasi PBS supplementare dai lati superiore e inferiore.
- Posizionare inserto upsidegiù sulla panca e tagliare il filtro dell'inserto con un bisturi affilato. Tenere il filtro con una pinza, bottom-up. Effettuare un taglio dalla circonferenza al centro del filtro con le forbici.
- Inserire filtro sulla parte superiore del tubo di raccolta, e con una pinza, premere il centro del filtro nel tubo. Nel fare questo, un imbuto dovrebbe formare. Spingere il filtro a imbuto al fondo del tubo in modo che sia immerso nel tampone Laemmli.
- Estrazione di proteine complete facendo bollire le provette per 4 min. Rimuovere il filtro con pinze per posizionarlo capovolto nella parte superiore del tubo e l'esecuzione di una breve rotazione (2.000 xg per 15 sec). Eliminare i filtri secchi.
- Risolvere 10 ml di preparazione proteina assonale in un SDS-PAGE seguita da western blot per rilevare le proteine di interesse.
NOTA: Come riferimento, una preparazione assonale da 20 espianti coltivati per 2 giorni e lisati in 100 ml di RIPA Lysis Buffer avrà una concentrazione proteica di 4-6mg / mL.
7. Immunofluorescenza Esame degli assoni su Filtri
Le seguenti operazioni delineano le manipolazioni generali da eseguire se la colorazione su inserti filtranti, esemplificate dal rilevamento di β-III-tubulina. Fixative, tempi di incubazione, le concentrazioni e le altre indicazioni devono essere ottimizzati per altre coppie antigene-anticorpo.
- Utilizzare 6 pozzetti utilizzati in precedenza, accuratamente puliti, per i seguenti lavaggi e incubazione degli inserti.
- Brevemente lavare inserti in PBS. Fissarli in appena preparato 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente su agitatore.
- Dopo fissazione, raschiare e pulire la superficie superiore dell'inserto per raccogliere gli assoni che crescevano esclusivamente sulla superficie inferiore del filtro. Procedere con incubazione standard per IF.
- Incubare inserti in soluzione di blocco (TBS, 0,05% Tween 20, latte scremato 5%), con volumi standard, per 1 ora a RT agitando delicatamente.
- Trasferimento inserti di anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio (anti-β-III-tubulina, 1/5.000), utilizzando volumi standard. Incubare O / N (~ 18 hr) a 4 ° C con un leggero scuotimento.
- Lavare il primo anticorpo due volte in PBS (2 X 10 min a temperatura ambiente).
- Trasferimento inserti di anticorpi secondari fluorescenti coniugato diluito in tampone di bloccaggio (capra anti-topo, 1:2.000), utilizzando volumi standard. Incubare coperto dalla luce per 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente.
- Lavare 3x anticorpo secondario in PBS (3 x 10 min a temperatura ambiente).
- Dopo IF è completo, prendere inserire out, svuotare PBS dall'ultimo lavaggio e pulire il lato superiore del filtro con un applicatore di cotone punta. Aspirare il liquido dai lati superiore e inferiore.
- Luogo inserire capovolta sulla panchina, e tagliare il filtro dell'inserto con un bisturi affilato.
- Tenere il filtro con una pinza, ribasso, e mettere al microscopio diapositiva. Overlay con un vetrino e mou-compatibile fluorescentesupporti nting. Lasciate asciugare piatto in camera fredda, coperto dalla luce. Esaminare e catturare immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.
NOTA: Se conservato a 4 ° C e al riparo dalla luce, questi preparati possono essere conservati per settimane con una perdita minima di fluorescenza. - OPTIONAL: In alternativa, se può essere eseguita su filtri che sono stati rimossi dal dell'inserto. Per fare questo, raschiare e pulire il lato superiore dei filtri direttamente dopo la fissazione.
- Prendere filtri su inserti con un bisturi e filtri Consiglio tagliente assoni-up sul fondo di una piastra sei pozzetti.
- Successivamente, eseguire incubazione per IF come indicato in 7,4-7,8 e 7.11. Il vantaggio di questa alternativa è che risparmia reagenti, poiché, ad esempio, i volumi di incubazione può scendere a 500 microlitri (rispetto ai 3 ml utilizzati a filtri colorati direttamente sugli inserti come mostrato in 7,1-7,11).
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Representative Results
Espianti gangli spinali dei topi E13.5 crescono ampiamente su filtri in sequenza rivestito con poli-D-lisina, laminina e collagene (Figura 1B, a sinistra), arrivando fino a due millimetri entro 2 giorni di coltura. Questa combinazione produce substrato di crescita particolarmente esuberante; altre combinazioni producono assoni che sono notevolmente più brevi (Figura 1B, a destra). Inoltre, DRG mantenuti sui filtri estendere assoni più e più a lungo rispetto DRG coltivate su plastica Figura 1C.
Filtri con pori di 1 micron di diametro, utilizzato in questo protocollo, trattenere corpi cellulari sul lato superiore del filtro, consentendo neuriti di crescere attraverso i pori e si estendono sulla superficie inferiore. Questo è chiaramente dimostrato dalla microscopia in epifluorescenza di filtri colorati per nuclei (DAPI) e β-III-tubulina Figura 1D. In filtri intatti è possibile osservare nuclei cellulari, sia dai neuroni e noncellule neuronali, concentrati nel centro espianto e alcuni irradiante da esso. Tuttavia, quando il lato superiore del filtro è raschiato, nuclei sono andati e solo assoni possono essere rilevati, sul lato inferiore filtri.
Figura 1E mostra un esempio di un fondo del filtro che originariamente sostenuta la crescita di circa 17 espianti. In questo esempio, il lato superiore è stata pulita prima del fissaggio e quindi il segnale di immunofluorescenza rappresenta assoni pure sul lato inferiore del filtro. Estrazione di proteine da preparazioni assonale (lato inferiore del filtro) sono privi di proteine nucleari Figura 1F, dimostrando che la preparazione sia privo di corpi cellulari. In alternativa, quando si lavora con estrazione di RNA, è possibile confermare la purezza della preparazione assonale confrontando la presenza di mRNA differenzialmente localizzati (cioè γ-actina) tra lisati di cellule intere e preparazioni assonale (come dimostrato da altri 5
La potatura di sviluppo dei neuroni sensoriali può essere modellato in filtri sottoposti a trofico fattore deprivazione. Dopo 2-3 giorni di estensione dell'assone in presenza di NGF, il supporto viene modificato in un carente NGF e contenente un anticorpo anti-NGF che sequestrare qualsiasi residuo NGF Figura 2A. Ai punti di tempo desiderati, i filtri vengono elaborati per biochimica o immunocitochimica.
Figura 2B mostra esempi tipici dei lati inferiori dei filtri colorati per β-III-tubulina prima e dopo deprivazione. Dopo 12 ore di deprivazione c'è poco frammentazione assonale, anche se alcuni assoni iniziano a mostrare perline. Tuttavia, la vasta degenerazione assonale è raggiunto dopo 36 di privazione.
Degenerazione Wallerian indotta da assone recisione dei neuroni sensoriali è facilmente modellato in espianti coltivati su filtri raschiando il lato superiore del filtro, lasciando il po distaleincidenza sulle assoni che crescevano sul lato inferiore del filtro Figura 3A. Figura 3B mostra esempi tipici dei lati inferiori dei filtri colorati per β-III-tubulina prima e dopo in-filtro assotomia. A 3 ore dopo assotomia, c'è poco frammentazione, anche se alcuni assoni iniziano a mostrare perline. 7,5 hr, la maggior parte assoni sono frammentati o completamente scomparsi. Pretrattamento di espianti con nicotinammide adenin dinucleotide (NAD +, 5 mM, 30 min pretrattamento) protegge dalla degenerazione Walleriana indotta su filtri, come in altri in vitro e in vivo 19.
Figura 1. Filtra inserti producono grandi quantità di preparati assonale puri. A) Uno schema di un inserto (a), di un inserto in un pozzo (b) e laconfigurazione finale con espianti DRG (c). b) il rivestimento sequenziale di filtri con poli-D-lisina, laminina e collagene risultati in espianti che crescono sempre più lunghi assoni rispetto a quelli coltivati con poli-D-lisina solo o poli-D -lisina e collagene. Le immagini sono state prodotte da piastrelle sovrapposte, immagini a basso ingrandimento utilizzando software di imaging. C) Alle stesse condizioni di rivestimento substrato, espianti DRG mantenuti sui filtri mostrano una crescita assonale considerevolmente più esuberante di espianti coltivati su plastica. D) La preparazione assonale ottenuta mediante raschiatura il lato superiore del filtro è privo di nuclei cellulari. E) Esempio di assoni originati da circa 17 espianti coltivati e sul lato inferiore di un filtro 24 mm. Fino a 30 espianti possono facilmente crescere in queste preparazioni, producendo materiale assonale sufficiente per approcci biochimici comuni. F) Immunoblots di lisati coll ette da cime di filtro rispetto a fondi dimostrano che istone H3, un marcatore nucleare, è limitata alle cime del filtro. Il contenuto totale di proteine è stata normalizzata attraverso i diversi campioni. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Lo studio della degenerazione assonale indotta da ritiro fattore trofico in cartucce filtranti. A) Schema che illustra un tipico esperimento di NGF-privazione. Espianti DRG crescono estese assoni in presenza di NGF e degenerano su NGF privazione. B) Immagini rappresentative a diversi ingrandimenti (5X e 20X obiettivi) di preparati assoni da espianti mantenuti in NGF o privati di NGF per 12 o 36 ore."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Lo studio della Wallerian assonale degenerazione indotta dalla recisione assonale in inserti del filtro. A) Schema che illustra un tipico esperimento assotomia. Axon tranciamento si ottiene raschiando il lato superiore del filtro, lasciando assoni mozzate (privi di corpi cellulari) sul lato inferiore. B) Immagini rappresentative di preparati assoni da espianti intatti o dopo 3 o 7,5 ore dopo transezione in presenza o assenza di 5 mm di NAD +. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Parametri importanti da prendere in considerazione quando si adegua questa tecnica includono la popolazione neuronale che sarà studiato, il substrato, dimensione dei pori del filtro e superficie. Tutti questi parametri avranno un impatto la specificità, la qualità e la quantità della preparazione neurite ottenuto, e deve essere considerato con attenzione da parte dell'utente finale. Negli esempi presentati in questo protocollo, l'uso di neuroni DRG ha il vantaggio di estendere solo assoni, dando così una pura (specifico) preparazione assonale.
Crescita assonale di DRG embrionali è molto veloce rispetto ai neuroni del sistema nervoso centrale, permettendo campioni assonale essere preparati dopo solo 2 giorni di coltura. La dimensione dei pori di 1 micron è dimostrata sufficientemente piccolo da impedire corpi cellulari di migrare in superficie inferiore pur consentendo il passaggio efficiente degli assoni crescenti. Rispetto ai più piccoli formati disponibili (cioè 0,4 micron) ma non impone selettività per assoni sottili.Per lo studio di espianti DRG, l'inserto filtrante 24 mm (per uso in 6 pozzetti piastre) produce una quantità sufficiente di campione proteico assonale per molte tecniche, tra immunoprecipitazione, che spesso richiede una grande quantità di input proteine. Tuttavia, le dimensioni minori (cioè inserti del filtro per piastre da 12 pozzetti) sono adatti per alcune applicazioni, soprattutto se si usa cellule e / o immunocitochimica dissociate.
Sebbene il filtro isola efficacemente neuriti da corpi cellulari di esame, è importante notare che entrambi i compartimenti condividono lo stesso terreno di coltura, limitando le manipolazioni sperimentali ai trattamenti di cellule intere. Altri approcci di isolamento, comprese le Camere Campenot compartimenti o camere di microfluidica, consentono un trattamento differenziato dei vari comparti. Lo sperimentatore deve determinare quale di queste tecniche di isolamento delle cellule-vano è più adatto per il proprio design sperimentale specifico.
Naturalmente, la capacità di isolamento di inserti del filtro può essere vantaggioso oltre degenerazione assonale. Ad esempio, la biochimica di rigenerare coni di crescita può essere facilmentestudiata raschiando il lato inferiore dei filtri con adulti espianti DRG. In poche ore, i neuroni DRG axotomized si rigenerano coni di crescita nella parte inferiore dei filtri che, come descritto in questo protocollo, possono poi essere isolati per la purificazione di proteine rigenerante cono di crescita. Inoltre, i campioni assonale ottenuti con tale metodo possono essere analizzati con metodi biochimici diversi western blotting. Ad esempio, gli assoni possono essere lisate in RIPA o CHAPS buffer di lisi per ottenere un campione di proteine che possono essere ulteriormente sottoposto ad immunoprecipitazione o esperimenti pulldown 9. In alternativa, i campioni assonale possono essere trattati per l'estrazione di RNA, come precedentemente descritto 5.
Il vantaggio del sistema di coltura presentata non è limitato ai neuroni sensoriali. Ad esempio, i neuroni corticali estenderà dendriti e assoni che formeranno sinapsi sul lato inferiore del filtro 7. Così, i campioni neuriti puri (arricchiti con sinapsi) possono essere isolatEd dai corpi cellulari per analisi biochimiche dettagliate dei processi che avvengono esclusivamente in sinapsi. L'uso di questa tecnica è semplice e non ha sospeso passaggi critici. Tuttavia, lunghezza assonale e morfologia è molto sensibile alla qualità del rivestimento dei filtri. Quindi, bisogna fare attenzione ad utilizzare soluzioni di rivestimento freschi e omogenei per la quantità di tempo indicati per ottenere campioni assonale robusti e coerenti. L'utilizzo diffuso di questa tecnica vi aiuterà a progredire la nostra conoscenza della fisiologia degli assoni, in circostanze normali e nella malattia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
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References
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