Introduction
المقصورة محور عصبي من الخلايا العصبية يظهر على درجة كبيرة من الاستقلال الوظيفي من المقصورة-somato شجيري. في الخلايا العصبية الإسقاط، محاور عصبية تحتوي على أكثر من البروتين 1،2 العصبية. اكتسبت دراسة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من المحاور الزخم في المجتمع الأعصاب بسبب وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الخلل في وقت مبكر محور عصبي يبدو أن هناك سمة مشتركة بين الأمراض العصبية والاضطرابات العصبية والنفسية 3. يبدو من المرجح أن فهم أفضل لآليات محور عصبي الحصري في الظروف العادية والمرضية وتسليط الضوء على الأحداث في وقت مبكر التي تدفع ضعف.
يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إدراج ثقافة تحمل غشاء مسامي (فلتر) للحصول على كميات كبيرة من المواد محور عصبي النقي الذي هو مناسبة لالبيوكيميائية ويحلل immunocytochemical. استخدام مرشح إدراج لدراسة البيولوجيا تم تنفيذ محور عصبي أول مرة من قبل ستيوارد و4 الزملاء وتطويرها من قبل تويس وزملاؤه 5 إلى تكوينه الحالي. والتقنية هي الآن في الاستخدام الحالي من قبل الجماعات دراسة جوانب مختلفة من محور عصبي والتغصنات البيولوجيا، مع تعديلات طفيفة في كل حالة لاستيعاب السكان من الخلايا العصبية التي تمت دراستها، وإجراء العلاجات نوع من التحليلات الكيميائية الحيوية المستخدمة 6-9. هذا البروتوكول لا تنوي استيعاب جميع البدائل لمثل هذه مجموعة متنوعة من التطبيقات، وإنما يقدم مقاربة بسيطة التي هي مناسبة لمعظم التطبيقات. على وجه الخصوص، وبروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الطلاء الثلاثي الذي يزيد العائد للمحور عصبي التحليلات البيوكيميائية و هو الأكثر مناسبة لدراسة محور عصبي الطلاء، تنكس الأخرى الموصوفة في الأدبيات تنتج أقل المحاور التي تتراجع وتتدهور بشكل أسرع عند المحرومين من العوامل الغذائية 9.
في هذا الإجراء، لا تزال أجسام الخلايا العصبية معزولة فوق ملحق مرشحالمحاور إيل تمر من خلال المسام وتنمو على طول سطحه السفلي. المحاور النقي (خالية من الملوثات الدبقية والخلايا العصبية خلايا الجسم) التي تنمو على السطح السفلي للمرشح يمكن جمعها عن التحليلات الكيميائية الحيوية أو يمكن ان تكون ثابتة في الموقع وفحصها بواسطة تقنيات immunocytochemical 9. يعتمد الإجراء على استخدام الخلايا العصبية الحسية الجنينية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). وتستخدم على نطاق واسع DRGs الجنينية لدراسة البيولوجيا محور عصبي بسبب neurites التي من هذه الخلايا تخضع لنمو سريع وقوي في المختبر عند الاحتفاظ بها في عامل نمو الأعصاب (NGF)، وبسبب أنها تخضع بسرعة انحطاط عندما يحرم من هذا العامل. أيضا، الخلايا العصبية DRG تفتقر التشعبات، حتى يتسنى لجميع neurites التي تم جمعها بواسطة هذه الطريقة هي محاور عصبية بحتة.
تمثل مرشح إدراج ميزة كبيرة بالمقارنة مع المناهج الأخرى المستخدمة لدراسة محاور عصبية. الدراسات التي تعتمد على استخدام المجهر لتمييز العمليات التي تحدث في الخلية سوما من تلك الموجودة فيتوفير المعلومات xons البيوكيميائية محدودة. وكمثال آخر، ونظم الثقافة مجزأة (على سبيل المثال، غرف Campenot 10 أو الأجهزة ميكروفلويديك 11) مفيدة لنهج التصوير والمعاملة التفضيلية للمقصورات الخلية ولكن لا توفر سوى كميات صغيرة من المواد محور عصبي، مما يحول دون استخدام هذه التقنيات لتحليل الكيمياء الحيوية والتي تتطلب كميات كبيرة نسبيا من العينة. علاوة على ذلك، استخدامها يتطلب تدريبا كبيرا وكذلك الأجهزة المتخصصة، وأنها مضيعة للوقت. مقاربة أخرى غالبا ما تستخدم لعزل المحاور من إإكسبلنتس هو إزالة مركز ازدراع (التي تحتوي على أجسام الخلايا العصبية) يدويا قبل جمع العينات محور عصبي. على الرغم من أن هذا يمكن أن تنتج كميات كبيرة من المستحضرات التخصيب المحور، محاور في هذا المستحضر يمكن يلفها الدبقية وإزالة بسرعة الهيئات 20 ازدراع وعلى التوالي في الفترة من 6 آبار (كمثال على تجربة الحد الأدنى) هو مضيعة للوقت وعلى الحد من جدوى.
في المقابل، فإن الطريقة المعروضة هنا تنتج الاستعدادات محور عصبي وفيرة والنقية التي يمكن بعد ذلك يتم تحليلها من قبل تقريبا أي أسلوب البيوكيميائية التي يشيع استخدامها لتحليل لست] خلية كاملة، مثل لطخة غربية، 6 مناعي، لطخة الشمالية 5 6 مطياف الكتلة، وتنقية الحمض النووي الريبي 7،12،13، من بين آخرين. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول يمكن تطبيقها على التألق المناعي (IF) التقنيات، كما أنه من الممكن لإصلاح المحاور نموا في الجانب السفلي من مرشح لمزيد من دراستها من قبل IF. هذا النهج يسهل كثيرا من عمليات تحليل محور عصبي محددة حيث لا توجد أجسام الخلايا في الإعداد النهائي. هذا هو ميزة كبيرة منذ إشارة مناعي عالية من أجسام الخلايا غالبا ما يقوض فحص وتحليل إشارة أضعف منشؤها من الهياكل رقيقة مثل محاور عصبية.
تطبيقين من الأسلوب الثقافة لدراسة محور عصبي تنكس عه وصفها؛ نموذج للتشذيب التنموية ونموذجا للانحطاط الناجم عن الإصابة (يشار إلى انحطاط ولري ع). ويستند نمذجة تشذيب التنموية على حقيقة أن الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي المنافسة للحد من كميات المشتقة من الهدف NGF وتلك فشله في الحصول على دعم كاف عصبية المنحطة 14. يمكن تحاكي هذه الظاهرة في الثقافات DRG الجنينية من خلال سحب NGF من وسائل الإعلام والثقافة، والتي، كما يحدث في الجسم الحي، يبدأ تنكس محور عصبي تليها تدمير خلايا الجسم. لنموذج الضمور ولري، يتم كشط الجانب العلوي من التصفية مع الهيئات الخلية بعيدا. المحاور التي نمت على الجانب السفلي من مرشح انفصلوا جسديا من أجسام الخلايا والخضوع بعد ذلك عملية التنكسية السريع والنمطية المعروفة باسم ولري الضمور 15، سميت A. الر الذين ذكرت أول هذه الظاهرة في عام 1850 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الإجراءات التالية وفقا للمبادئ التوجيهية التي وافق عليها المجلس الكندي للرعاية الحيوان. يتم بذل كافة الجهود لتقليل الألم والضيق من الحيوانات أثناء الإجراءات.
1. طلاء من الفلاتر
ملاحظة: عندما توضع إدراج مرشح الثقافة في الآبار لوحات متعددة جيدا، وتعرف اثنين من مقصورات: مقصورة الأعلى هو المنطقة فوق إدراج ومقصورة القول هي أقل من واحد في إدراج الشكل 1A.ab. هي المصنفة إإكسبلنتس في مقصورة كبار حيث نعلق على الجانب العلوي من مرشح؛ العديد من المحاور تنمو من خلال تصفية وتوسيع على الجانب السفلي من مرشح، داخل حجرة أسفل الشكل 1A.c. مجلدات العمل القياسية (أي لتطبيق حل طلاء، ويغسل، وسائل الإعلام والثقافة، وغيرها) هي 2 مل لمقصورة السفلي و 1 مل لمقصورة العلوية وستكون المشار إليها في البروتوكول بأنه "؛ وحدات التخزين القياسية ". إضافة الحلول بدءا من حجرة أسفل عن طريق وضع غيض من ماصة في الفجوة بين إدراج وجانب البئر. أيضا، إمالة إدراج إلى جانب واحد في حين الاستغناء الحل لمنع الفقاعات من الوقوع على الجزء السفلي من مرشح.
- بدء طلاء المرشحات في اليوم قبل الطلاء. تحت غطاء محرك السيارة الأنسجة الثقافة العقيمة، ووضع 24 ملم إدراج مرشح في لوحة تلقي 6 جيدا. احتضان إدراج مع بولي-D-يسين في الماء (1 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة على RT باستخدام وحدات التخزين القياسية: 2 مل في حجرة أسفل و 1 مل في القمة.
- نضح بولي-D-يسين وشطف مرة واحدة مع الماء. نضح المياه، إغلاق الغطاء ويترك لوحات لتجف في غطاء محرك السيارة O / N. خلال تطلع السوائل، للتأكد من إزالة بقايا السائل الذي يصبح محاصرين مباشرة تحت التصفية.
- في صباح اليوم التالي، وتمييع laminin في الماء (10 ميكروغرام / مل)، ومزيج دافئ عند 37 درجة مئوية. احتضان إدراج مع laminin 1 ساعة في سلل حاضنة عند 37 درجة مئوية، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية.
- laminin نضح وإضافة الكولاجين في الماء (0.1 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. في هذه الحالة استخدام 2 مل لمقصورة السفلي و 2 مل لمقصورة أعلى.
- الكولاجين نضح ويغسل مرة واحدة مع الماء المعقم. المرشحات هي الآن جاهزة لاستقبال وسائل الإعلام والثقافة، وإإكسبلنتس DRG، كما هو موضح في الخطوة 3.
2. تشريح الجنينية ظهري الجذر العقدة (DRG) إإكسبلنتس
- تخدير ماوس الإناث الحوامل 13 يوما عن طريق الحقن IP من آفيرتين (250 ملغ / كلغ). الانتظار 10-15 دقيقة والتحقق من عدم وجود ردة فعل الانسحاب القرنية ودواسة. ردود الفعل مرة واحدة غائبة، نفذ خلع عنق الرحم.
- تطهير جميع الأدوات الجراحية والبطن الإناث مع الايثانول 70٪. تسمح الأدوات لتجف. عقد جلد البطن وقطع طريق الجلد والعضلات لفضح طبقات تجويف البطن.
- إزالة الرحم عن طريق فصل من عنق الرحم والمبايض. في STERIلو هود، وإزالة الأجنة من الرحم مع مقص وجمعها في طبق بتري مليئة سائل الإعلام L15 الجليد الباردة. الحفاظ على الجليد.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى التقارير الفنية السابقة لمزيد من التفاصيل حول كيفية الحصول على أجنة من 13 يوما من الحمل 17،18. - تحت المجهر، ووضع الجنين على الجانب واستخدام مقص الربيع صغيرة لإزالة الرأس. إجراء شق على طول الجانبين الجانبي لتجاهل الصدر والبطن والأطراف والذيل. الحفاظ على الجزء الخلفي الذي يحتوي على العمود الفقري، ووضع الجانب بطني حتى وإزالة كافة أجهزة الحشوية.
- مع مقص الربيع الصغيرة، وفضح الحبل الشوكي بأكمله عن طريق قطع العمود الفقري من الجانب بطني على طول خط الوسط. عقد الذبيحة أسفل مع زوج واحد من ملقط (# 3) واستخدام الزوج الثاني لعقد الحبل الشوكي عن طريق الجانب الأكثر منقاري.
- ببطء وبلطف سحب الحبل بعيدا عن تجويف الفقري وقرصة قبالة DRGs من الحبل الشوكي باستخدام ملقط رقيقة جدا (# 5). مجموعة DRGs التي سيتم جمعها علىالجزء السفلي من الطبق.
- جمع DRGs تجميعها بواسطة الشفط مع 200 ميكرولتر ماصة التي تم قطع لتكبير افتتاحه. وضع DRGs في أنبوب وترك على الجليد حتى يتم الانتهاء من جمع DRG.
ملاحظة: يفضل الأبيض / نصائح شفافة لأن DRGs لا تلتصق على جدران هذا غيض (بالمقارنة مع نصائح الأصفر قياسي). نصائح التنظيف مع وسائل الاعلام قبل الاستخدام مزيد يمنع DRGs من التمسك جدرانه.
3. البذر وصيانة الظهرية جذر العقدة إإكسبلنتس على الفلاتر
- إضافة كاملة سائل الإعلام DRG عند 37 درجة مئوية لإدراج المغلفة باستخدام وحدات التخزين القياسية. تكملة وسائل الإعلام حجرة أسفل مع 15 نانوغرام / مل من نيسان الخليج، مع الحفاظ على أعلى مجانا مقصورة نيسان الخليج.
ملاحظة: على الرغم من NGF ينشر بكفاءة عبر تصفية وتركيزه equilibrates في غضون ساعات، لاحظنا أن تطبيق NGF إلى حجرة أسفل مباشرة قبل البذر يزيد بشكل ملحوظ العائد على محور عصبي بسطح ottom للمرشح. - نقل DRGs من الأنبوب إلى الفلاتر باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000 مع تلميح قلص لتكبير افتتاحه.
- رسم وسائل الاعلام الى طرف 2-3X قبل جمع DRGs. هذا يمنعهم من التمسك الجانب الداخلي من غيض. يمكن نفس غيض إعادة استخدامها لجميع الآبار. استخدام نصائح بغير لون (مقابل نصائح الأزرق قياسي) يقلل DRG العالقة إلى السطح غيض.
- لنقل DRGs، تعيين ماصة 800 ميكرولتر. نضح ما يقرب من 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام من الجانب العلوي من التصفية، ثم انتقل إلى أنبوب يحتوي على DRG وماصة حجم صغير صعودا وهبوطا - ل resuspend DRGs التي غرقت إلى أسفل. نضح حجم كله وDRGs ماصة غمر طرف في منتصف إدراج.
- مرة واحدة يتم تحميل كل إدراج، إغلاق الغطاء ودوامة لوحة لوحة 10X، والتنصت برفق على مقاعد البدلاء هود بين كل دوامة. هذه الحركات زيادة الغلة محور عصبي من خلال مساعدة إإكسبلنتس DRG تغرق ونعلق على التصفية. ويساعد هذا أيضا توزيع إإكسبلنتس بالتساوي بحيث محاور مختلفة من إإكسبلنتس لا تتداخل.
ملاحظة: الإجراء البذر ازدراع موضح في الخطوات السابقة يزيد بشكل كبير من المعدل العام للمرفق ازدراع إلى الركيزة (تصل إلى 75٪). الأهم من ذلك الإجراء pipetting ليمنع بسهولة إإكسبلنتس من تطفو على سطح سائل الاعلام بدلا من الغرق في قاع إدراج. - لتحليل الكيمياء الحيوية، وDRGs البذور من جنين واحد (حوالي 30) لكل مرشح. لالتحليلات المورفولوجية، استخدم إما نصف أو ثلث DRGs من جنين واحد (10-15). يجب أن يتم هذا القرار قبل جمع DRGs في أنابيب، بحيث يتم المصنفة جميع DRGs من أنبوب في بئر واحدة (سواء كانت 30، 15، أو 10 DRGs).
- الحفاظ على الثقافات في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. لتغيير وسائل الإعلام، ونضح المقصورة العليا الأولى، تليها حجرة أسفل. إضافة وسائط جديدة في حجم قياسيليالي بدءا من حجرة أسفل.
ملاحظة: لمنع الخلايا / محاور من التجفيف، لا تتغير وسائل الإعلام في أكثر من 3 إدراج في نفس الوقت. سوف DRGs نمت على المرشحات في حضور NGF تمديد محاور طويلة، تصل إلى 2 ملم بعد 2 أيام في الثقافة.
4. التغذية عامل سحب العلاج
NGF انسحاب يدفع تنكس محور عصبي مع تجزئة محور عصبي (يحدده الطوري وβ-III-تويولين IF) التي تظهر أولا حوالي 12 ساعة بعد الانسحاب. ويتحقق تجزئة كاملة بنسبة 36 ساعة. متى يتم ترك انحطاط المضي قدما لأن يتم اختياره من قبل المستخدم النهائي وفقا لتصميم التجريبية.
- بعد مرحلة تمديد محور عصبي 2 يوما، وتغيير وسائل الاعلام من المقصورات العلوية والسفلية إلى وسائل الإعلام التي تفتقر إلى NGF ويحتوي على أجسام مضادة لمكافحة NGF (1 ميكروغرام / مل) لعزل أي المتبقية (أو المنتجة التطور الطبيعي) NGF.
- العودة إلى الحاضنة لوحات خلية (37 درجة مئوية) للسماحNGF انحطاط الناجم عن الانسحاب والمضي قدما لمبلغ من الوقت المطلوب.
- الشروع في استخراج البروتين (الخطوة 6) للفحص من قبل لطخة غربية أو فحص مباشرة المرشحات التي كتبها IF (الخطوة 7).
5. محور عصبي Transection للحث على ولري البقعي
يترك هذا الإجراء محاور على الجانب السفلي من مرشح منفصل عن جسم الخلية، ولكن حالها خلاف ذلك. بعد ذلك، وهذه المحاور الشروع بسرعة ولري انحطاط. تجزئة محور عصبي (يتضح من مرحلة التباين أو β-III-تويولين IF) يبدو للوهلة الأولى بنسبة 3 ساعة بعد transection؛ قبل 9 ساعة، محاور مجزأة تماما وبعيدة عن التصفية. متى يتم ترك انحطاط المضي قدما لأن يتم اختياره من قبل المستخدم النهائي وفقا لتصميم التجريبية.
- كشط الجانب العلوي من التصفية، التي تحتوي على إإكسبلنتس DRG نمت، مع خلية مكشطة. ضمان إزالة كاملة من مواد أعلى عن طريق تحريك مكشطة في X، Y والتعميمالاتجاهات.
- تجاهل وسائل الإعلام من المقصورة التي تحتوي على أعلى لل explants العائمة التي تم كشط من مرشح واستبدالها مع 1 مل من قبل حرارة، واستكمال وسائل الإعلام التي تحتوي على DRG NGF (10 نانوغرام / مل).
- العودة إلى الخلية الحاضنة لوحة (37 درجة مئوية) للسماح ولري الضمور المضي قدما لمقدار الوقت الذي يختاره المستخدم النهائي.
- الشروع في استخراج البروتين (الخطوة 6) للفحص من قبل لطخة غربية أو فحص مباشرة المرشحات التي كتبها IF (الخطوة 7).
6. استخراج البروتين من العينات محور عصبي
- ملء أنابيب جمع (1.5 مل) مع 75 ميكرولتر من عينة Laemmli العازلة. إبقاء الأنابيب على الجليد بينما حصاد محاور عصبية من مجموعة كاملة من الفلاتر.
- غسل فلتر مع إإكسبلنتس DRG في برنامج تلفزيوني وكشط الجانب العلوي من التصفية. إزالة إدراج من لوحة، وتنظيف الجانب العلوي من التصفية مع قضيب من القطن طرف ونضح أي برنامج تلفزيوني إضافية من الجانبين العلوي والسفلي.
- وضع إدراج رأسا على عقبحملة على مقاعد البدلاء وقطع مرشح للخروج من إدراج باستخدام مشرط حاد. اضغط على فلتر مع ملقط، من أسفل إلى أعلى. اجراء خفض من محيط إلى مركز للتصفية مع مقص.
- مكان مرشح على رأس أنبوب جمع، ومع ملقط، اضغط وسط مرشح أسفل الأنبوب. في حين القيام بذلك، ينبغي أن تشكل القمع. دفع مرشح على شكل قمع في الجزء السفلي من الأنبوب بحيث يتم غمرها في عينة العازلة Laemmli.
- استخراج البروتين الكامل من الغليان الأنابيب لمدة 4 دقائق. إزالة عامل التصفية باستخدام ملقط وضعه رأسا على عقب في الجزء العلوي من الأنبوب وأداء تدور قصيرة (2،000 x ج لمدة 15 ثانية). تجاهل مرشحات المجففة.
- حل 10 ميكرولتر من إعداد البروتين محور عصبي في SDS-PAGE تليها طخة غربية للكشف عن البروتينات المثيرة للاهتمام.
ملاحظة: كما مرجعا، وإعداد محور عصبي من 20 إإكسبلنتس نمت لمدة 2 أيام و lysed في 100 ميكرولتر من العازلة RIPA تحلل وسوف يكون تركيز البروتين من 4-6ميكروغرام / ميكرولتر.
7. فحص المناعي من محاور عصبية على الفلاتر
توضح الخطوات التالية التلاعب العام لأداء IF تلطيخ على إدراج مرشح، والتي تجسدت في الكشف عن β-III-تويولين. تثبيتي، وأوقات الحضانة، وتركيزات وتفاصيل أخرى ينبغي أن يكون الأمثل للأزواج أخرى ضد مستضد.
- الاستفادة المستخدمة سابقا 6 لوحات جيدة، وتنظيفها جيدا، ليغسل وحضانات التالية للتدرج.
- لفترة وجيزة غسل إدراج في برنامج تلفزيوني. اصلاحها في الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT على شاكر.
- بعد التثبيت، كشط وتنظيف الجانب العلوي من إدراج لجمع المحاور التي نمت بشكل حصري على السطح السفلي من التصفية. المضي قدما في حضانات القياسية لIF.
- احتضان إدراج في عرقلة الحل (TBS، 0.05٪ توين 20، 5٪ الحليب الخالي من الدسم)، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية، لمدة 1 ساعة على RT مع الهز لطيف.
- نقل إدراج إلى الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة العازلة (مكافحة β-III-تويولين، 1:5،000)، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية. احتضان O / N (~ 18 ساعة) في 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
- يغسل الجسم المضاد الأول مرتين في برنامج تلفزيوني (2 X 10 دقيقة في RT).
- نقل إدراج إلى الأجسام المضادة الثانوية فلوري، مترافق المخفف في عرقلة العازلة (الماعز المضادة للماوس، 1:2،000)، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية. احتضان تغطيتها من الضوء لمدة 2 ساعة على RT مع الهز لطيف.
- غسل 3X الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني (3 × 10 دقيقة في RT).
- بعد IF كاملة، واتخاذ إدراج الخروج، صب بعيدا PBS من غسل وتنظيف مشاركة الجانب العلوي من التصفية مع قضيب من القطن طرف. نضح أي السائل من الجانبين العلوي والسفلي.
- مكان إدراج رأسا على عقب على مقاعد البدلاء، وقطع مرشح للخروج من إدراج مع مشرط حاد.
- اضغط على فلتر مع ملقط، حتى الهبوط، ووضع على شريحة المجهر. تراكب مع ساترة ومذكرة التفاهم الفلورسنت المتوافقةnting سائل الإعلام. دعونا شقة الجافة في غرفة باردة، تغطيتها من الضوء. فحص والتقاط الصور باستخدام المجهر الفلورسنت.
ملاحظة: عند تخزينها في 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء، وهذه الاستعدادات يمكن أن تظل لأسابيع مع فقدان الحد الادنى من مضان. - اختياري: بدلا من ذلك، إذا لا يمكن أن يؤديها على الفلاتر التي تم إزالتها من إدراج. للقيام بذلك، كشط وتنظيف الجانب العلوي من المرشحات مباشرة بعد التثبيت.
- تأخذ المرشحات للخروج من إدراج مع مشرط حاد ومكان مرشحات محاور المتابعة على الجزء السفلي من لوحة ستة جيدا.
- بعد ذلك، نفذ حضانات لIF كما هو مبين في 7،4-7،8 و7.11. ميزة هذا البديل هو أنه يوفر الكواشف، منذ ذلك الحين، على سبيل المثال، يمكن أن أحجام الحضانة تنخفض إلى 500 ميكرولتر (بالمقارنة مع 3 مل تستخدم عندما يتم ملطخة المرشحات مباشرة على إدراج كما هو مبين في 7،1 حتي 7،11).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إإكسبلنتس العقدة الجذرية الظهرية من الفئران E13.5 تنمو على نطاق واسع على مرشحات بالتتابع المغلفة مع بولي-D-يسين، laminin والكولاجين (الشكل 1B، يسار)، تصل إلى 2 ملم في غضون 2 أيام في الثقافة. هذا المزيج الركيزة ينتج نمو مندفعا بشكل خاص؛ مجموعات أخرى تسفر المحاور التي هي أقصر بكثير (الشكل 1B، يمين). علاوة على ذلك، DRGs الحفاظ على مرشحات تمتد أكثر وأطول من المحاور DRGs نمت على الشكل 1C البلاستيك.
المرشحات مع المسام من 1 ميكرون في القطر، والمستخدمة في هذا البروتوكول، في الحفاظ على أجسام الخلايا على الجانب العلوي من التصفية، بينما يسمح neurites التي تنمو من خلال المسام وتمتد على السطح السفلي. ويظهر هذا بوضوح من خلال المجهر epifluorescence من المرشحات الملون للنوى (دابي) وβ-III-تويولين 1D الشكل. في المرشحات سليمة فمن الممكن لمراقبة نواة الخلية، وكلاهما من الخلايا العصبية وغيرالخلايا العصبية، وتتركز في وسط ازدراع وبعض تشعيع منه. ومع ذلك، عندما يتم كشط الجانب العلوي من التصفية، نوى هي ذهبت وفقط يمكن الكشف عن محاور عصبية، وعلى الجانب السفلي المرشحات.
ويبين الشكل 1E مثالا لأسفل التصفية الذي أصيب أصلا نمو حوالي 17 إإكسبلنتس. في هذا المثال، تم تنظيف الجانب العلوي قبل التثبيت، وبالتالي فإن إشارة مناعي تمثل محاور الخالص على الجانب السفلي من التصفية. استخراج البروتين من الاستعدادات محور عصبي (الجانب السفلي من فلتر) خالية من البروتينات النووية الشكل 1F، مما يدل على أن إعداد خال من أجسام الخلايا. بدلا من ذلك، عند العمل مع استخراج الحمض النووي الريبي، فمن الممكن لتأكيد نقاء إعداد محور عصبي من خلال مقارنة وجود mRNAs والمترجمة تفاضلي (أي γ-الأكتين) بين لست] خلية كاملة والاستعدادات محور عصبي (كما هو موضح من قبل الآخرين 5
تشذيب التنموية من الخلايا العصبية الحسية يمكن أن تكون على غرار مرشحات في تعرض للحرمان عامل التغذية. بعد 2-3 أيام من تمديد محوار في وجود NGF، يتم تغيير وسائل الإعلام إلى واحدة تفتقر NGF ويحتوي على الأجسام المضادة لمكافحة NGF التي من شأنها تنحية أي المتبقية NGF الشكل 2A. في نقطة الوقت المطلوب، وتتم معالجة مرشحات لالكيمياء الحيوية أو كيمياء سيتولوجية مناعية.
الرقم 2B يبين أمثلة نموذجية من الجانبين السفلي من المرشحات الملون لβ-III-تويولين قبل وبعد الحرمان. بعد 12 ساعة من الحرمان هناك القليل تجزئة محور عصبي، على الرغم من بعض محاور بدء اظهار الديكور. ومع ذلك، ويتحقق تنكس محور عصبي واسعة بعد 36 من الحرمان.
تنكس اليرياني الناجمة عن محوار transection من الخلايا العصبية الحسية وعلى غرار بسهولة في إإكسبلنتس نمت على المرشحات عن طريق كشط الجانب العلوي من التصفية، تاركا وراءه بو القاصيrtion من المحاور التي نمت على الجانب السفلي من الشكل 3A مرشح. ويبين الشكل 3B أمثلة نموذجية من الجانبين السفلي من المرشحات الملون لβ-III-تويولين قبل وبعد axotomy في التصفية. في 3 ساعة بعد axotomy، هناك تجزئة قليلا، على الرغم من أن بعض محاور بدء اظهار الديكور. بنسبة 7.5 ساعة، ومعظم محاور مجزأة أو اختفت تماما. المعالجة من إإكسبلنتس مع ثنائي النوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد (NAD +، 5 ملي، 30 دقيقة المعالجة) يحمي من انحطاط ولري يسببها على مرشحات، كما هو الحال في غيرها من في المختبر والمجراة في نماذج 19.
الشكل 1. إدراج تصفية إنتاج كميات كبيرة من المستحضرات محور عصبي محض. أ) مخطط لإدراج (أ)، من إدراج في بئر (ب) والتكوين النهائي مع إإكسبلنتس DRG (ج). B) طلاء متتابعة من المرشحات مع بولي-D-يسين، laminin الكولاجين والنتائج في إإكسبلنتس التي تنمو أكثر وأطول محاور مقارنة مع تلك التي نمت مع بولي-D-يسين حدها أو بولي-D يسين والكولاجين. تم إنتاج الصور عن طريق تبليط متداخلة، صور منخفضة التكبير باستخدام برامج التصوير. C) تحت نفس الظروف الركيزة طلاء، إإكسبلنتس DRG الحفاظ على مرشحات تظهر نمو محور عصبي إلى حد كبير أكثر مندفعا من إإكسبلنتس نمت على البلاستيك. د) إعداد محور عصبي الحصول عليها عن طريق كشط الجانب العلوي من مرشح يخلو من نواة الخلية. E) مثال من المحاور التي نشأت من حوالي 17 إإكسبلنتس ونمت على الجانب السفلي من 24 ملم التصفية. يمكن أن تصل إلى 30 إإكسبلنتس تنمو بسهولة في هذه الاستعدادات، مما أسفر عن محور عصبي ما يكفي من المواد لنهج البيوكيميائية المشتركة. F) من Immunoblots لست] كول ected من قمم قيعان مرشح مقابل إثبات أن H3 هيستون، علامة النووي، يقتصر على قمم التصفية. تم تطبيع مجموع محتوى البروتين في عينات مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. دراسة تنكس محور عصبي الناجم عن الانسحاب عامل التغذية في إدراج التصفية. أ) مخطط يوضح تجربة NGF الحرمان نموذجية. إإكسبلنتس DRG تنمو محاور واسعة في وجود NGF، وتتحول إلى NGF الحرمان. B) وصور الممثل في تكبير مختلفة (5X 20X والأهداف) الاستعدادات محور عصبي من إإكسبلنتس المحافظة في نيسان الخليج أو المحرومين من NGF لمدة 12 أو 36 ساعة."https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" الهدف = "_blank"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. دراسة تنكس محور عصبي ولري الناجمة عن transection محور عصبي في إدراج التصفية. أ) مخطط يوضح تجربة axotomy نموذجية. ويتحقق محوار فك عن طريق كشط الجانب العلوي من مرشح، وترك المحاور قطعت (خالية من أجسام الخلايا) على الجانب السفلي. B) وصور الممثل الاستعدادات محور عصبي من إإكسبلنتس سليمة أو بعد 3 أو 7.5 ساعة بعد transection في وجود أو غياب من 5 ملم من NAD +. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتشمل المعلمات المهم أن تأخذ في الاعتبار عند التكيف مع هذه التقنية السكان العصبية التي سيتم دراستها، الركيزة، حجم المسام من مرشح ومساحة السطح. وجميع هذه المعلمات يؤثر على خصوصية ونوعية وكمية من إعداد محوار تم الحصول عليها، ويجب أن تدرس بعناية من قبل المستخدم النهائي. في الأمثلة الواردة في هذا البروتوكول، واستخدام الخلايا العصبية DRG لديه ميزة تمديد المحاور فقط، وبالتالي إعطاء النقي (محددة) إعداد المحاور.
نمو محور عصبي من DRGs الجنينية سريع جدا بالمقارنة مع الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي، مما يسمح للعينات محور عصبي أن تكون مستعدة بعد أيام فقط 2 في الثقافة. وقد ثبت حجم المسام من 1 ميكرومتر صغيرة بما فيه الكفاية لمنع الهيئات خلية من الهجرة إلى السطح السفلي بينما يسمح بمرور كفاءة من محاور النمو. مقارنة أحجام أصغر المتاحة (أي 0.4 ميكرون) لا تفرض الانتقائية للمحاور عصبية رقيقة. لدراسة إإكسبلنتس DRG، مرشح 24 مم إدراج (للاستخدام في 6 آبار لوحات) تنتج كميات كافية من البروتين عينة محور عصبي لمعظم التقنيات، بما في ذلك مناعي، والتي غالبا ما يتطلب كمية كبيرة من مدخلات البروتين. ومع ذلك، وأحجام أصغر (أي إدراج مرشح لوحات 12 أيضا) هي مناسبة لبعض التطبيقات، خاصة إذا باستخدام خلايا فصلها و / أو مناعية.
على الرغم من أن إدراج مرشح يعزل neurites التي من أجسام الخلايا بكفاءة للفحص، من المهم أن نلاحظ أن كلا من المقصورات تشترك في نفس وسائل الإعلام والثقافة، والحد من التلاعب التجريبية للعلاجات خلية كاملة. نهج العزلة الأخرى، بما في ذلك غرف Campenot مجزأة أو دوائر ميكروفلويديك، والسماح للمعاملة تفضيلية من مقصورات مختلفة. المجرب يجب تحديد أي من هذه التقنيات عزل خلايا مقصورة هي الأكثر ملائمة لتصميم التجارب الخاصة بها.
= "jove_content"> طرق بديلة للحصول على عينات معشوقة محور عصبي محض تشمل نظم ثقافة مجزأة مثل غرف Campenot أو الأجهزة ميكروفلويديك أو إزالة يدويا مركز ازدراع (التي تحتوي على أجسام الخلايا العصبية). توفير مناهج مجزأة سوى كميات صغيرة من المواد المحاور. استخدامها يتطلب تدريبا كبيرا وكذلك الأجهزة المتخصصة، وأنها مضيعة للوقت. من ناحية أخرى، وإزالة مركز ازدراع للحصول على عينات محور عصبي المخصب أمر غير عملي، يتطلب خبرة ويقتصر على السكان العصبية التي يمكن زراعتها كما إإكسبلنتس. في المقابل، فإن الطريقة المعروضة هنا تنتج الاستعدادات محور عصبي وفيرة ونقية، هو سريع و لا يتطلب تدريبا مكثفا. قبل كل شيء، فإنه يمكن أيضا أن يؤديها مع الخلايا العصبية فصلها.
بطبيعة الحال، فإن القدرة على عزل إدراج مرشح يمكن أن يكون مفيدا وراء تنكس محور عصبي. على سبيل المثال، الكيمياء الحيوية من تجديد مخاريط النمو يمكن أن يكون بسهولةدرس عن طريق كشط الجانب السفلي من المرشحات مع إإكسبلنتس DRG نمت. في غضون ساعات، والخلايا العصبية DRG axotomized تجديد مخاريط النمو في الجانب السفلي من الفلاتر التي، كما هو موضح في هذا البروتوكول، ويمكن بعد ذلك أن تكون معزولة لتنقية تجديد نمو البروتينات مخروط. وعلاوة على ذلك، فإن العينات التي حصل عليها محور عصبي هذه الطريقة يمكن تحليلها بالطرق البيوكيميائية غير النشاف الغربية. على سبيل المثال، محاور عصبية يمكن هي lysed في المعهد الملكي أو CHAPS مخازن تحلل للحصول على عينة البروتين الذي يمكن أن يتعرض لمزيد من التجارب مناعي أو المنسدلة 9. بدلا من ذلك، عينات محور عصبي يمكن معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي، كما هو موضح سابقا 5.
الاستفادة من نظام الثقافة المقدمة لا يقتصر على الخلايا العصبية الحسية. على سبيل المثال، سوف الخلايا العصبية القشرية تمديد التشعبات والمحاور التي سوف تشكل نقاط الاشتباك العصبي على الجانب السفلي من التصفية 7. وبالتالي، وعينات محوار النقي (المخصب مع نقاط الاشتباك العصبي) يمكن isolatإد من أجسام الخلايا للتحليلات مفصلة للعمليات الكيميائية الحيوية التي تجري حصرا في نقاط الاشتباك العصبي. استخدام هذه التقنية بسيطة وليس لديه الخطوات الحاسمة المعلقة. ومع ذلك، طول محور عصبي والتشكل حساس جدا لنوعية الطلاء من المرشحات. وبالتالي، لا بد من الحرص على استخدام حلول الطلاء الطازجة ومتجانسة للالمبالغ المشار إليها من الوقت للحصول على عينات محور عصبي قوي وثابت. فإن الاستخدام الواسع لهذه التقنية تساعد في دفع معرفتنا علم وظائف الأعضاء من المحاور، في ظل الظروف العادية والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
