Introduction
Den aksonal rum af neuroner, viser en stor grad af funktionel uafhængighed af somato-dendritiske rum. I projektion neuroner axoner indeholder det meste af den neuronale protein 1,2. Studiet af fysiologi og patofysiologi af axoner har vundet momentum i neurovidenskab samfund, fordi de seneste undersøgelser har vist, at tidlig axonal dysfunktion synes at være et fælles træk ved neurodegenerative sygdomme og neuropsykiatriske lidelser 3. Det forekommer sandsynligt, at en bedre forståelse af axonale-eksklusiv mekanismer under normale og patologiske tilstande vil kaste lys over de tidlige hændelser, der driver dysfunktion.
Den nuværende protokol beskriver, hvordan kultur indsætter bærer en porøs membran (filter) for at opnå store mængder af ren axonal materiale, der er egnet til biokemiske og immunocytokemiske analyser. Brugen af Filterindsatserne at studere aksonal biologi blev først gennemført af Steward ogkolleger 4 og yderligere udviklet af Twiss og kolleger 5 til dens nuværende konfiguration. Teknikken er nu i brug af grupper, der studerer forskellige aspekter af aksonal og dendritceller biologi, med mindre ændringer i hvert tilfælde til at rumme for populationen af neuroner studeret, de udførte behandlinger og typen af biokemiske analyser anvendte 6-9. Den nuværende protokol har ikke til hensigt at rumme alle de alternativer til sådan en bred vifte af applikationer, men snarere give en enkel tilgang, der er velegnet til de fleste anvendelser. Især protokollen beskrevet her bruger en tredobbelt belægning, der maksimerer axonal udbytte biokemiske analyser og er bedst egnet til at studere axonale degeneration-andre belægninger, der er beskrevet i litteraturen producerede færre axoner, der oprulles og udarte hurtigere, når frataget fra trofiske 9 faktorer.
I denne fremgangsmåde forbliver nervecellelegemer isoleret oven på filtrer while axoner passere gennem porerne og vokse langs dens bundflade. Pure axoner (gratis glia og neuronale celle krop forureninger), der vokser på undersiden af filteret kan indsamles til biokemiske analyser eller kan fastgøres på stedet og undersøgt af immuncytokemiske teknikker 9. Fremgangsmåden bygger på anvendelsen af embryonale sensoriske neuroner fra den dorsale rodganglie (DRG). Embryonale DRG er almindeligt anvendt til at studere axonal biologi fordi neuritter fra disse celler undergår hurtig og robust vækst in vitro, når fastholdt i nervevækstfaktor (NGF), og fordi de hurtigt undergår degeneration, når frataget denne faktor. Også DRG neuroner mangler dendritter, så alle neurites indsamlet af denne metode er rent axoner.
Filterindsatserne repræsenterer en stor fordel i forhold til andre tilgange, der anvendes til at studere axoner. Undersøgelser, der kræver anvendelse af mikroskopi for at differentiere processer forekommer i cellen soma fra dem i enXON'er giver begrænset biokemisk information. Som et andet eksempel opdelte kultur systemer (f.eks Campenot kamre 10 eller mikrofluidenheder 11) er nyttige for billedteknik og differentieret behandling af celle rum, men giver kun små mængder af axonal materiale, hvilket udelukker brugen af disse teknikker til biokemiske analyser, som kræver relativt store mængder prøve. Yderligere, deres anvendelse kræver betydelig træning samt specialiserede enheder, og de er tidskrævende. En anden tilgang, der ofte bruges til at isolere axoner fra explanter er manuelt at fjerne en explant center (indeholdende nervecellelegemer) før axonal prøvetagning. Selv om dette kan producere store mængder af Axon-berigede præparater, kan axoner i dette præparat være indhyllet i glia og hurtigt fjerne 20 eksplantatkulturer organer fortløbende 6 brønde (som et eksempel på en minimal eksperiment) er tidskrævende og på grænsen af gennemførlighed.
I modsætning hertil metode præsenteres her producerer rigelige og rene axonale præparater, som derefter kan analyseres ved næsten enhver biokemisk teknik, der er almindeligt anvendt til at analysere helcellelysater som western blot, immunfældning 6, northern blot 5 massespektrometri 6, RNA oprensning 7,12,13, blandt andre. Desuden kan protokollen anvendes på immunfluorescens (IF)-teknikker, som det er muligt at fastsætte axoner vokser i bunden af filteret til yderligere at undersøge dem ved IF. Denne fremgangsmåde letter i høj grad analysen af axonal-specifikke processer, da der ikke er nogen cellelegemer i det endelige præparat. Dette er en betydelig fordel, da en høj immunofluorescent signal fra cellelegemer underminerer ofte undersøgelse og analyse af en svagere signal, der stammer fra tynde strukturer såsom axoner.
To anvendelser af kulturen metode til at studere aksonal degeneration are beskrevet; en model af udviklingsmæssig beskæring og en model af skade-induceret degeneration (almindeligvis kaldet Wallerian degeneration). Modellering af udviklingsmæssige beskæring er baseret på det faktum, at sensoriske neuroner in vivo konkurrere om at begrænse mængden af mål-afledt NGF og dem ikke at modtage nok neurotrof støtte degenereret 14. Dette fænomen kan efterlignes i embryoniske DRG-kulturer ved at trække NGF fra dyrkningsmediet, der, som sker in vivo, initierer axonal degenerering efterfulgt af celledestruktion krop. For at modellere Wallerian degeneration, er oversiden af filteret med cellelegemer skrabet væk. Axoner, der var dyrket på bunden af filteret bliver fysisk adskilt fra cellelegemerne og derefter underkastes en hurtig og stereotyp degenerative proces kendt som Wallerian degeneration 15, opkaldt efter A. Waller, som først rapporteret fænomenet i 1850 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: De følgende procedurer er i overensstemmelse med retningslinjer godkendt af den canadiske Rådet for Animal Care. Gøres alle bestræbelser på at mindske smerter og angst af dyr under procedurer.
1.. Coating af filtre
BEMÆRK: Når kulturen filterindsatse er placeret i brønde i multi-brøndplader, to rum defineret: øverste rum er området over indsatsen og nederste rum er den nedenfor indsatsen Figur 1A.ab. Eksplantater udsås i den øverste segment, hvor de tillægger oversiden af filteret; mange axoner vokse gennem filteret og strækker sig på undersiden af filteret, inden den nederste rum Figur 1A.c. Standarden arbejder mængder (dvs. for anvendelse belægning løsning, vasker, kultur medier, osv.) er 2 ml til bunden rum og 1 ml til øverste rum og kommer til at blive henvist til i protokollen som "Standardmæssige mængder ". Tilføj løsninger starter med den nederste rum ved at placere spidsen af pipetten i mellemrummet mellem indsatsen og den side af brønden. Også vippe indsatsen til den ene side, mens dispensering af løsning for at forhindre boblerne i at blive fanget i bunden af filteret.
- Begynd belægning filtrene dagen før plating. Under sterile vævskultur hætte, placeres 24 mm filterindsatse i en 6-brønds modtagende plade. Inkuber skær med poly-D-lysin i vand (1 mg / ml) i 1 time ved stuetemperatur under anvendelse af standard mængder: 2 ml i den nederste rum og 1 ml i toppen.
- Aspirer poly-D-lysin og skylles en gang med vand. Aspirere vand, luk låget, og pladerne henstår til tørre i hætten O / N. Under aspiration af væsker, så sørg for at fjerne en rest af væske, der bliver fanget direkte under filtret.
- Den næste morgen, fortyndes laminin i vand (10 ug / ml), blandes og varm ved 37 ° C. Inkuber indstik med laminin 1 time i cell inkubator ved 37 ° C, ved anvendelse af standard mængder.
- Aspirer laminin og tilføj kollagen i vand (0,1 mg / ml) og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. I dette tilfælde bruge 2 ml til bunden rum og 2 ml til øverste rum.
- Aspirer kollagen og vaskes en gang med sterilt vand. Filtrene er nu klar til at modtage dyrkningsmedier og DRG-eksplantater som beskrevet i trin 3.
2.. Dissecting Embryonale Dorsalrodsganglieceller (DRG) Eksplantater
- Bedøver en 13-dages gravid hunmus med en IP-injektion af Avertin (250 mg / kg). Vent 10-15 min og tjek for mangel på hornhinde og pedal tilbagetrækning reflekser. Når reflekser er fraværende, udføre halsdislokation.
- Desinficere alle kirurgiske instrumenter og kvindelige underliv med 70% ethanol. Tillad instrumenter tørre. Hold maveskindet og skære gennem huden og muskellag for at eksponere den abdominale kavitet.
- Fjerne livmoderen ved at afmontere fra livmoderhalsen og æggestokke. I en Sterile hætte, flytte embryoner fra livmoderen med en saks og samle dem i en petriskål fyldt med iskoldt L15 medier. Hold på is.
BEMÆRK: Se foregående tekniske rapporter for yderligere oplysninger om, hvordan du får embryoner på 13 dage af drægtighedsperioden 17,18. - Under mikroskopet lå embryonet på en side og bruge små spring saks til at fjerne hovedet. Lav et snit langs de laterale sider til at skille sig af med brystet, maven, lemmer og hale. Hold ryggen indeholder rygsøjlen, lå ventrale side op og fjerne alle indre organer.
- Med små spring saks, udsættes hele rygmarven ved at skære rygsøjlen fra dens ventrale side langs midterlinien. Hold kroppen ned med en tang (# 3) og bruge et andet par til at holde rygmarven ved sin mest rostrale aspekt.
- Træk langsomt og forsigtigt ledningen væk fra rygsøjlen hulrum og knibe off DRG fra rygmarven ved hjælp af ultra-tynde pincet (# 5). Gruppe af DRG skal indsamles påbunden af skålen.
- Saml grupperet DRG ved at aspirere med en 200 ul pipettespids der er blevet skåret at udvide sin åbning. Placer DRG i et rør og efterlade på is, indtil DRG kollektionen er færdig.
BEMÆRK: Hvid / transparent tips er at foretrække, fordi DRG ikke holde sig til væggene i dette tip (i forhold til standard gule spidser). Flushing tips med medier før brug forhindrer yderligere DRG klistrer til dets mure.
3.. Seeding og Vedligeholdelse af Dorsalrodsganglieceller Eksplantater om filtre
- Læg komplet DRG medier ved 37 ° C til de coatede inserter under anvendelse af standard mængder. Supplement bundkammeret medier med 15 ng / ml NGF, samtidig med at den øverste rum NGF-fri.
BEMÆRK: Selvom NGF diffunderer effektivt over filteret og dets koncentration i ligevægt inden for timer, har vi observeret, at anvendelsen af NGF til bunden rum direkte før såning øger axonal afkast på bottom overflade af filteret. - Overfør DRG fra røret til filtrene ved hjælp af en 1.000 gl pipette med en spids trimmet at udvide sin åbning.
- Tegn medier i spidsen 2-3x før indsamling af DRG. Dette forhindrer dem i at klæbe til den indvendige side af spidsen. Det samme spids kan genbruges til alle brønde. Brugen af ufarvede tips (versus standard blå tips) reducerer DRG stikning til spidsen overflade.
- For at overføre DRG indstille pipetten på 800 ul. Aspirer cirka 200 ul medier fra oversiden af filteret, og derefter gå til DRG-holdige rør og afpipetteres en lille volumen op og ned - at resuspendere DRG, der er sunket til bunds. Aspirer hele volumen og pipette DRG nedsænke spidsen i midten af indsatsen.
- Når alle indsatser er indlæst, luk plade låg og slyng pladen 10x, trykke det forsigtigt på kølerhjelmen bænken mellem hver hvirvel. Disse bevægelser øge axonal udbytte ved at hjælpe DRG-eksplantater vask ogtillægger filteret. Dette hjælper også distribuere explanter jævnt, så axoner fra forskellige eksplantater ikke overlapper hinanden.
BEMÆRK: explant seeding, der er beskrevet i de foregående trin øger den generelle forekomst af eksplantation fastgørelse til underlaget (op til 75%). Mest markant, pipetteringer let forhindrer eksplanteret fra variabel på medierne overfladen i stedet for at synke til bunden af indsatsen. - For biokemiske analyser, frø DRG fra et embryo (omkring 30) pr filter. For morfologiske analyser, enten bruge halvdelen eller en tredjedel af de DRG fra et embryo (10-15). Denne beslutning skal foretages, inden indsamling af DRG i rør, så alle DRG i et rør udsås i en enkelt brønd (uanset om det er 30, 15 eller 10 DRG).
- Oprethold kulturer i en celle inkubator ved 37 ° C, skiftende medier hver 2-3 dage. For at ændre medier, aspireres øverste rum først, efterfulgt af den nederste kammer. Tilføj friske medier i standard volumens begyndende med den nederste kammer.
BEMÆRK: For at forhindre celler / axoner fra tørring, ændrer ikke medier i mere end 3 indsatser på samme tid. DRG dyrkes på filtre i nærvær af NGF vil udvide lange axoner, og nåede op til 2 mm efter 2 dage i kultur.
4.. Trofisk Factor Afvænning
NGF tilbagetrækning inducerer axonal degeneration med axonal fragmentering (bestemt ved fasekontrast og β-III-tubulin IF), der først vises rundt 12 timer efter tilbagetrækning. Komplet fragmentering opnås ved 36 timer. Hvor længe degeneration er overladt til at fortsætte i skal vælges af slutbrugeren i henhold til det eksperimentelle design.
- Efter 2 dages axonal forlængelsesfasen ændre medier fra øverste og nederste rum til medier, der mangler NGF og indeholder anti-NGF-antistoffer (1 ug / ml) til at udskille resterende (eller endogent produceret) NGF.
- Retur plader til celle inkubator (37 ° C) for at tilladeNGF-tilbagetrækning-induceret degeneration forløbe i det ønskede tidsrum.
- Fortsæt til proteinekstraktion (trin 6) til undersøgelse ved western blot eller direkte undersøge filtrene ved IF (trin 7).
5.. Aksonale transection at fremkalde Wallerian Degeneration
Proceduren giver axoner på bunden af filteret løsrevet fra deres celle kroppen, men ellers intakt. Derefter disse axoner hurtigt indlede Wallerian degeneration. Axonal fragmentering (dokumenteret ved fasekontrast eller β-III-tubulin IF) optræder første gang med 3 timer efter transektion; med 9 timer, axoner er helt fragmenteret og løsrevet fra filteret. Hvor længe degeneration er overladt til at fortsætte i skal vælges af slutbrugeren i henhold til det eksperimentelle design.
- Skrabe oversiden af filteret, som indeholder dyrkede DRG eksplantater med en celle-skraber. Sikre fuldstændig fjernelse af top materiale ved at flytte skraber i X-, Y-og cirkulærretninger.
- Kassér medier fra den øverste rum, der indeholder de flydende eksplantater, der er skrabet fra filteret og erstatte med 1 ml forvarmet, komplet DRG medier indeholdende NGF (10 ng / ml).
- Retur plade til celle inkubator (37 ° C) for at tillade Wallerian degeneration forløbe i mængden af tid, valgt af slutbrugeren.
- Fortsæt til proteinekstraktion (trin 6) til undersøgelse ved western blot eller direkte undersøge filtrene ved IF (trin 7).
6.. Protein Udvinding af axonale Prøver
- Fyld opsamlingsrør (1,5 ml) med 75 pi af Laemmli prøvebuffer. Hold rør på is, mens høst axoner fra det samlede sæt af filtre.
- Vask filteret med DRG-eksplantater i PBS og skrabes oversiden af filteret. Fjern indsatsen fra pladen, rengøre oversiden af filteret med en bomulds-spids applikator opsuges ekstra PBS fra de øverste og nederste sider.
- Placer insert upsidened på bænken og skæres filteret ud af indsatsen ved hjælp af en skarp skalpel. Hold filteret med en pincet, nedefra og op. Lave et snit fra periferien til midten af filteret med en saks.
- Placer filteret på toppen af indsamling rør, og med en pincet, skal du trykke på midten af filteret ned i røret. Mens du gør dette, bør en tragt form. Skub tragtformede filter på bunden af røret, således at den er nedsænket i Laemmli-prøvebuffer.
- Komplet protein udvinding ved kogning af rør til 4 min. Fjern filteret ved hjælp af pincet til at placere den på hovedet ned i toppen af røret og udføre en kort centrifugering (2.000 x g i 15 sek.) Kassér de tørrede filtre.
- Resolve 10 ul af axon protein præparat i en SDS-PAGE efterfulgt af western blot at påvise proteiner af interesse.
BEMÆRK: Som reference en axonale forberedelse fra 20 explanter dyrkes for 2 dage og lyseret i 100 ul RIPA-lysepuffer vil have en proteinkoncentration på 4-6pg / pl.
7.. Immunfluorescens Undersøgelse af Axoner om filtre
De følgende trin beskriver de generelle manipulationer at udføre, hvis farvning på Filterindsatserne, eksemplificeret ved påvisning af β-III-tubulin. Fiksativ bør inkubationstider, koncentrationer og andre angivelser være optimeret til andre antigen-antistof par.
- Udnyt tidligere anvendte 6-godt plader, grundigt rengjort, for følgende vasker og inkuberinger af skær.
- Kortvarigt vaske indstik i PBS. Fix dem i frisklavet 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min ved RT på shaker.
- Efter fiksering skrabe og rengør oversiden af indsatsen for at indsamle de axoner, der voksede udelukkende på den nederste overflade af filteret. Fortsæt med standard inkuberinger til IF.
- Inkuber skær i blokerende opløsning (TBS, 0,05% Tween 20, 5% skummetmælk), under anvendelse af standard mængder, i 1 time ved stuetemperatur med forsigtig rystning.
- Overførsel indsætter primær antistof fortyndet i blokeringsbuffer (anti-β-III-tubulin, 1:5000) ved anvendelse af standard mængder. Inkuber O / N (~ 18 timer) ved 4 ° C med forsigtig omrystning.
- Vask det første antistof to gange i PBS (2 x 10 minutter ved stuetemperatur).
- Overførsel indsætter fluorescerende-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet i blokeringsbuffer (gede-anti-mus, 1:2000) ved anvendelse af standard mængder. Inkuber dækkes af lys i 2 timer ved stuetemperatur med forsigtig rystning.
- Vask det sekundære antistof 3x i PBS (3 x 10 minutter ved stuetemperatur).
- Når IF er færdig, tage indsatsen ud, hæld væk PBS fra den sidste vask og rens oversiden af filteret med en bomulds-spids applikator. Aspirer enhver væske fra de øverste og nederste sider.
- Sted indsætte på hovedet på bænken, og skære filteret ud af indsatsen med en skarp skalpel.
- Hold filteret med en pincet, nedadrettede op, og læg på mikroskopi dias. Overlay med et dækglas og fluorescerende-kompatible mounting medier. Lad tørre fladt i kølerum, dækket mod lys. Undersøge og tage billeder ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.
BEMÆRK: Når opbevares ved 4 ° C og beskyttet mod lys, kan disse præparater opbevares i uger med minimalt tab af fluorescens. - VALGFRIT: Alternativt IF kan udføres på filtre, der er blevet fjernet fra indsatsen. At gøre det, skrabe og rense oversiden af filtrene direkte efter fiksering.
- Tag filtrene ud af indsatserne med en skarp skalpel og placere filtrene axoner op på bunden af en seks-brønds plade.
- Bagefter udføre inkubationerne for IF som angivet i 7,4-7,8 og 7.11. Fordelen ved dette alternativ er, at det sparer reagenser, da for eksempel kan inkubations mængder gå ned til 500 pi (i forhold til de 3 ml anvendes, når filtrene er direkte farves på skær som vist i 7,1-7,11).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dorsalrodsganglieceller eksplanteret fra E13.5 mus vokse udførligt om filtre belagt sekventielt med poly-D-lysin, laminin og kollagen (figur 1B, til venstre), og nåede op til 2 mm inden for 2 dage i kultur. Dette substrat kombination giver særligt sprudlende vækst; andre kombinationer giver axoner, der er betydeligt kortere (figur 1B, højre). Desuden DRG vedligeholdes på filtre udvide flere og længere axoner end DRG dyrket på plast figur 1C.
Filtre med porer på 1 um i diameter, anvendes i denne protokol, bevarer cellelegemer på oversiden af filteret, samtidig med at neuritter at vokse gennem porerne og strækker sig på den nederste overflade. Dette fremgår klart af epifluorescens-mikroskopi af filtre farvet for kerner (DAPI) og β-III-tubulin Figur 1D. I intakte filtre er det muligt at observere cellekerner fra både neuroner og ikke-neuronale celler, koncentreret i eksplantatet midten og nogle bestråling fra det. Men når oversiden af filteret er skrabet, kerner er væk og kun axoner kan påvises på filtrene bunden.
Figur 1E viser et eksempel på et filter i bunden, der oprindeligt vedvarende vækst af cirka 17 eksplantater. I dette eksempel blev topsiden rengøres før fiksering og derfor immunofluorescerende signal repræsenterer rene axoner på bunden af filteret. Protein ekstraktion fra axonale præparater (nederst side af filteret) er blottet for nukleare proteiner figur 1F, viser, at præparatet er fri for celle organer. Alternativt, når der arbejdes med RNA-ekstraktion, er det muligt at bekræfte renheden af axonal fremstilling ved sammenligning af forekomsten af differentielt lokaliserede mRNA'er (dvs. γ-actin) mellem hel-cellelysater og aksonal præparater (som vist ved andre 5
Developmental beskæring af sensoriske neuroner kan modelleres i filtre udsat for trofisk faktor afsavn. Efter 2-3 dages Axon udvidelse i nærvær af NGF mediet ændret til en manglende NGF og indeholdende et anti-NGF-antistof, der vil udskille resterende NGF figur 2A. På de ønskede tidspunkter, er filtre behandles til biokemi eller immuncytokemi.
Figur 2B viser typiske eksempler på nederste sider af filtre farvet for β-III-tubulin før og efter berøvelse. Efter 12 timer af afsavn der er lidt axonale fragmentering, selv om nogle axoner begynde at vise beading. Dog er omfattende axonal degeneration opnås efter 36 afsavn.
Wallerian degeneration induceret af axon overskæring af sensoriske neuroner let modelleret i eksplantater dyrket på filtre ved at skrabe oversiden af filteret, efterlader den distale portion af axoner, der voksede på bunden af filteret figur 3A. 3B viser typiske eksempler på nederste sider af filtre farvet for β-III-tubulin før og efter i-filter axotomi. På 3 timer efter axotomi, der er lidt fragmentering, selv om nogle axoner begynde at vise beading. Med 7,5 timer, er de fleste axoner fragmenteret eller helt væk. Forbehandling af eksplantater med nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD +, 5 mM, 30 min forbehandling) beskytter fra Wallerian degeneration induceret på filtre, som det gør i andre in vitro og in vivo modeller 19.
Figur 1. Filterindsatse producerer store mængder af rene axonale præparater. A) Et skema for en indsats (a), af en indsats i en brønd (b), ogendelige konfiguration med DRG-eksplantater (c). B) Den sekventielle belægning af filtre med poly-D-lysin, laminin og kollagen resulterer i eksplantater, der vokser mere og længere axoner i forhold til dem, der dyrkes med poly-D-lysin alene eller poly-D -lysin og kollagen. Billederne blev produceret af fliser overlappende, lav forstørrelse billeder ved hjælp af imaging software. C) Under samme substrat belægning betingelser, DRG explanter vedligeholdes på filtre viser betydeligt mere overstrømmende axonal vækst end eksplantaterne dyrket på plast. D) Den aksonal præparat opnået ved at skrabe oversiden af filteret er blottet for cellekerner. E) Eksempel på axoner, der stammer fra cirka 17 eksplantater og dyrket på bunden af en 24 mm filter. Så meget som 30 explanter let kan vokse i disse forberedelser, hvilket giver nok axonal materiale til almindelige biokemiske metoder. F) immunoblotter af lysater coll ected fra filter toppe versus bunde viser, at histon H3, en nuklear markør, er begrænset til de filter toppe. Det totale proteinindhold var normaliseret på tværs af de forskellige prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Studiet af axonal degeneration induceret af trofisk tilbagetrækning faktor i filterindsatse. A) Schema skitserer et typisk NGF-afsavn eksperiment. DRG-eksplantater vokse omfattende axoner i overværelse af NGF, og udarte på NGF afsavn. B) Repræsentative billeder ved forskellige forstørrelser (5x og 20x mål) af axonale præparater fra explanter vedligeholdes i NGF eller berøvet NGF i 12 eller 36 timer."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Studiet af Wallerian axonal degeneration induceret af axon transection i filterindsatse. A) Schema skitserer et typisk axotomi eksperiment. Axon adskillelse opnås ved at skrabe oversiden af filteret, forlader overskårne axoner (blottet for cellelegemer) på bunden. B) Repræsentative billeder af aksonal præparater fra intakte eksplantater eller efter 3 eller 7,5 timer efter overskæring i nærvær eller fravær af 5 mM NAD +. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vigtige parametre at tage hensyn til ved at tilpasse denne teknik omfatter neuronale befolkning, der vil blive undersøgt, underlaget, porestørrelse af filteret og areal. Alle disse parametre vil påvirke specificitet, kvaliteten og mængden af det neurite forberedelse fremstillet, og skal overvejes nøje af slutbrugeren. I eksemplerne i denne protokol, brug af DRG neuroner har den fordel af at udvide kun axoner, hvilket giver en ren (specifik) axonal forberedelse.
Aksonal vækst af embryonale DRG er meget hurtig i forhold til neuroner fra centralnervesystemet, så axonale prøver, der skal udarbejdes efter kun 2 dage i kultur. Porestørrelsen af 1 um har vist sig tilstrækkelig lille til at forhindre cellelegemer migrere ind i den nederste overflade, samtidig med at en effektiv passage af voksende axoner. I forhold til mindre størrelser til rådighed (dvs. 0,4 mikrometer) det ikke pålægge selektivitet for tynde axoner.Til undersøgelse af DRG-eksplantater, 24 mm filterindsatsen (til brug i 6-brøndsplader) producerer tilstrækkelige mængder af axonal protein prøve for de fleste teknikker, inklusive immunopræcipitation, som ofte kræver en stor mængde protein input. Men mindre størrelser (dvs. Filterindsatserne 12-brønds plader) er egnet til nogle programmer, især hvis du bruger dissocierede celler og / eller immuncytokemi.
Selv filterindsatsen effektivt isolerer neurites fra celle organer til undersøgelse, er det vigtigt at bemærke, at begge rum deler den samme kultur medier, hvilket begrænser de eksperimentelle manipulationer hel-celle behandlinger. Andre isolation tilgange, herunder opdelte Campenot kamre eller mikrofluide kamre, giver mulighed for en differentieret behandling af de forskellige rum. Forsøgslederen skal afgøre, hvilke af disse celle-rum isolationsteknikker er mest egnet til deres egen specifikke eksperimenterende design.
Selvfølgelig kan isolation evne filterindsatse være fordelagtigt ud axonal degeneration. For eksempel kan biokemi regenerere vækstkegler letundersøgt ved at skrabe bunden af filtre med voksne DRG-eksplantater. Inden for få timer vil axotomized DRG neuroner regenerere vækstkegler i bunden af de filtre, som beskrevet i denne protokol, kan derefter isoleres til rensning af regenererende vækst kegle proteiner. Desuden kan axonale prøver opnået ved denne metode analyseres ved andre end western blotting biokemiske metoder. For eksempel kan axoner lyseres i RIPA eller CHAPS lysis buffere for at opnå en proteinprøve, der kan underkastes yderligere immunpræcipitation eller pulldown forsøg 9. Alternativt kan axonale prøver behandles til RNA-ekstraktion, som tidligere beskrevet 5.
Fordelen dyrkningssystemet præsenteres er ikke begrænset til sensoriske neuroner. For eksempel vil corticalneuroner udvide dendritter og axoner, der danner synapser på bunden af filteret 7. Således kan rene neuritlængder prøver (beriget med synapser) blive isolated fra cellelegemerne til detaljerede biokemiske analyser af processer, der udelukkende foregår i synapser. Anvendelsen af denne teknik er enkel og har ingen udestående kritiske trin. Men axonal længde og morfologi er ganske følsom over for kvaliteten af coatingen af filtre. Derfor skal man passe på at bruge friske og homogene coating løsninger til de angivne mængder af tid til at få robuste og konsistente axonale prøver. Den udbredte anvendelse af denne teknik vil medvirke til at fremme vores viden om fysiologi axoner, under normale omstændigheder, og i sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
