Introduction
신경 세포의 축삭 구획 somato-돌기 실에서 기능적 독립의 큰 정도를 보여줍니다. 투사 뉴런의 축삭은 신경 세포의 단백질 1,2의 대부분을 포함하고 있습니다. 최근의 연구는 초기 축삭 장애는 신경 퇴행성 질환 및 신경 정신 장애 3의 공통적 인 특징이 나타납니다 것으로 나타났습니다 때문에 축삭의 생리와 병리 생리학의 연구 결과는 신경 과학 사회에서 힘을 얻고있다. 그것은 정상 및 병적 인 조건에서 축삭 독점 메커니즘에 대한 이해가 장애를 구동 초기 이벤트에 빛을 발산 할 것으로 보인다.
이 의정서는 생화학에 적합하며 면역 세포 화학 분석 순수 축삭 물질의 많은 양을 얻기 위해 다공성 막 (필터) 베어링 문화 삽입물을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 필터의 사용은 축삭 생물학 처음 스튜 워드에 의해 구현 된 공부를 삽입하고또한 현재의 구성에 Twiss의 동료 (5)에 의해 개발 된 동료 4. 기술은 연구 뉴런의 인구를 수용하는 각각의 경우에 약간의 수정과 함께, 축삭과 수상 돌기 생물학의 다양한 측면을 연구 그룹에 의해 현재 사용중인 지금, 수행먼트와 생화학 적 분석의 유형 6-9을 사용했다. 본 프로토콜은 응용 프로그램 같은 다양한 모든 대안을 수용 할 생각입니다 만, 오히려 대부분의 응용 프로그램에 적합한 간단한 방법을 제공하지 않습니다. 특히, 여기에서 설명하는 프로토콜은 철회 및 영양 요인 9 박탈 때 더 빨리 퇴화 적은 축삭을 생산 생화학 적 분석에 대한 축삭의 수율을 극대화하고, 문헌에 기술 된 축삭 변성 - 다른 코팅을 공부하기에 최적 인 트리플 코팅을 사용합니다.
이 과정에서 신경 세포 기관은 필터 WH 꼭대기에 고립 된 상태로 유지일의 축색 돌기가 모공을 통과 및 바닥면을 따라 성장한다. 필터의 저면에 성장 (아교 및 신경 세포체 오염물) 순수한 축삭 생화학 분석을 위해 수집하거나 반응계에서 고정 및 면역 세포 화학 기법 (9)에 의해 조사 될 수있다. 절차는 후근 신경절 (DRG)에서 배아 감각 뉴런의 사용에 의존한다. 이 요인을 박탈 때 빠르게 퇴보를 받아야하기 때문에 배아 개의 DRG 널리 신경 성장 인자 (NGF)에 유지하면 이들 세포에서 신경 돌기는 체외에서 빠르고 강력한 성장을 받아야하기 때문에 축삭 생물학을 연구하는 데 사용하고있다. 이 방법에 의해 수집 된 모든 신경 돌기가 순수 축삭 수 있도록 또한, DRG의 신경 세포는 수상 돌기 부족합니다.
필터 삽입은 축삭을 연구하는 데 다른 방법에 비해 큰 이점을 나타냅니다. 프로세스 에서와는 셀 소마에서 발생 차별화 현미경의 사용에 의존 연구xons 제한 생화학 적 정보를 제공합니다. 다른 예로서, 구획화 배양 시스템 (예 Campenot 챔버 (10) 또는 미세 유동 장치 (11))은 촬상 방법 및 세포 구획 차동 치료에 유용하지만 필요 생화학 적 분석에 대한 이러한 기술의 사용을 배제, 축삭 물질의 소량 만 제공 샘플의 비교적 다량. 또한, 자신의 사용은 중요한 교육뿐만 아니라 전문 장비를 필요로하고, 그들은 시간이 소요됩니다. 종종 이식편에서 축삭을 분리하는 데 사용하는 또 다른 방법은 수동 축삭 시료 채취 전에 (신경 세포의 세포체 함유) 이식편 센터를 제거하는 것이다. 이 축삭 농축 제제의 대량 생산 할 수 있지만,이 준비 축삭이 아교에 싸여 빠르게 (최소 실험의 예를 들어) 6 우물에서 연속 20 이식편의 몸을 제거 할 수있는 시간이 오래 걸릴하고 가능성의 한계에.
대조적으로, 여기에 제시된 방법은 서양 얼룩, 면역 6, 북부 오점 5 질량 분석 6, RNA 정화와 같은 일반적으로 전체 세포 용 해물을 분석하는 데 사용되는 거의 모든 생화학 적 기법에 의해 분석 될 수있다 풍부하고 순수 축삭 준비를 생산 7,12,13, 다른 사람의 사이에서. 또한, 프로토콜은 상기 IF에서이를 검사하는 필터의 바닥 측에서 성장하는 축삭을 고정 할 수있는 한, (IF)를 면역 형광 기법에 적용될 수있다. 제공된 세포체는 최종 준비가 없기 때문에이 접근법은 크게 축삭 특정 프로세스의 분석을 용이하게한다. 세포 기관에서 높은 면역 신호가 자주 검사와 같은 축삭 얇은 구조에서 발생하는 약한 신호의 분석을 저해하기 때문에 이것은 큰 장점이다.
축삭 변성 AR을 연구하는 배양 방법의 두 가지 응용 프로그램전자 기술; 발달 전정 부상 유도 퇴화 모델의 모델 (통상 Wallerian 변성 함). 발달 전정의 모델링은 생체 내 감각 뉴런 타겟 유래 NGF의 양 및 충분한 신경성지지 축퇴 (14)를 수신하지 못하고 그 제한에 대해 경쟁한다는 사실에 근거한다. 이 현상은 생체 내에서 일어나는로서, 균체 파괴 다음에 축삭 변성을 시작, 배양 배지에서 NGF를 철수하여 배아 DRG의 문화에서 모방 할 수 있습니다. Wallerian 변성을 모델링하기 위해, 균체와 함께 필터의 상부 측이 긁어된다. 물리적으로 균체로부터 분리 한 후, 제 1850 16 현상을보고 A. 월러 따서 Wallerian 변성 (15)로서 알려진 신속하고 진부한 퇴행성 과정을 거칠되어 필터의 바닥 측 상에 성장한 축삭.
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Protocol
참고 : 다음 절차는 동물 보호의 캐나다 협의회의 승인 지침에 따라 수 있습니다. 모든 노력이 과정에서 고통과 동물의 고통을 최소화 할 수 있습니다.
필터 1. 코팅
참고 : 문화 필터 삽입이 멀티 웰 플레이트의 우물에 배치하는 경우, 두 개의 구획이 정의되어있다 : 최고 구획은 삽입 위의 지역이며, 아래 칸은 삽입 그림 1A.ab 아래의 하나입니다. 이식편들은 필터의 상부 측에 부착 상부 구획에 시딩; 많은 축삭은 필터를 통해 성장하고 하부 격실도 1A.c 이내에, 필터의 하부 측에 연장되어있다. (즉, 코팅 용액, 액체, 배양액 등을인가하는) 표준 작업 볼륨은 하부 구획 2 ㎖ 및 상부 구획 대 1 ㎖이며 "로 프로토콜로 지칭 될 예정; 표준 볼륨 ". 삽입 및 웰의 측면 사이의 간극에 피펫 팁을 배치하여 하부 격실로 시작 솔루션을 추가. 필터의 하단에 갇히는 기포를 방지하는 용액을 분배하면서 또, 한쪽으로 기울 인서트.
- 필터 도금 전날 코팅 시작합니다. 무균 조직 문화 후드에서 6 잘받는 판에 24mm 필터 삽입을 배치합니다. 맨 아래 칸에 2 ㎖ 및 상단에 1 ㎖ : 표준 볼륨을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 물에 폴리-D-라이신 (1 ㎎ / ㎖)로 삽입을 품어.
- 기음 폴리-D-라이신과 물에 한 번 씻어. 대기음 물, 뚜껑을 닫고 후드 O / N.에 건조 플레이트를 남겨 액체를 흡입하는 동안, 직접 필터 아래에 갇혀되어 액체의 잔재를 제거해야합니다.
- 다음 날 아침, 물에 라미닌 (10 ㎍ / ml)에 희석 혼합 따뜻한 37 ℃에서 CEL에 1 시간을 라미닌으로 삽입을 품어표준 볼륨을 사용하여 37 ° C에서 L 인큐베이터.
- 기음 라미닌 물에 콜라겐 (0.1 ㎎ / ㎖)을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 이 경우 최고 구획을위한 바닥 구획을위한 2 ㎖ 및 2 ㎖를 사용합니다.
- 기음 콜라겐과 멸균 물에 한 번 씻는다. STEP 3에서 설명한 바와 같이 필터 해주기 배양 배지 및 DRG 이식편을 수신 할 준비가되어있다.
2. 해부 배아 배근 신경절 (DRG)의 Explants
- 에버 틴 (250 ㎎ / ㎏)의 IP 주입하여 13 일간의 임신 여성 마우스를 마취. 10 ~ 15 분을 기다린 후 각막 및 페달 철수 반사의 부족을 확인합니다. 반사 신경이 결석하면, 자궁 전위를 수행합니다.
- 70 % 에탄올로 모든 수술기구와 여성의 복부를 소독. 악기를 건조하도록 허용합니다. 복부의 피부를 잡고 복강을 노출 피부와 근육 레이어를 잘라.
- 자궁 경부와 난소에서 분리하여 자궁을 제거합니다. steri에서르 후드, 가위로 자궁에서 배아를 제거하고 얼음처럼 차가운 L15 매체로 가득 페트리 접시에 그들을 수집합니다. 얼음에 보관하십시오.
참고 : 임신 17, 18 13 일 배아를 얻는 방법에 대한 자세한 내용은 이전의 기술 보고서를 참조하십시오. - 현미경, 옆에있는 배아를 놓고 머리를 제거하는 작은 봄 가위를 사용합니다. 측면을 따라 절개 가슴, 배, 사지와 꼬리를 취소 할 수 있습니다. 모든 내장 기관을 복부 측면을 놓고 제거, 척추가 들어있는 백을 유지합니다.
- 작은 봄 가위, 정중선을 따라 복부 측면에서 척추를 절단하여 전체 척수를 노출합니다. 집게 일쌍 (# 3)와 함께 시체를 누른 상태에서 가장 주동이의 측면에 의해 척수를 개최하는 두 번째 쌍을 사용합니다.
- 천천히 그리고 부드럽게 떨어져 척추 공동의 코드를 뽑아 초박형 집게 (# 5)를 이용하여 척수 개의 DRG를 꼬집어. 그룹 개의 DRG를 수집 할접시의 바닥.
- 의 개방을 확대 절단 된 200 μL 피펫 팁과 흡입에 의해 그룹화 개의 DRG를 수집합니다. 튜브 개의 DRG를 놓고 DRG 수집이 완료 될 때까지 얼음에 둡니다.
참고 : 개의 DRG이 팁의 벽에 붙어 있지 않기 때문에 (표준 노란색 팁에 비해) 화이트 / 투명 팁이 바람직하다. 미디어 플러싱 팁을 사용하기 전에 더 이상의 벽에 달라 붙는 개의 DRG를 방지 할 수 있습니다.
필터 3. 시드와 배근 신경절 외식 유지
- 표준 볼륨을 사용하여 코팅 인서트에 37 ° C에서 전체 DRG 미디어를 추가합니다. NGF가없는 최고 구획을 유지하면서, NGF의 15 겨 / ㎖로 바닥 구획 미디어를 보충합니다.
참고 : NGF 효율적으로 필터를 통해 확산과 농도가 시간 이내에 평형을하지만, 우리는 직접 파종하기 전에 아래 칸에 NGF를 적용하는 것은 상당히 B의 축삭의 수율을 증가시키는 것으로 관찰필터의 ottom면. - 의 개방을 확대 손질 끝으로 1000 μL 피펫을 사용하여 필터에 튜브에서 DRG를 대체 전송합니다.
- 개의 DRG를 수집하기 전에 팁 2 - 3 배에 용지를 그립니다. 이 팁의 안쪽에 달라 붙는 것을 방해. 같은 팁은 모든 우물에 다시 사용할 수 있습니다. (표준 블루 팁 대) 무색 팁의 사용 팁 표면에 DRG의 고집을 줄일 수 있습니다.
- DRG를 대체 전송 800 μL에 피펫을 설정합니다. 기음 필터의 상단의 용지 약 200 μL는 다음 DRG 함유 튜브로 이동 위아래로 작은 볼륨을 피펫 - 바닥에 침몰 한 개의 DRG를 재현 탁 할 수 있습니다. 전체 볼륨과 삽입의 중간에 끝을 잠수 피펫 개의 DRG를 대기음.
- 일단 모든 삽입이로드, 플레이트 뚜껑을 닫고 판 10 배 소용돌이, 각각의 소용돌이 사이의 후드 벤치에 가볍게 두드리는. 이러한 움직임을 지원하여 축삭 수율을 증가 DRG 외식 싱크 및필터에 부착합니다. 이것은 또한 다른 이식편에서 축삭 겹치지 않도록 균등 이식편을 분배 돕는다.
참고 : 이전 단계에서 설명하는 이식편 파종 절차는 크게 기판 (최대 75 %)로 이식편 첨부의 전반적인 속도를 증가시킨다. 가장 중요한 것은, 피펫 절차는 쉽게 미디어 표면에 떠있는 대신 삽입의 바닥에 가라 앉는에서 외식을 방지 할 수 있습니다. - 생화학 적 분석을 위해, 필터 당 (30 정도) 하나의 배아에서 시드 개의 DRG. 형태 학적 분석을 위해, 절반 또는 하나의 배아 (10 ~ 15)에서 개의 DRG의 제 중 하나를 사용합니다. 관의 모든 개의 DRG는 (은 30, 15, 또는 10 개의 DRG 여부) 하나의 우물에 씨앗을 품고되도록이 결정은, 튜브에 개의 DRG를 수집하기 전에 이루어져야합니다.
- 2-3 일마다 미디어를 변경, 37 ° C에서 세포 배양기에서 문화를 유지한다. 미디어를 변경 먼저 최고 구획을 대기음하려면 아래 구획 하였다. 표준 볼륨에 추가 신선한 미디어맨 아래 칸부터 시작이야.
참고 : 건조 세포 / 축삭을 방지하기 위해, 동시에 3 개 이상 삽입 미디어를 변경하지 않습니다. NGF의 존재에 필터에 성장 개의 DRG 문화 2 일 후에 2mm까지 도달하는 긴 축삭을 확장 할 것입니다.
4. 영양 인자 탈퇴 처리
NGF 철수는 먼저 철수 후 약 12 시간을 표시 (IF 상 대비 및 β-III-tubulin에 의해 결정) 축삭 조각화 축삭 변성을 유도한다. 전체 조각은 36 시간에 의해 달성된다. 변성는 실험 디자인에 따라 최종 사용자에 의해 선택되어야 동안 진행하도록 방치 얼마나.
- 2 일 축삭 확장 단계 후, NGF가 부족하고, 나머지 (또는 내생 적 생산) NGF를 격리시키는 안티-NGF 항체 (1 ㎍ / ㎖)에 포함 된이 미디어에 상단과 하단 구획에서 미디어를 변경합니다.
- 수 있도록 세포 배양기 (37 ° C)에 번호판을 반환원하는 시간 동안 진행 NGF 탈퇴 유도 변성.
- 서양 얼룩 검진 단백질 추출 (6 단계)로 이동하거나 직접 IF (7 단계)에 의해 필터를 검사합니다.
5. 축삭 절개는 Wallerian 변성을 유도하는
이 절차는 전지 본체로부터 분리 필터의 하부 측에 축삭을 남겨 두지 만, 그렇지 않으면 그대로. 그 후,이 축삭이 빠르게 Wallerian 변성을 시작합니다. 첫 번째 절개 후 3 시간으로 나타납니다 (IF 상 대비 또는 β-III-tubulin에 의해 입증) 축삭 분열; 9 시간으로, 축삭이 완전히 분할되어 필터에서 분리됩니다. 변성는 실험 디자인에 따라 최종 사용자에 의해 선택되어야 동안 진행하도록 방치 얼마나.
- 셀 스크레이퍼로 재배 DRG 이식편을 함유하는 필터의 상부 측 긁어. X-, Y-원형에 스크레이퍼를 이동하여 최고 물자의 완전한 제거를 확인방향.
- 필터에서 긁어 NGF (10 NG / ML)를 포함 예열 완료 DRG 미디어 1 ㎖로 교체 된 부동 외식을 포함하는 상위 함에서 용지를 버리십시오.
- Wallerian 변성는 최종 사용자가 선택한 시간 동안 진행 할 수 있도록 인큐베이터 (37 ° C)를 셀에 플레이트를 반환합니다.
- 서양 얼룩 검진 단백질 추출 (6 단계)로 이동하거나 직접 IF (7 단계)에 의해 필터를 검사합니다.
축삭 샘플 6. 단백질 추출
- 램리 샘플 버퍼 75 μL로 수집 튜브 (1.5 ㎖)를 입력합니다. 필터의 전체 집합에서 축삭을 수확하는 동안 얼음에 튜브를 유지합니다.
- PBS에서 DRG 외식으로 필터를 세척하고 필터의 상단을 다 쳤어요. 플레이트에서 삽입물을 분리면 팁 어플리케이터 필터의 상단을 청소하고 상단과 하단 측면에서 여분의 PBS를 대기음.
- 삽입 거꾸로 배치벤치에 예리한 메스를 사용하여 삽입 밖으로 필터를 잘라. 집게, 바닥을 위로 필터를 누릅니다. 가위로 필터의 중심 주위에서 상처를 확인합니다.
- 포집 관의 상단에 장소 필터 및 집게와, 다운 튜브 필터의 가운데를 누르십시오. 이 일을하는 동안, 깔때기 형성한다. 이 램리 샘플 버퍼에 빠져들도록 튜브의 바닥에 깔때기 모양의 필터를 밀어 넣습니다.
- 4 분 동안 튜브를 자비 완전한 단백질을 추출합니다. 튜브의 상단에 거꾸로 배치하는 집게를 사용하여 간단한 스핀 (15 초 동안 2,000 XG)를 수행하는 필터를 제거합니다. 건조 된 필터를 폐기하십시오.
- 관심의 단백질을 감지하는 서양 얼룩 뒤에 SDS-PAGE에있는 축삭 단백질 제제의 10 μl를 해결합니다.
참고 : 참고로, 2 일 동안 성장과 RIPA 100 μL에 용해 (20) 외식에서 축삭 준비 버퍼가 4-6의 단백질 농도를해야합니다 용해㎍ / μL.
필터에 축삭의 7. 면역 형광 시험
다음 단계는 β-III-튜 불린의 검출에 의해 예시 필터 삽입에 염색 경우 수행 할 수있는 일반적인 조작을 설명합니다. 정착액, 배양 시간, 농도와 다른 내용이 다른 항원 - 항체 쌍에 최적화되어야한다.
- 삽입의 다음 세척 및 배양을 위해 철저하게 청소 이전에 사용 된 6 - 웰 플레이트를 활용.
- 간단히 PBS에 삽입을 씻는다. 셰이커에 실온에서 10 분 동안 PBS에서 갓 준비 4 % 파라 포름 알데히드에 수정합니다.
- 고정 후, 긁어 필터의 저면에 독점적 성장 축삭을 수집 인서트의 위쪽면을 청소한다. IF 표준 배양을 진행합니다.
- 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1 시간 동안의 표준 볼륨을 사용하여, (TBS, 0.05 % 트윈 20, 5 % 탈지 우유) 용액을 블로킹 인서트를 배양한다.
- 전송 표준 볼륨을 사용, 버퍼 (안티 - β-III-튜 불린, 1:5,000)를 차단에 희석 차 항체에 삽입합니다. 부드러운 흔들림으로 4 ° C에서 O / N (~ 18 시간)을 품어.
- PBS (RT에서 2 X 10 분)에 두 번 첫 번째 항체를 씻으십시오.
- 전송 표준 볼륨을 사용, (1:2,000을 염소 항 - 마우스) 버퍼를 차단에 희석 형광 - 복합 이차 항체에 삽입합니다. 부드러운 흔들림과 실온에서 2 시간 동안 빛에서 적용을 품어.
- PBS (RT에서 3 × 10 분)의 차 항체의 3 배를 씻으십시오.
- IF가 완료되면, 삽입물 가지고 마지막 세척에서 PBS를 멀리 부어면 - 팁 어플리케이터 필터의 상단을 청소합니다. 위쪽과 아래쪽에서 액체를 대기음.
- 장소는 벤치에 거꾸로 삽입하고 날카로운 메스 삽입 밖으로 필터를 잘라.
- , 집게와 필터를 잡고 위로 하방 및 현미경 슬라이드에 배치합니다. coverslip에 형광 호환 양해 각서 (MOU)와 오버레이nting 미디어. 빛에 덮여 차가운 방에서 건조 평면을 보자. 검사와 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
참고 : 4 ° C에 저장하고 빛으로부터 보호 할 때, 이러한 준비는 형광의 손실을 최소화 주 동안 유지 될 수있다. - 옵션 : 또한, IF는 삽입에서 제거 된 필터를 수행 할 수 있습니다. 이를 위해 긁어 직접 고정 후 필터의 상단면을 청소합니다.
- 여섯 잘 플레이트의 바닥에 날카로운 메스와 장소 필터 축삭 업에 삽입의 필터링을 가져 가라.
- 7.4-7.8 7.11에 표시된대로 그 후, IF에 대한 배양을 수행합니다. 이 대안의 장점은 예를 들어, 배양 볼륨 (7.1-7.11 같이 필터를 직접 삽입에 염색 할 때 사용되는 3 ㎖에 비해) 500 μL까지 갈 수 있기 때문에이 시약을 절약 할 수 있다는 것입니다.
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Representative Results
E13.5 마우스에서 후근 신경절 외식 문화 2 일 이내에 2mm에 도달, 필터에 광범위하게 폴리-D-라이신, 라미닌 및 콜라겐 (그림 1B, 왼쪽)와 코팅을 순차적으로 성장한다. 이 기판의 조합이 특히 풍부한 성장을 수득; 다른 조합은 상당히 짧은 축삭 수익률 (그림 1B를, 오른쪽). 또한, 필터를 유지 개의 DRG 플라스틱 그림 1C에 성장 개의 DRG보다 더 긴 축삭을 확장합니다.
이 프로토콜에서 사용되는 직경이 1 μM, 신경 돌기가 기공을 통해 성장하고 저면에 연장하도록 허용하면서, 필터의 상측에 균체를 유지의 기공 필터. 이것은 명확하게 핵 (DAPI) 및 β-III-tubulin의 그림 1D 스테인드 필터의 표면 형광 현미경으로 표시됩니다. 그대로 필터에서는 뉴런에서 비 두, 세포 핵을 관찰 할 수있다그것에서 이식편 센터와 약간의 조사에 집중 신경 세포. 필터의 상부 측이 긁어 그러나, 핵은 필터 저면 측에, 사라와 축삭이 검출 될 수있다 만하다.
도 1E는 원래 약 17 이식편의 성장을 지속 필터 저부의 예를 나타낸다. 이 예에서, 상부 측이 고정하기 전에 청소 따라서 면역 형광 신호는 필터의 바닥 측에 순수한 축삭를 의미 하였다. 축삭 준비 (필터의 바닥면)에서 단백질 추출 준비가 세포 기관의 무료 시연, 핵 단백질도 1 층의 결여이다. RNA 추출 작업을 할 때 또는, 그것은 다른 5에 도시 된 바와 같이 (차동 지역화의 mRNA의 존재 전체 세포 용 해물과 축삭 준비 사이 (즉, γ-액틴)를 비교하여 축삭 준비의 순도를 확인할 수있다
감각 뉴런의 발달 치기 영양 인자 결핍을 실시 필터에서 모델링 할 수 있습니다. NGF의 존재 축삭 확장 2 ~ 3 일 후, 미디어는 하나의 NGF를 결여하고 나머지 NGF의 그림 2A를 격리시키는 것입니다 반대로 NGF 항체를 포함으로 변경됩니다. 원하는 시점에서, 필터는 생화학 또는 면역 세포 화학 처리됩니다.
그림 2b는 박탈 전후 β-III-tubulin에 대한 스테인드 필터의 바닥면의 전형적인 예를 보여줍니다. 일부 축삭은 구슬로 장식을 표시하기 시작하지만, 박탈의 12 시간 후 약간의 축삭 조각화가있다. 그러나, 광범위한 축삭 변성은 박탈의 36 후에 이루어집니다.
감각 뉴런의 축삭 절개에 의해 유도 Wallerian 변성 용이 원위 PO 남기고 필터의 상부 측을 긁어 필터상에서 성장 체외 이식편에 모델화필터도 3A의 바닥면에 성장 축삭의 rtion은. 그림 3b는 이전과에서 필터 axotomy 후 β-III-tubulin에 대한 스테인드 필터의 바닥면의 전형적인 예를 보여줍니다. 일부 축삭은 구슬로 장식을 표시하기 시작하지만 axotomy 후 3 시간에서 작은 조각이있다. 7.5 시간으로, 대부분의 축삭은 조각난 또는 완전히 사라 졌어요. 이 생체 외 및 생체 내 모델 (19)에 다른에서와 같이 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NAD +, 5 밀리미터, 30 분 전처리)와 외식 전처리 필터에 의한 Wallerian 변성으로부터 보호합니다.
그림 1. 필터 삽입은 순수 축삭 준비를 대량 생산하고 있습니다. 웰 인서트의 삽입 (a)의 A) 스키마, (b) 및DRG 외식 (C). B) 형 폴리-D-라이신 또는 폴리-D와 성장에 비해 더 긴 축삭을 성장 외식 폴리-D-라이신, 라미닌 및 콜라겐 결과 필터의 연속 코팅 최종 구성 - 라이신 및 콜라겐. 이미지가 동일한 기판 코팅 조건 이미징 소프트웨어. C)를 사용하여 중복, 낮은 배율의 사진을 바둑판 식으로 배열에 의해 생산 된, 필터를 유지 DRG 외식)은 플라스틱. D에 성장 외식보다 훨씬 더 풍부한 축삭의 성장을 보여 긁어 얻은 축삭 준비 필터의 상부 측이 세포 핵 약 17 이식편 유래와 24mm 필터의 바닥면 상에 성장 축삭. E) 실시 예 결여이다. 만큼 30 외식 쉽게 일반적인 생화학 적 접근 방법에 대한 충분한 축삭 자료를 산출, 이러한 준비에서 성장 할 수 있습니다. 해물의 F) 면역 블롯은 콜 ected 바닥 대 필터 꼭대기에서 히스톤 H3, 핵 마커는, 필터 정상에 국한되고 있음을 입증. 총 단백질 함량이 다른 시료에 걸쳐 표준화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 축삭 변성의 연구는 필터 삽입에 영양 인자의 철수에 의해 유도. A) 스키마는 일반적인 NGF 박탈 실험을 요약. DRG 외식는) NGF 유지 또는 12 또는 36 시간 동안 NGF 박탈 외식에서 축삭 준비의 다양한 배율의 대표 이미지 (5 배 및 20 배 목표를) NGF의 존재에 광범위한 축삭을 성장하고, NGF 박탈. B에 타락한."https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg"대상 = "_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 필터 삽입에 축삭 절개에 의해 유도 Wallerian 축삭 변성의 연구. A) 스키마는 일반적인 axotomy 실험을 요약. 축삭 단절은, 상기 필터의 상면을 긁는. B 하부 측에 절단 축삭 (균체의 결여) 떠나고) 그대로 이식편에서 축삭 제제의 대표적인 이미지 나 유무에 절개 후에 3 또는 7.5 시간 후에 달성된다 NAD +의 5 mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기술을 채택 할 때 고려해야 할 중요한 매개 변수는 공부한다 신경 세포의 인구, 기판, 필터의 기공 크기 및 표면 영역을 포함한다. 이러한 모든 파라미터가 얻어 신경 돌기 제제의 특이성, 질 및 양에 영향을 미칠 것이며, 최종 사용자에 의해 신중하게 고려되어야한다. 이 프로토콜에 제시된 예에서, DRG 신경 세포의 사용, 따라서 순수 (특정) 축삭 제제를주는 유일한 축삭 연장되는 이점이있다.
배아 개의 DRG의 축삭 성장은 매우 빠른 축삭 샘플 문화 단지 2 일 이후에 준비 할 수 있도록, 중추 신경계에서 뉴런과 비교된다. 1 μM의 기공 크기가 증가 축삭 효율적인 통로를 허용하면서 바닥면으로 이주에서 균체를 방지하기 위해 충분히 작은 입증되었다. 가능한 작은 크기 (즉, 0.4 μM)에 비해 얇은 축삭에 대한 선택을 강요하지 않습니다.DRG 이식편의 연구를 위해, (6 - 웰 플레이트에 사용) 24mm 필터 삽입물은 종종 단백질 입력 많이 필요 면역 포함한 대부분의 기술에 대한 축삭 단백질 샘플의 충분한 양을 생성한다. 그러나, 작은 크기 (12 - 웰 플레이트에 대한 예 필터 삽입) 특히 해리 세포 및 / 또는 면역 세포를 사용하는 경우, 일부 응용 프로그램에 적합합니다.
필터 인서트 효율적으로 검사를 위해 세포 기관에서 신경 돌기를 분리하지만, 두 격실은 전체 세포 치료에 대한 실험 조작을 제한하는 동일한 배양 배지를 공유하는 것이 중요하다. 구획화 Campenot 챔버 또는 마이크로 유체 챔버를 포함하여 다른 격리 방식은 다른 구획의 차동 치료를 위해 수 있습니다. 실험은 자신의 특정 실험 설계에 최적 인이 세포 구획 분리 기술을 결정해야합니다.
물론, 필터 인서트의 절연 능력은 축삭 변성 넘어 유리할 수있다. 예를 들어, 성장 콘 재생의 생화학 쉽게 할 수 있습니다성장 DRG 외식과 필터의 바닥면을 긁어 공부했다. 시간 내에 axotomized DRG 뉴런,이 프로토콜에 설명 된대로, 다음 성장 원추 단백질 재생의 정제를 위해 분리 될 수있는 필터의 바닥면에 성장 콘을 재생성 할 것이다. 또한,이 방법에 의해 얻어진 샘플은 축삭 웨스턴 블롯 이외 생화학 적 방법에 의해 분석 될 수있다. 예를 들어, 축삭은 상기 면역 침전 실험 구 또는 풀다운을 실시 할 수있는 단백질 샘플을 구하는 RIPA CHAPS 또는 용해 버퍼에서 용해 될 수있다. 대안 적으로, 축삭 샘플 이전에 5 바와 같이, RNA 추출을 위해 처리 될 수있다.
제시된 배양 시스템의 이점은 감각 뉴런에 한정되지 않는다. 예를 들어, 피질의 뉴런은 필터 (7)의 하부 측에 시냅스를 형성하는 것 및 수지상 축삭을 연장 할 것이다. 따라서, (시냅스로 농축) 순수한 신경 돌기 샘플 ISOLAT 수시냅스에서 독점적으로 일어나는 프로세스의 세부적인 생화학 적 분석을위한 세포 기관에서 에드. 이 기술의 사용은 간단하고 눈에 띄는 중요한 단계가 없습니다. 그러나, 축삭 길이 및 형태는 필터의 코팅의 품질에 상당히 민감하다. 따라서, 치료는 강력하고 일관성있는 축삭 샘플을 얻기 위해 시간이 표시된 양의 신선하고 균일 한 코팅 솔루션을 사용하여 수행해야합니다. 이 기술의 광범위한 사용은 정상적인 상황에서, 질병에서, 축삭의 생리에 대한 지식을 향상하는 데 도움이됩니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
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| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
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References
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