Introduction
Den axonal rommet av nevroner viser en stor grad av funksjonell uavhengighet fra somato-dendrittiske rommet. I projeksjon nevroner, axons inneholde det meste av nevronale protein 1,2. Studiet av fysiologi og patofysiologi av axoner har fått fart i nevrovitenskap samfunnet fordi nyere studier har vist at tidlig aksonal dysfunksjon synes å være et fellestrekk ved nevrodegenerative sykdommer og nevropsykiatriske lidelser tre. Det virker sannsynlig at en bedre forståelse av aksonale-eksklusiv mekanismene under normale og patologiske tilstander vil belyse de tidlige hendelser som driver dysfunksjon.
Den foreliggende protokoll beskriver hvordan man bruker kulturinnsatser som bærer en porøs membran (filter) for å oppnå store mengder av rent aksonal materiale som er egnet for biokjemiske og immunocytochemical analyser. Bruken av filterinnsatser for å studere aksonal biologi ble først gjennomført ved Steward andkolleger fire og videreutvikles av Twiss og kolleger 5 til sin nåværende form. Teknikken er nå i dagens bruk av grupper som studerer ulike aspekter av aksonal og Dendritt biologi, med litt modifikasjoner i hvert tilfelle for å imøtekomme for befolkningen i nevroner studert, behandlinger som utføres og hvilken type biokjemiske analyser brukt 6-9. Den nåværende protokollen har ikke til hensikt å imøtekomme alle alternativene for et slikt utvalg av programmer, men heller gi en enkel tilnærming som er egnet for de fleste bruksområder. Spesielt protokollen beskrevet her bruker en trippel belegg som maksimerer axonal yield for biokjemiske analyser og er mest egnet til å studere aksonale degenerasjon-andre belegg som er beskrevet i litteraturen produsert mindre axoner som trekkes og utarte raskere når fratatt fra trofiske faktorer ni.
I denne fremgangsmåten forblir neuronal celle organer isolert på toppen av filter while axoner passere gjennom porene og vokse langs sin bunnflate. Pure axoner (fri for glia og neuronal cellekropps forurensninger) som vokser på bunnflaten av filteret kan samles for biokjemiske analyser, eller kan festes på plass og undersøkt ved immunocytochemical teknikker 9. Prosedyren er avhengig av bruk av embryonale sensoriske nevroner fra ryggnerveknutene (DRG). Embryonic DRGs er mye brukt til å studere aksonal biologi på grunn neurites fra disse cellene gjennomgår hurtig og robust vekst in vitro når det holdes i nervevekstfaktor (NGF), og fordi de raskt gjennomgår degenerasjon når ute av denne faktoren. Også, DRG nevroner mangler dendritter, slik at alle neurites samlet inn av denne metoden er rent axons.
Filterinnsatser representerer en stor fordel sammenlignet med andre metoder som brukes for å studere axoner. Studier som baserer seg på bruk av mikroskopi for å differensiere prosesser som forekommer i cellen soma fra de i enXON-signaler gir begrenset biokjemisk informasjon. Som et annet eksempel, compartmentalized kultursystemer (f.eks Campenot kammer 10 eller microfluidic enheter 11) er nyttig for avbildning tilnærminger og for forskjellsbehandling av cellekamre, men gir bare små mengder av aksonal materiale, utelukker bruk av disse teknikkene for biokjemiske analyser som krever relativt store mengder av prøven. Videre, anvendelse av dem krever betydelig trening samt spesialiserte enheter, og de er tidkrevende. En annen tilnærming som ofte brukes til å isolere axons fra eksplantater er å fjerne en eksplantering senter (som inneholder nervecelle organer) manuelt før aksonal prøvetaking. Selv om dette kan gi store mengder axon-anrikede preparater kan aksoner i dette preparatet bli innhyllet i gliaceller og hurtig fjerning av 20 eksplantering organer etter hverandre fra 6 brønner (som et eksempel på en minimal eksperiment) er tidkrevende, og på grensen av gjennomførbarhet.
I kontrast, den metoden som presenteres her gir rikelig og rene aksonale preparater som kan da bli analysert av nesten alle biokjemisk teknikk som vanligvis brukes til å analysere hele cellelysater, som western blot, immunoprecipitation 6, Nord-blot 5 massespektrometri 6, RNA-rensing 7,12,13, blant andre. Videre kan protokollen påføres immunfluorescens (IF) teknikker, som det er mulig å fastsette axoner vokser i undersiden av filteret for ytterligere å undersøke dem ved å IF. Denne tilnærmingen i stor grad forenkler analysen av aksonale spesifikke prosesser, siden det ikke er noen celle-legemer i det endelige preparat. Dette er en betydelig fordel siden en høy immunofluorescent signal fra celle organer undergraver ofte undersøkelse og analyse av et svakere signal stammer fra tynne strukturer som axons.
To anvendelser av kulturen metode for å studere aksonal degenerasjon are beskrives; en modell av utviklings beskjæring og en modell av skade-indusert degenerering (ofte referert til som Wallerian degenerasjon). Modelleringen av utviklings beskjæring er basert på det faktum at sensoriske neuroner in vivo konkurrere om begrensende mengder av mål-avledet NGF og de unnlater å motta tilstrekkelig neurotrophic støtte degenerert 14. Dette fenomenet kan bli etterlignet i embryonale DRG-kulturer ved å trekke NGF fra dyrkningsmedier, som, som skjer in vivo, initierer aksonal degenerasjon, etterfulgt av cellelegemet ødeleggelse. For å modellere Wallerian degenerasjon, er oversiden av filteret med cellelegemer skrapes bort. De aksoner som hadde vokst ut på undersiden av filteret blir fysisk separert fra cellelegemer og deretter gjennomgå den raske og stereotyp degenerativ prosess kjent som Wallerian degenerasjon 15, oppkalt etter A. Waller som først rapportert fenomenet i 1850 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Følgende prosedyrer er i samsvar med retningslinjer godkjent av kanadiske Council of Animal Care. Alle anstrengelser er gjort for å minimere smerte og nød av dyr under prosedyrer.
En. Coating av Filter
MERK: Når kulturen filterinnsatser er plassert i brønner av multi-brønners plater, blir to rom definert: topprommet er området over innsatsdelen og bunnseksjonen er det nedenfor innsatsens Figur 1A.ab. Explants sås i det øvre kammer, hvor de fester seg til den øvre side av filteret; mange axoner vokse gjennom filteret og strekker seg på undersiden av filteret, i de nederste kammer Figur 1A.c. De vanlige arbeidsvolum (dvs. for påføring av beleggoppløsningen, vasker, kulturmedier, etc.) er 2 ml til bunnseksjonen og 1 ml for topprommet og kommer til å bli referert til i protokollen som "; Standard volumer ". Legg løsninger som starter med den nederste avdeling ved å plassere spissen av pipetten i mellomrommet mellom innsatsen og den side av brønnen. Også ved å vippe innsatsen til den ene siden, mens avgivelse av løsningen for å hindre at bobler fra å bli fanget på undersiden av filteret.
- Begynn belegg filtrene dagen før platekledning. Under sterile vev kultur hette, plasserer 24 mm filterinnsatser i en 6-brønnen mottar plate. Inkuber innsatser med poly-D-lysin i vann (1 mg / ml) i 1 time ved romtemperatur ved anvendelse av standardvolumer: 2 ml i bunnseksjonen og 1 ml i toppen.
- Aspirer poly-D-lysin-og skylle en gang med vann. Aspirer vann, lukk lokket og la platene til tørk i panseret O / N. Under aspirasjon av væske, sørg for å fjerne en rest av væske som blir fanget direkte under filteret.
- Neste morgen, fortynnes laminin i vann (10 pg / ml), bland og varm ved 37 ° C. Inkuber inserts med Laminin en time i cell inkubator ved 37 ° C, ved anvendelse av standardvolumer.
- Aspirer laminin og tilsett kollagen i vann (0,1 mg / ml) og inkuberes i 1 time ved RT. I dette tilfelle bruker 2 ml til bunnseksjonen og 2 ml for topprommet.
- Aspirer kollagen og vaskes én gang med sterilt vann. Filtrene er nå klar til å motta kulturmedier og DRG-eksplantater, som beskrevet i trinn 3.
2. Dissecting Embryonale Dorsal Root Ganglion (DRG) explants
- Anesthetize en 13-dagers gravid hunn mus av en IP-injeksjon av Avertin (250 mg / kg). Vent 10-15 min og sjekk for mangel på hornhinnen og pedalabstinens reflekser. Når reflekser er fraværende, utføre halshugging.
- Desinfiser alle kirurgiske instrumenter og kvinnelig underliv med 70% etanol. Tillat instrumenter for å tørke. Hold huden på magen og skjære gjennom huden og muskelen lag å avsløre bukhulen.
- Fjern livmoren ved å koble fra livmorhalsen og eggstokkene. I en klorle hette, fjerne embryo fra livmor med saks og samle dem i en petriskål fylt med iskald L15 media. Hold på is.
MERK: Se tidligere tekniske rapporter for ytterligere detaljer om hvordan du får tak embryoer fra 13 dagers drektighet 17,18. - Under mikroskopet, lå embryoet på en side og bruke små våren saks for å fjerne hodet. Lag et snitt langs den laterale sidene for å forkaste brystet, magen, bena og halen. Hold ryggen som inneholder ryggrad, lå ventral side opp og fjerne alle innvendige organer.
- Med små våren saks, utsette hele ryggmargen ved å kutte ryggsøylen fra sin ventral side langs midtlinjen. Hold kadaveret ned med en pinsett (nr. 3) og bruke et annet par til å holde ryggmargen av sin mest rostral aspekt.
- Dra sakte og forsiktig kabelen borte fra ryggvirvel hulen og knipe av DRGs fra ryggmargen som bruker ultra-tynne tang (# 5). Gruppe de DRGs å samles påbunnen av fatet.
- Samle gruppert DRGs ved å aspirere med en 200 mL pipette spissen som har blitt kuttet for å forstørre åpningen. Plasser DRGs i et rør, og la på is inntil DRG samlingen er ferdig.
MERK: Hvit / gjennomsiktig tips er å foretrekke fordi DRGs ikke holde seg til veggene i dette tipset (sammenlignet med standard gule tips). Flushing tips med media før bruk ytterligere hindrer DRGs fra stikker til sine vegger.
Tre. Seeding og vedlikehold av Dorsal rotganglion explants på Filters
- Til fullstendige DRG-Reklame ved 37 ° C til de belagte innsatser ved hjelp av standard-volumer. Suppler bunnen rommet media med 15 ng / ml av NGF, mens du holder det øverste rommet NGF-fri.
MERK: Selv om NGF effektivt diffunderer over filteret og konsentrasjonen equilibrates i løpet av timer, har vi observert at å bruke NGF til bunnen rommet direkte før såing øker betydelig aksonal avkastning på bOttom overflaten av filteret. - Overfør DRGs fra røret til filtrene ved hjelp av en 1000 mL pipette med et tips trimmet for å forstørre åpningen.
- Tegn medier i spissen 2-3x før samle DRGs. Dette hindrer at de fester seg til den indre side av spissen. Den samme spissen kan brukes om igjen for alle brønner. Bruken av ufargede tips (versus standard blå tips) reduserer DRG stikker til spissen overflaten.
- For å overføre DRGs, satt pipetten på 800 mL. Sug ca 200 mL av media fra oversiden av filteret, og deretter gå til DRG-holdige rør og pipetter et lite volum opp og ned - for å resuspendere DRGs som har sunket til bunnen. Aspirer hele volumet og pipette DRGs senke spissen i midten av innsatsen.
- Når alle innsatser er lastet, lukke plate lokket og virvle plate 10x, trykke den forsiktig på panseret benk mellom hver virvel. Disse bevegelsene øke axonal avkastning ved å hjelpe DRG eksplantater vask ogfeste til filteret. Dette bidrar også distribuere eksplantater jevnt slik at axons fra ulike eksplantater ikke overlapper hverandre.
MERK: explant seeding prosedyren som er beskrevet i de foregående trinnene signifikant øker den generelle hyppigheten av explant vedlegg til underlaget (opptil 75%). Viktigst av pipettering fremgangsmåte lett hindrer eksplantater fra flytende til medieoverflaten i stedet for å synke til bunnen av innsatsen. - For biokjemiske analyser, frø DRGs fra ett embryo (rundt 30) per filter. For morfologiske analyser, bruke enten halvparten eller en tredjedel av de DRGs fra ett embryo (10-15). Denne beslutningen må gjøres før samle DRGs til rør, slik at alle DRGs av et rør blir sådd inn i en enkelt brønn (enten det er 30, 15, eller 10 DRGs).
- Oppretthold kulturer i en celleinkubator ved 37 ° C, endring av mediet etter 2-3 dager. For å endre mediet, å suge det øverste rommet først, etterfulgt av det nederste kammer. Legg friske media i standard volums starter med den nederste kammer.
MERK: For å hindre celler / axons fra tørking, ikke endrer materiale i mer enn tre innsatser på samme tid. DRGs dyrkes på filtrene i nærvær av NGF vil strekke seg lengre aksoner, når opp til 2 mm etter 2 dager i kultur.
4. Trofisk Factor Tilbaketrekking Treatment
NGF tilbaketrekking induserer aksonal degenerasjon med aksonal fragmentering (bestemmes av fasekontrast og β-III-tubulin IF) som først vises rundt 12 timer etter seponering. Fullstendig fragmentering oppnås ved 36 timers. Hvor lenge den degenerering som er igjen for å fortsette etter må bli valgt av sluttbruker i henhold til den eksperimentelle design.
- Etter to dagers aksonal forlengelse fasen, endring medier fra topp og bunn avdelinger til medier som mangler NGF og inneholder anti-NGF-antistoffer (1 pg / ml) for å beslaglegge eventuelle gjenværende (eller endogent produsert) NGF.
- Retur platene til celle inkubator (37 ° C) for å tillateNGF uttak-indusert degenerering forløpe i den ønskede tidsperiode.
- Fortsett til protein utvinning (trinn 6) for undersøkelse av western blot eller direkte undersøke filtrene ved IF (trinn 7).
5. Aksonale tran å indusere Wallerian degenerasjon
Denne fremgangsmåten etterlater axoner på bunnsiden av filteret løsnet fra sin celle legeme, men ellers intakt. Deretter disse axons raskt initiere Wallerian degenerasjon. Aksonal fragmentering (dokumentert av fase kontrast eller β-III-tubulin IF) vises først etter tre timer etter tran; ved 9 timer, aksoner er helt fragmentert og blir løsnet fra filteret. Hvor lenge den degenerering som er igjen for å fortsette etter må bli valgt av sluttbruker i henhold til den eksperimentelle design.
- Skrap oversiden av filteret, som inneholder vokst DRG eksplantater, med en celle-skrape. Sikre fullstendig fjerning av toppmateriale ved å flytte skraper i X-, Y-og sirkulærretninger.
- Kast media fra det øverste rommet inneholder de flytende eksplantater som har blitt skrapt fra filteret og erstatte med en ml forvarmet, komplett DRG medier som inneholder NGF (10 ng / ml).
- Returner platen til celle inkubator (37 ° C) for å tillate Wallerian degenerasjon forløpe i den tidsperiode som er valgt av sluttbrukeren.
- Fortsett til protein utvinning (trinn 6) for undersøkelse av western blot eller direkte undersøke filtrene ved IF (trinn 7).
6. Protein Utvinning av aksonale Samples
- Fyllprøverør (1,5 ml) med 75 ul av Laemmli prøvebuffer. Hold rørene på is mens du høster axoner fra hele sett med filtre.
- Vask filteret med DRG-eksplantater i PBS og skrape oversiden av filteret. Uttaking fra platen, rengjøre oversiden av filteret med en bomullsspiss applikator og suge noen ekstra PBS fra den øverste og nederste kanter.
- Plasser innsatsen oppsidepå en benk og kuttet filteret ut av innsatsen ved hjelp av en skarp skalpell. Hold filteret med tang, nedenfra og opp. Et snitt fra omkretsen til midten av filteret med en saks.
- Legg filteret på toppen av oppsamlingsrøret, og med tang, trykk på midten av filteret ned i røret. Mens du gjør dette, bør en trakt form. Skyv traktformede filteret til bunnen av røret, slik at den er neddykket i Laemmli prøvebuffer.
- Komplett protein utvinning ved å koke rørene for 4 min. Fjern filter med tang for å plassere den opp-ned inn i toppen av røret, og å utføre en kort sentrifugering (2000 x g i 15 sek). Kast de tørkede filtre.
- Løse 10 pl av den aksonal protein preparatet i en SDS-PAGE etterfulgt av western blot for å påvise proteiner av interesse.
MERK: Som en referanse, en aksonal preparat fra 20 eksplantater dyrket i 2 dager, og lyserte i 100 mikroliter RIPA lysebuffer vil ha en proteinkonsentrasjon på 4-6mikrogram / mL.
7. Immunfluorescens Undersøkelse av Axoner på Filters
Følgende fremgangsmåte beskriver de generelle manipulasjoner for å utføre IF flekker på filterinnsatser, eksemplifisert ved påvisning av β-III-tubulin. Fikseringsmiddel, bør inkubasjonstider, konsentrasjonene og andre enkeltheter optimaliseres for andre antigen-antistoff-par.
- Utnytte tidligere brukte 6-brønn plater, grundig rengjort, for følgende vasker og inkubasjoner av innleggene.
- Kort vaske innstikk i PBS. Fikse dem i nylagde 4% paraformaldehyde i PBS i 10 min ved RT på shaker.
- Etter fiksering, skrape og rengjøre oversiden av innsatsen for å samle axoner som vokste utelukkende på bunnflaten av filteret. Fortsett med standard inkubasjoner for IF.
- Inkuber innsatser i blokkeringsoppløsning (TBS, 0,05% Tween 20, 5% skummet melk), ved bruk av standard-volumer, i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting.
- Overføring settes til primært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer (anti-β-III-tubulin, 1:5,000), ved anvendelse av standardvolumer. Inkuber O / N (~ 18 timer) ved 4 ° C med forsiktig risting.
- Vask det første antistoffet to ganger i PBS (2 x 10 min ved RT).
- Overføring settes til fluorescerende-konjugert sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer (geit anti-mus, 1:2,000), ved anvendelse av standardvolumer. Inkuber dekket mot lys i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig risting.
- Vask det sekundære antistoff 3 x i PBS (3 x 10 min ved RT).
- Etter IF er fullført, kan sette seg, helle vekk PBS fra siste vask og rengjøring av oversiden av filteret med en bomullsspiss applikator. Aspirer noe væske fra toppen og bunnen sider.
- Sted sette opp-ned på benken, og kutte filteret ut av innsatsen med en skarp skalpell.
- Hold filteret med tang, ulemper opp, og legg på mikros lysbilde. Overlegg med et dekkglass og selvlysende-kompatibel mounting media. La tørke flatt i kaldt rom, dekket mot lys. Undersøke og ta bilder ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
MERK: Når den lagres ved 4 ° C og beskyttet mot lys, kan disse preparatene holdes for uker med minimalt tap av fluorescens. - EKSTRA: Alternativt IF kan utføres på filtre som har blitt fjernet fra innsatsen. For å gjøre det, skrape og rense oversiden av filtrene rett etter fiksering.
- Ta filtrene ut av innsatsene med en skarp skalpell og plassere filtrene axoner opp på bunnen av en seks-brønners plate.
- Etterpå utføre inkubasjoner for IF som angitt i 7.4 til 7.8 og 7.11. Fordelen med dette alternativet er at det sparer reagenser, siden, for eksempel, kan inkubasjonstider volumer gå ned til 500 ul (i forhold til de 3 ml brukt når filtre er direkte farget på innsatsene som vist på 7.1 til 7.11).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dorsal root ganglion eksplantater fra E13.5 mus vokse mye på filtre belagt sekvensielt med poly-D-lysin, laminin og kollagen (Figur 1B, til venstre), og nådde opp til 2 mm i løpet av to dager i kultur. Dette underlaget kombinasjonen gir spesielt frodig vekst; andre kombinasjoner gir axoner som er betydelig kortere (Figur 1B, høyre). Videre DRGs vedlikeholdt på filtre utvide flere og lengre axons enn DRGs dyrkes på plast figur 1C.
Filtre med porer av en mikrometer i diameter, som brukes i denne protokollen, beholde celle organer på oversiden av filteret, samtidig som neurites å vokse gjennom porene og strekker seg på bunnflaten. Dette er klart vist ved epifluorescence mikroskopi av filtre farget for kjerner (DAPI) og β-III-tubulin figur 1D. I intakte filtre er det mulig å observere cellekjerner, både fra neuroner og ikke-neuronale celler, konsentrert i eksplantering midten og litt bestråle fra den. Imidlertid, når den øvre side av filteret er skrapt, kjerner er borte, og bare axoner kan detekteres, på filtrene undersiden.
Figur 1E viser et eksempel på et filter bunn som opprinnelig ble påført veksten av omtrent 17 eksplantater. I dette eksempel ble det oversiden renset før fiksering og derfor immunofluorescent signal representerer rene axoner på undersiden av filteret. Protein utvinning fra aksonale preparater (undersiden av filter) er blottet for atom proteiner Figur 1F, som viser at preparatet er fri for celle organer. Alternativt, når det arbeides med RNA-ekstraksjon, er det mulig å bekrefte renheten av aksonal preparatet ved å sammenligne tilstedeværelsen av differensielt lokaliserte mRNA (dvs. γ-aktin) mellom hel-cellelysater og aksonal preparater (som vist av andre 5
Utviklings beskjæring av sensoriske nerveceller kan modelleres i filtre utsatt for trofisk faktor deprivasjon. Etter 2-3 dagers axon forlengelse i nærvær av NGF, er mediet endret til en mangelfull NGF og inneholdende et anti-NGF antistoff som vil beslaglegge eventuell gjenværende NGF figur 2A. På de ønskede tidspunkter, er filtre behandlet for biokjemi eller immunocytochemistry.
Figur 2B viser typiske eksempler på undersiden av filtrene farget for β-III-tubulin før og etter savn. Etter 12 timer av savn det er lite axonal fragmentering, selv om noen axons begynner å vise beading. Imidlertid er omfattende aksonal degenerasjon oppnås etter 36 av savn.
Wallerian degenerasjon indusert av axon transection av sensoriske nerveceller er lett modellert i eksplantater dyrket på filtrene ved skraping oversiden av filteret, etterlater den distal portion av aksoner som vokste på undersiden av filter figur 3A. Figur 3B viser typiske eksempler på undersiden av filtrene farget for β-III-tubulin før og etter in-filter axotomy. På tre timer etter axotomy, er det lite fragmentering, selv om noen axons begynner å vise beading. Med 7,5 t, er de fleste axons fragmentert eller helt borte. Forbehandling av explants med nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD +, 5 mM, 30 minutter forbehandling) beskytter mot Wallerian degenerering indusert på filter, som den gjør i andre in vitro-og in vivo-modeller 19.
Figur 1. Filtrer inserts produsere store mengder ren aksonale forberedelser. A) Et skjema av en innsats (a), av en innsats i en brønn (b) og denendelige konfigurasjon med DRG-eksplantater (c). B) Den sekvensielle belegging av filtre med poly-D-lysin, laminin og kollagen resulterer i eksplantater som vokser flere og lengre axoner sammenlignet med de som var dyrket med poly-D-lysin alene eller poly-D -lysin og kollagen. Bildene ble produsert av flislegging overlappende, med lav forstørrelse bilder ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer. C) Under samme underlaget belegg forhold, DRG eksplantater vedlikeholdt på filtre viser betydelig mer frodig aksonal vekst enn eksplantater dyrkes på plast. D) Den axonal forberedelse oppnås ved å skrape oversiden av filteret er blottet for cellekjerner. E) Eksempel på aksoner som stammer fra omtrent 17 eksplantater og dyrket på undersiden av et 24 mm filter. Så mye som 30 eksplantater kan lett vokse i disse forberedelsene, gir nok axonal materiale for vanlige biokjemiske tilnærminger. F) immunoblots av lysatene coll ected fra filter topper versus bunner demonstrere at histone H3, en kjernefysisk markør, er begrenset til filter topper. Den totale proteininnholdet ble normalisert over de ulike prøvene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Studiet av aksonal degenerasjon indusert av trofisk faktor tilbaketrekking i filterinnsatser. A) Skjema skisserer en typisk NGF-deprivasjon eksperiment. DRG eksplantater vokse omfattende axoner i nærvær av NGF, og utarte på NGF deprivasjon. B) Representative bilder på ulike forstørrelser (5X og 20X mål) av aksonale preparater fra eksplantater vedlikeholdt i NGF eller fratatt NGF for 12 eller 36 timer."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Studiet av Wallerian aksonal degenerasjon indusert av aksonal tran i filterinnsatser. A) Skjema skisserer en typisk axotomy eksperiment. Axon adskillelse oppnås ved å skrape oversiden av filteret, og etterlater avkuttede axoner (blottet for celleorganer) på bunnsiden. B) Representative bilder av aksonal preparater fra intakte eksplantater eller etter 3 eller 7.5 timer etter transeksjon i nærvær eller fravær av 5 mM av NAD +. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktige parametere for å ta hensyn til ved å tilpasse denne teknikken omfatter neuronal populasjon som skal studeres, substratet, porestørrelse av filteret og overflateareal. Alle disse parameterne vil påvirke spesifisiteten, kvaliteten og kvantiteten av neurite preparat erholdt, og må vurderes nøye av sluttbrukeren. I eksemplene presentert i denne protokollen, har bruken av DRG-neuroner fordelen av å forlenge bare axoner, og dermed gi en ren (spesifikk) aksonal preparat.
Aksonal vekst av embryonale DRGs er meget rask i forhold til neuroner i sentralnervesystemet, slik aksonale prøver som fremstilles etter kun 2 dager i kultur. Porestørrelsen av en mikrometer har vist seg tilstrekkelig små til å hindre at cellen organer fra å migrere inn i bunnflaten, samtidig som effektiv passasje av voksende axoner. Sammenlignet med mindre størrelser er tilgjengelige (dvs. 0,4 mikrometer) den ikke pålegge selektivitet for tynne axons.For studiet av DRG-eksplantater, 24 mm filterinnsatsen (for anvendelse i 6-brønn plater) produserer tilstrekkelige mengder av aksonal proteinprøve for de fleste teknikker som immunoutfelling, som ofte krever en stor mengde protein inngang. Men mindre størrelser (dvs. filterinnsatser for 12-brønners plater) er egnet for enkelte programmer, spesielt hvis du bruker dissosiert celler og / eller immunocytochemistry.
Selv om filterinnsatsen effektivt isolerer neurites fra celle organer for undersøkelse, er det viktig å merke seg at begge seksjonene har samme kulturmedia, begrense de eksperimentelle manipulasjoner til hel-celle-behandlinger. Andre isolasjon tilnærminger, inkludert compartmentalized Campenot kamre eller microfluidic kamre, gi rom for forskjellsbehandling av de ulike avdelinger. Eksperimentator må avgjøre hvilke av disse celle-kupé isolasjonsteknikker er mest egnet for sine egne spesifikke eksperimentell design.
Selvfølgelig kan isolasjonsevne av filterinnsatser med fordel utover aksonal degenerasjon. For eksempel, kan biokjemi av regenererende vekst kjegler være lettstudert ved å skrape undersiden av filtre med voksne DRG eksplantater. I løpet av timer, vil axotomized DRG-neuroner regenerere vekstkjegler på bunnsiden av filtrene som, slik det er beskrevet i denne protokollen, kan så isoleres for rensing av regenererende vekst membran proteiner. Videre kan de aksonale prøvene fremstilt ved denne metode analyseres av andre enn western blotting biokjemiske metoder. For eksempel kan axoner bli lysert i RIPA-eller CHAPS lysis buffer for å få en proteinprøve som kan bli ytterligere underkastet immunoutfelling eller mater eksperimenter 9. Alternativt kan aksonale prøvene bearbeidet for RNA-ekstraksjon, som tidligere beskrevet 5.
Fordelen med kultur-system presenteres er ikke begrenset til sensoriske nevroner. For eksempel vil kortikale neuroner strekker dendritter og aksoner som vil danne synapser på undersiden av filteret 7.. Dermed kan rene neurite prøver (beriket med synapser) bli isolated fra celle organer for detaljerte biokjemiske analyser av prosesser som foregår utelukkende i synapser. Bruken av denne teknikk er enkle og ikke har noen fremragende kritiske trinn. Imidlertid er aksonal lengde og morfologi ganske følsomme for kvaliteten av belegget av filtrene. Derfor må man sørge for å bruke friske og homogene belegg løsninger for de angitte mengder tid å få robuste og konsistente aksonale prøver. Den utbredte bruken av denne teknikken vil hjelpe fremme vår kunnskap om fysiologi av axoner, under normale omstendigheter, og i sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
