Introduction
O compartimento axonal de neurônios mostra um elevado grau de independência funcional do compartimento do somato-dendrítica. Em neurônios de projeção, os axônios conter a maior parte do 1,2 proteína neuronal. O estudo da fisiologia e fisiopatologia dos axônios ganhou força na comunidade da neurociência porque estudos recentes têm mostrado que a disfunção axonal no início parece ser uma característica comum de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos 3. Parece provável que uma melhor compreensão dos mecanismos axonal exclusiva em condições normais e patológicas vai lançar luz sobre os eventos iniciais que levam a disfunção.
O presente protocolo descreve como utilizar inserções de cultura tendo uma membrana porosa (filtro) para obter grandes quantidades de material axonal puro que é adequado para análises bioquímicas e imunocitoquímica. O uso de filtro insere estudar biologia axonal foi implementado pela primeira vez por Steward e4 colegas e desenvolvido por Twiss e colegas 5 a sua configuração actual. A técnica é agora de uso corrente por parte de grupos que estudam diferentes aspectos da biologia axonal e dendritos, com ligeiras modificações, em cada caso para acomodar a população de neurônios estudados, os tratamentos realizados eo tipo de análises bioquímicas usadas 6-9. O presente protocolo não pretende acomodar todas as alternativas para uma tal variedade de aplicações, mas sim fornecer uma abordagem simples que é adequado para a maioria das aplicações. Em particular, o protocolo descrito aqui utiliza uma camada tripla que maximiza o rendimento axonal para análises bioquímicas e é o mais apropriado para estudar revestimentos degeneração axonal outros descritos na literatura produziu menos axónios que retraem e degeneram mais rápido quando privados de factores tróficos 9.
Neste procedimento, os corpos celulares neuronais permanecer isolada sobre os filtros de whaxônios ile passar através dos poros e crescer ao longo de sua superfície inferior. Axónios puros (livres de células da glia e os contaminantes do corpo da célula neuronal), que crescem sobre a superfície inferior do filtro pode ser recolhido para análises bioquímicas ou pode ser fixada in situ e examinadas por meio de técnicas de imunocitoquímica 9. O procedimento baseia-se na utilização de neurónios sensoriais embrionárias a partir de gânglios da raiz dorsal (DRG). DRGs embrionárias são amplamente usados para o estudo da biologia axonal porque neurites a partir dessas células sofrem um crescimento rápido e robusto, in vitro, quando mantidos em factor de crescimento do nervo (NGF), e porque rapidamente sofrer degeneração quando privados deste factor. Além disso, os neurónios DRG falta dendritos, de modo que todas as neurites recolhidos por este método são meramente axónios.
Filtrar inserções representam uma grande vantagem em comparação com outras abordagens utilizadas para estudar os axônios. Estudos que dependem da utilização de microscopia de diferenciar os processos que ocorrem na célula do soma daquelas numaXONs fornecer informação bioquímica limitado. Como outro exemplo, os sistemas de cultura (por exemplo, em compartimentos, câmaras Campenot 10 ou dispositivos de microfluidos 11) são úteis para abordagens de imagem e para o tratamento diferencial de compartimentos celulares, mas fornecer apenas pequenas quantidades de material axonal, impedindo o uso destas técnicas para análises bioquímicas que requerem quantidades relativamente grandes de amostra. Além disso, seu uso requer treinamento significativo, bem como dispositivos especializados, e eles são demorados. Outra abordagem frequentemente usada para isolar os axônios a partir de explantes é remover manualmente um centro de explante (contendo corpos celulares neuronais) antes da coleta de amostra axonal. Embora este pode produzir grandes quantidades de preparações enriquecidas dos axónios, os axônios nesta preparação pode ser envolto em células gliais e removendo rapidamente corpos 20 do explante consecutivamente a partir de 6 poços (como um exemplo de uma experiência mínima) é demorado e no limite de viabilidade.
Em contraste, o método aqui apresentado produz preparações axonais abundante e pura, que pode, então, ser analisados por virtualmente qualquer técnica bioquímica que é vulgarmente utilizado para analisar os lisados de células inteiras, como Western blot, imunoprecipitação 6, northern blot 5 espectrometria de massa 6, a purificação de ARN 7,12,13, entre outros. Além disso, o protocolo pode ser aplicado para imunofluorescência (IF) de técnicas, como é possível a fixação de axónios em crescimento no lado inferior do filtro para os examinar ainda por IF. Esta abordagem facilita muito a análise dos processos específicos de axonal já que não há corpos celulares na preparação final. Esta é uma vantagem significativa uma vez que um sinal de alta imunofluorescência de corpos celulares muitas vezes prejudica o exame e análise de um sinal mais fraco proveniente de estruturas finas, tais como axónios.
Duas aplicações do método de cultura para estudar axonal ar degeneraçãoe descritos; um modelo de poda de desenvolvimento e um modelo de degeneração induzida por lesão (comumente referido como degeneração Walleriana). A modelagem da poda de desenvolvimento baseia-se no fato de que os neurônios sensoriais in vivo competem para limitar a quantidade de NGF derivado do alvo e aqueles não receber suficiente neurotrófico degenerado apoio 14. Este fenómeno pode ser mimetizado em culturas de DRG embrionárias mediante a retirada do NGF do meio de cultura, o que, como acontece in vivo, inicia a degeneração axonal seguida da destruição de células do corpo. Para modelar a degeneração Wallerina, o lado superior do filtro com os corpos celulares é raspado. Os axônios que tinham crescido para o lado inferior do filtro tornar-se fisicamente separados dos corpos celulares e, posteriormente, submeter-se ao processo degenerativo rápido e estereotipado conhecida como degeneração Walleriana 15, em homenagem a A. Waller que primeiro relatou o fenômeno em 1850 16.
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Protocol
NOTA: Os seguintes procedimentos estão em conformidade com as directrizes aprovadas pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal. Todos os esforços são para minimizar a dor eo sofrimento dos animais durante os procedimentos.
1. Revestimento de Filtros
Nota: Quando as inserções de filtro de cultura são colocadas em poços de placas de poços múltiplos, dois compartimentos são definidos: o compartimento de cima é a região superior da inserção e do compartimento inferior é o que está abaixo do inserto Figura 1A.ab. Os explantes são semeados na parte superior do compartimento onde se fixam para o lado de cima do filtro; muitos axónios crescer através do filtro e prolongar sobre o lado inferior do filtro, dentro do compartimento inferior Figura 1A.c. Os volumes de trabalho padrão (ou seja, para a aplicação de solução de revestimento, lavagens, meios de cultura, etc) são 2 ml para o compartimento inferior e 1 ml para o compartimento superior e vão ser referidos no protocolo como "; Volumes normais ". Adicionar as soluções de partida, com o compartimento de fundo, colocando a ponta da pipeta no espaço entre o inserto e o lado do poço. Além disso, a inserção de inclinar para um lado, enquanto a distribuição da solução para evitar que as bolhas de ser preso na parte inferior do filtro.
- Inicie o revestimento dos filtros no dia antes do plaqueamento. De acordo com o tecido de cultura esterilizado capa, colocar 24 inserções de filtro mm numa placa de 6 alvéolos de recepção. Incubar inserções com poli-D-lisina em água (1 mg / ml) durante 1 hora à temperatura ambiente usando volumes padrão: 2 ml no compartimento inferior e um ml do topo.
- Aspirar poli-D-lisina e lavar uma vez com água. Aspirar água, feche a tampa e deixe as placas para secar no capô O / N. Durante a aspiração de líquidos, certifique-se de remover um remanescente de líquido que fica preso diretamente sob o filtro.
- Na manhã seguinte, diluir em água laminina (10 ug / ml), misturar e quente a 37 ° C. Incubar inserções com laminina 1 hr no cell incubadora a 37 ° C, utilizando-se volumes padrão.
- Laminina aspirado e adicionam colagénio em água (0,1 mg / ml) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Neste caso utilizam 2 ml para o compartimento inferior e 2 ml para o compartimento superior.
- Colagénio Aspirar e lavar uma vez com água estéril. Os filtros já estão prontos para receber meios de cultura e explantes DRG, conforme descrito no passo 3.
2. Dissecação Embryonic gânglio de raiz dorsal (DRG) explantes
- Anestesiar um rato fêmea grávida de 13 dias por uma injeção IP de Avertin (250 mg / kg). Espere 10-15 minutos e verifique se há falta de reflexos de retirada da córnea e pedais. Uma vez que os reflexos estão ausentes, realizar deslocamento cervical.
- Desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos e abdômen feminino com etanol 70%. Permitir instrumentos para secar. Mantenha a pele do abdómen e cortar através das camadas da pele e músculo para expor a cavidade abdominal.
- Remover o útero por descolamento do colo do útero e ovários. Numa Sterile capô, retire os embriões do útero com uma tesoura e coletá-los em uma placa de Petri cheia de mídia L15 gelada. Mantenha no gelo.
NOTA: Consulte relatórios técnicos anteriores para obter mais detalhes sobre como obter embriões de 13 dias de gestação 17,18. - Sob o microscópio, estava o embrião de um lado e usar uma tesoura pequena mola para remover a cabeça. Faça uma incisão ao longo das laterais para descartar o peito, barriga, pernas e cauda. Mantenha as costas contendo a coluna vertebral, deitados lado ventral para cima e remova todos os órgãos viscerais.
- Com uma tesoura pequena mola, expor toda a medula espinal por corte da coluna vertebral a partir do seu lado ventral na linha média. Segurar a carcaça para baixo com um par de pinças (# 3) e com um segundo par de segurar a medula espinal por seu aspecto mais rostral.
- Lenta e delicadamente puxe o cabo longe da cavidade vertebral e beliscar fora DRGs da medula espinhal usando fórceps ultra-finas (# 5). Grupo dos DRGs que devem ser recolhidaso fundo do prato.
- Colete DRGs agrupados por aspiração com uma pipeta de 200 mL que foi cortado para ampliar a sua abertura. Coloque as GDH num tubo e deixar em gelo até a recolha de DRG está terminado.
NOTA: Branco dicas / transparentes são os preferidos porque DRGs não aderem às paredes desta ponta (em comparação com pontas amarelas padrão). Dicas Flushing com a mídia antes do uso impede mais DRGs de degola para suas paredes.
3. Sementeira e Manutenção de gânglio de raiz dorsal explantes em Filtros
- Adicionar mídia DRG completa a 37 ° C para as pastilhas revestidas utilizando volumes padrão. Suplemento da mídia compartimento inferior com 15 ng / ml de NGF, enquanto se mantém a parte superior do compartimento de NGF livre.
NOTA: Apesar de NGF difunde de forma eficiente através do filtro e sua concentração equilibra dentro de horas, temos observado que a aplicação de NGF ao compartimento inferior diretamente antes da semeadura aumenta significativamente o rendimento axonal no bottom superfície do filtro. - Transferir os DRGs do tubo para os filtros, utilizando uma pipeta de 1000 ul com uma ponta cortada para aumentar a sua abertura.
- Desenhe mídia na ponta 2-3x antes de coletar os DRGs. Isto evita que fiquem coladas ao lado de dentro da ponta. A mesma ponta pode ser re-utilizado para todos os poços. O uso de dicas uncolored (versus pontas azuis padrão) reduz DRG degola para a superfície da ponta.
- Para transferir DRGs, defina a pipeta de 800 mL. Aspirar cerca de 200 mL de mídia a partir do lado superior do filtro, em seguida, ir para o tubo contendo DRG e pipetar um volume pequeno para cima e para baixo - para voltar a suspender DRGs que se afundaram para o fundo. Aspirar todo o volume e GDH submergindo a ponta da pipeta no meio do inserto.
- Uma vez que todas as inserções são carregados, feche a tampa e agite a placa placa de 10x, tocando-o com cuidado no banco capô entre cada redemoinho. Estes movimentos aumentar o rendimento axonal, ajudando explantes DRG pia eanexar ao filtro. Isto também ajuda a distribuir uniformemente explantes de modo que a partir de axônios diferentes explantes não se sobrepõem.
NOTA: O procedimento de semeadura explante descrito nas etapas anteriores, aumenta significativamente a taxa global de fixação explante para o substrato (até 75%). Mais significativamente, o processo de pipetagem prontamente impede explantes de flutuar sobre a superfície dos meios de comunicação em vez de afundar para o fundo do inserto. - Para as análises bioquímicas, DRGs sementes de um embrião (cerca de 30) por filtro. Para as análises morfológicas, use metade ou um terço dos DRGs de um embrião (10-15). Esta decisão deve ser tomada antes de coletar os DRGs em tubos, de modo que todos os DRGs de um tubo são semeadas em um único poço (se é 30, 15 ou 10 DRGs).
- Manter as culturas numa incubadora celular a 37 ° C, alterando mídia a cada 2-3 dias. Para mudar de suporte, aspirar o compartimento de topo em primeiro lugar, seguido do compartimento inferior. Adicionar mídia frescas em volume padrãos a partir do compartimento inferior.
NOTA: Para evitar que células / axônios de secagem, não mudam de mídia em mais de três inserções ao mesmo tempo. DRGs cultivadas em filtros na presença de NGF vai estender axônios longos, atingindo até 2 mm ao fim de 2 dias em cultura.
4. Fator Trófico Tratamento Retirada
Retirada NGF induz degeneração axonal com a fragmentação axonal (determinado pelo contraste de fase e β-III-tubulina SE), que aparece pela primeira vez em torno de 12 horas após a retirada. Fragmentação completa é alcançada em 36 horas. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental.
- Após a fase de extensão axonal de 2 dias, a partir de meios de mudar os compartimentos superior e inferior de meios de comunicação, que carece de NGF e que contém os anticorpos anti-NGF (1 ug / ml) para sequestrar qualquer remanescente (ou produzida endogenamente) NGF.
- E volta para as placas da incubadora celular (37 ° C) para permitirNGF degeneração induzida por retirada de proceder para a quantidade de tempo desejada.
- Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7).
5. Axonal transecção para induzir a degeneração walleriana
Este procedimento deixa os axónios no lado inferior do filtro separado do seu corpo da célula, mas de outra forma intacto. Posteriormente, esses axônios iniciar rapidamente a degeneração Walleriana. Fragmentação axonal (evidenciado pelo contraste de fase ou β-III-tubulina IF) aparece pela primeira vez por 3 horas após a transecção; por 9 horas, os axônios são completamente fragmentados e são separadas do filtro. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental.
- Raspe o lado superior do filtro, contendo explantes DRG cultivados, com um raspador de células. Assegurar a remoção completa do material de topo por raspador movendo-se em X, Y e circularindicações.
- Descartar o material da parte superior do compartimento contendo os explantes flutuantes que foram raspados do filtro e substitua com 1 ml de pré-aquecido, meios DRG completo contendo NGF (10 ng / ml).
- Retornar placa para a célula incubadora (37 ° C) para permitir que a degeneração waleriana prosseguir durante o período de tempo escolhido pelo utilizador final.
- Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7).
6. Extração de proteínas das amostras axonais
- Preencha tubos de coleta (1,5 ml) com 75 mL de tampão de amostra Laemmli. Manter tubos em gelo enquanto colhendo os axônios de todo o conjunto de filtros.
- Lavar o filtro com explantes DRG em PBS e raspar o lado de topo do filtro. Remova a inserção da placa, limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta e aspirar qualquer PBS extra dos lados superior e inferior.
- Coloque inserção de cabeçapara baixo no banco e cortar o filtro da inserção utilizando um bisturi afiada. Mantenha o filtro com uma pinça, de baixo para cima. Fazer um corte a partir da circunferência para o centro do filtro, com uma tesoura.
- Local filtro no topo do tubo de recolha, e com uma pinça, prima do centro do filtro para baixo do tubo. Enquanto isso, um funil devem formar. Empurrar o filtro em forma de funil para o fundo do tubo de maneira que ele é submerso no tampão de amostra Laemmli.
- Extração de proteína completa, fervendo os tubos para 4 min. Retirar o filtro, utilizando um fórceps para colocá-la de cabeça para baixo na parte superior do tubo e realizar uma breve centrifugação (2000 xg durante 15 seg). Descarte os filtros secos.
- Resolver 10 ul da preparação de proteína axonal num SDS-PAGE seguido por Western blot para detectar as proteínas de interesse.
NOTA: Como referência, uma preparação axonal de 20 explantes cultivados durante 2 dias e lisadas em 100 ul de tampão de lise RIPA terá uma concentração de proteína de 4-6ug / ul.
7. Exame de imunofluorescência de axônios em Filtros
Os passos seguintes descrevem as manipulações gerais para executar se a coloração de elementos filtrantes, exemplificadas pela detecção de β-III-tubulina. Fixação, tempos de incubação, concentrações e outros elementos devem ser otimizados para outros pares de antígeno-anticorpo.
- Utilize usados anteriormente placas de 6 poços, cuidadosamente limpos, para as seguintes lavagens e incubações das inserções.
- Lava-se rapidamente insertos em PBS. Corrigi-los em recém-preparada de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente no agitador.
- Após a fixação, raspar e limpar o lado de topo do inserto de recolher os axónios que cresceram exclusivamente sobre a superfície inferior do filtro. Prossiga com incubações padrão para IF.
- Incubar inserções em solução de bloqueio (TBS, 0,05% de Tween 20, 5% de leite desnatado), usando volumes padrão, durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave.
- Transferência de inserções para anticorpo primário diluído em tampão (anti-β-III-tubulina, 1:5000) de bloqueio, utilizando volumes padrão. Incubar S / N (~ 18 horas) a 4 ° C com agitação suave.
- Lavar o primeiro anticorpo duas vezes em PBS (2 x 10 min à temperatura ambiente).
- Transferência insere a anticorpos secundários fluorescentes conjugados diluídos em tampão de bloqueio (cabra anti-ratinho, 1:2000), usando volumes padrão. Incubar coberto da luz durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave.
- Lavar 3x anticorpo secundário em PBS (3 x 10 min à temperatura ambiente).
- Depois de IF é completa, tome inserir fora, despeje longe PBS a partir da última lavagem e limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta. Aspirar todo o líquido a partir dos lados superior e inferior.
- Local inserir de cabeça para baixo no banco, e cortar o filtro de inserção com um bisturi afiada.
- Mantenha o filtro com uma pinça, desvantagem, e colocar sobre lâmina de microscopia. Overlay com uma lamela e mou compatível fluorescentemídia NTING. Vamos plana e seca no quarto frio, coberto de luz. Examinar e capturar imagens usando um microscópio fluorescente.
NOTA: Quando armazenado a 4 ° C e protegida da luz, estas preparações podem ser mantidas durante semanas, com uma perda mínima de fluorescência. - OPCIONAL: Como alternativa, se pode ser realizada em filtros que foram removidas a partir da inserção. Para fazer isso, raspar e limpar o lado de cima dos filtros directamente após a fixação.
- Tome filtros fora das pastilhas com um bisturi afiado filtros e colocar axónios-se na parte inferior de uma placa de seis poços.
- Em seguida, execute incubações para IF como indicado na 7,4-7,8 e 7.11. A vantagem desta alternativa é que poupa reagentes, uma vez que, por exemplo, os volumes de incubação pode ir até 500 mL (em comparação com os 3 ml utilizadas quando os filtros são directamente corados sobre as inserções como mostrado na 7,1-7,11).
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Representative Results
Explantes gânglio da raiz dorsal de ratos E13.5 crescer extensivamente sobre filtros sequencialmente revestidas com poli-D-lisina, laminina e colágeno (Figura 1B, à esquerda), atingindo até 2 mm de dentro de 2 dias em cultura. Esta combinação de substrato produz um crescimento particularmente exuberante; outras combinações produzir axónios que são consideravelmente mais curto (Figura 1B, à direita). Além disso, os GDH mantidos em filtros estender mais e mais longos do que os axónios DRG cultivados na Figura 1C de plástico.
Filtros com poros de 1 m de diâmetro, utilizado no presente protocolo, reter corpos celulares no lado superior do filtro, enquanto que permite as neurites para crescer através dos poros e aumentar a superfície de fundo. Isto é claramente demonstrado por microscopia de epifluorescência de filtros para núcleos corados (DAPI) e β-III-tubulina Figura 1E. Em filtros intactas é possível observar os núcleos celulares, tanto de neurónios e não-células neuronais, concentradas no centro do explante e alguma irradiação a partir dele. No entanto, quando o lado de cima do filtro é raspado, núcleos de sumiram e apenas axónios podem ser detectados, em filtros de lado da parte inferior.
A Figura 1E mostra um exemplo de uma parte inferior do filtro, que originalmente sustentou o crescimento de cerca de 17 explantes. Neste exemplo, o lado de cima foi feita antes da fixação e, por conseguinte, o sinal de imunofluorescência representa axónios puros sobre o lado inferior do filtro. Extracção da proteína a partir de preparações axonais (lado inferior do filtro) está desprovido de proteínas nucleares Figura 1F, demonstrando que a preparação é isenta de corpos celulares. Alternativamente, quando se trabalha com a extracção de ARN, é possível confirmar a pureza da preparação axonal comparando a presença de ARNm diferencialmente localizada (isto é, γ-actina) entre os lisados de células inteiras e preparações axonais (como mostrado por outros 5
Poda desenvolvimento de neurônios sensoriais pode ser modelado em filtros submetidos ao fator de privação trófica. Depois de 2-3 dias de extensão axonal na presença de NGF, o meio é mudado para uma falta de NGF e que contém um anticorpo anti-NGF que será sequestrar qualquer remanescente Figura 2A NGF. Nos pontos de tempo desejado, os filtros são tratados de bioquímica ou imunocitoquímica.
A Figura 2B mostra exemplos típicos de lados inferiores dos filtros coradas para β-III-tubulina, antes e após a privação. Depois de 12 horas de privação há pouca fragmentação axonal, apesar de alguns axônios começar a mostrar beading. No entanto, a extensa degeneração axonal é alcançado após 36 de privação.
Wallerina degeneração induzida por transecção axonal de neurónios sensoriais é facilmente modelada em explantes cresceram em filtros por raspagem da face superior do filtro, deixando para trás o po distalrtion dos axónios que cresceram no lado inferior do filtro Figura 3A. Figura 3B mostra exemplos típicos de lados inferiores dos filtros coradas para β-III-tubulina antes e após axotomia em filtro. Em 3 horas após a axotomia, há pouca fragmentação, embora alguns axónios começam a mostrar perolização. Por 7,5 h, a maioria dos axônios são fragmentados ou completamente desaparecido. O pré-tratamento de explantes com nicotinamida adenina dinucleótido (NAD +, 5 mM, 30 min de pré-tratamento) protege contra a degeneração waleriana induzida em filtros, como acontece na outra in vitro e in vivo 19.
Figura 1. Inserções de filtro produzir grandes quantidades de preparações puras axonais. A) Um esquema de uma inserção (um), de uma inserção de um poço (b) e oconfiguração final com explantes DRG (c). B) O revestimento seqüencial de filtros com poli-D-lisina, laminina e colágeno resulta em explantes que crescem mais e mais longos axônios em comparação com as cultivadas com poli-D-lisina sozinho ou poli-D -lisina e de colagénio. As imagens foram produzidas por azulejos sobrepostos, imagens de baixa ampliação usando software de imagem. C) Sob as mesmas condições de revestimento de substrato, explantes DRG mantidos em filtros de mostrar o crescimento axonal consideravelmente mais exuberante do que explantes cultivados em plástico. D) A preparação axonal obtido por raspagem o lado de cima do filtro é desprovido de núcleos de células de E) Exemplo de axónios que se originou a partir de cerca de 17 explantes e cultivadas no lado inferior de um filtro 24 mm.. Tanto quanto 30 explantes pode facilmente crescer nestas preparações, originando o material axonal suficiente para abordagens bioquímicas comuns. F) imunoblots de lisados coll ected de topos de filtro contra o fundo de demonstrar que histona H3, um marcador nuclear, está confinada aos topos de filtro. O conteúdo de proteína total foi normalizada entre as diferentes amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O estudo da degeneração axonal induzida pela retirada fator trófico em elementos filtrantes. A) Esquema descrevendo uma experiência típica NGF-privação. Explantes DRG crescer axônios extensas na presença de NGF, e degenerar em cima NGF privação. B) Imagens representativas em diferentes ampliações (5X e 20X objetivos) de preparações axonal de explantes mantidos em NGF ou privadas de NGF para 12 ou 36 horas."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. O estudo de degeneração axonal Wallerina induzida por transecção axonal em inserções de filtro. A) Esquema descrevendo uma experiência axotomia típico. Axon separação é conseguido através da raspagem da face superior do filtro, deixando axónios cortadas (desprovidos de corpos celulares) no lado inferior. B) Imagens representativas de preparações axonais de explantes intactas ou após 3 ou 7,5 horas, após a transecção da presença ou ausência de 5 mM de NAD +. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Parâmetros importantes a ter em conta aquando da adaptação desta técnica incluem a população neuronal que vai ser estudado, o substrato, o tamanho dos poros do filtro e área de superfície. Todos estes parâmetros terá impacto sobre a especificidade, qualidade e quantidade da preparação neurite obtido e deve ser analisada com cuidado pelo usuário final. Nos exemplos apresentados neste protocolo, o uso de neurônios DRG tem a vantagem de estender apenas axônios, dando assim um puro preparação axonal (específico).
Crescimento axonal de DRGs embrionárias é muito rápido em comparação com os neurônios do sistema nervoso central, permitindo que amostras axonal a ser preparados após apenas 2 dias em cultura. O tamanho de poro de 1 mM provou suficientemente pequeno para impedir que corpos de células migrem para a superfície do fundo, enquanto permitindo a passagem eficiente de axónios em crescimento. Comparado com tamanhos menores disponíveis (ou seja, 0,4 mm) que não impõe seletividade para axônios finos.Para o estudo de explantes de DRG, a inserção do filtro de 24 mm (para uso em 6 poços de placas) produz quantidades suficientes de amostra de proteína para a maioria das técnicas de axonal, incluindo a imunoprecipitação, que muitas vezes requer uma grande quantidade de proteína de entrada. No entanto, os tamanhos menores (ou seja, inserções de filtro de placas de 12 poços) é adequado para algumas aplicações, especialmente se o uso de células e / ou imunocitoquímica dissociados.
Embora o filtro de isola eficientemente neurites de corpos celulares para análise, é importante notar que ambos os compartimentos partilhar o mesmo meio de cultura, o que limita as manipulações experimentais para tratamento de células inteiras. Outras abordagens de isolamento, incluindo câmaras Campenot compartimentadas ou câmaras de microfluídica, permite tratamento diferenciado dos diferentes compartimentos. O experimentador deve determinar qual destas técnicas de isolamento de células-compartimento é mais adequado para seu próprio projeto experimental específico.
Naturalmente, a capacidade de isolamento de inserções de filtro pode ser vantajoso para além degeneração axonal. Por exemplo, a bioquímica de regenerar a cones de crescimento pode ser facilmenteestudados por raspar a parte inferior do filtros com explantes DRG crescidos. Em poucas horas, os neurónios DRG axotomizados irá regenerar cones de crescimento no lado inferior dos filtros que, tal como descrito no presente protocolo, pode, então, ser isolado para a purificação de proteínas de regeneração do cone de crescimento. Além disso, as amostras axonais obtidos por este método pode ser analisado por transferência @ western @ que outros métodos bioquímicos. Por exemplo, axónios podem ser lisadas em RIPA ou CHAPS tampões de lise para obter uma amostra de proteína que pode ser ainda submetido a imunoprecipitação ou ensaios suspensos 9. Alternativamente, as amostras podem ser processadas axonal para extracção de ARN, como previamente descrito 5.
A vantagem do sistema de cultura apresentada não está limitada aos neurónios sensoriais. Por exemplo, os neurónios corticais dendritos e axónios que se formam sinapses no lado inferior do filtro 7. Assim, amostras de neurites puros (enriquecido com sinapses) pode ser isolated de corpos celulares para análises bioquímicas detalhadas dos processos que ocorrem exclusivamente em sinapses. O uso desta técnica é simples e não tem etapas críticas pendentes. No entanto, o comprimento axonal e morfologia é bastante sensível para a qualidade do revestimento dos filtros. Por isso, é preciso ter cuidado para utilizar novas soluções e homogêneos de revestimento para os montantes indicados de tempo para obter amostras axonal robustas e consistentes. O uso generalizado desta técnica vai ajudar a aumentar o nosso conhecimento da fisiologia dos axônios, em circunstâncias normais e na doença.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
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References
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