Introduction
Nöronların aksonal bölmesi somato-dendritik bölmesinden fonksiyonel bağımsızlık büyük derecesini gösterir. Projeksiyon nöronlarının olarak, aksonlar nöronal protein 1,2 çoğunu içerir. Son çalışmalar erken aksonal disfonksiyon nörodejeneratif hastalıklar ve nöropsikiyatrik bozuklukların 3 ortak bir özelliği olarak görünür olduğunu göstermiştir çünkü akson fizyolojisi ve fizyopatolojisi çalışma nörobilim toplumda ivme kazanmıştır. Bu normal ve patolojik koşullar altında akson-özel mekanizmaların daha iyi anlaşılması disfonksiyonu sürücü erken olaylara ışık tutacak gibi görünmektedir.
Mevcut protokol biyokimyasal için uygundur ve immünositokimyasal analizleri saf aksonal büyük miktarda malzeme elde etmek için gözenekli bir membran (filtre) taşıyan kültür ekler nasıl kullanılacağı açıklanır. Filtrenin kullanılması aksonal biyoloji ilk Steward tarafından yürütülen çalışma ekler veayrıca bugünkü yapılandırmasına Twiss ve arkadaşları 5 tarafından geliştirilen meslektaşları 4. ve. Bu teknik çalışılan nöronların nüfus için karşılamak için her durumda hafif modifikasyonlarla, akson ve dentrit biyoloji farklı yönlerini grup ile mevcut anda kullanımda, yapılan tedaviler ve biyokimyasal analizler type 6-9 kullanılır. Bu protokol uygulamaları gibi çeşitli tüm alternatifleri karşılamak niyetinde değil, bir çok uygulama için uygun olan basit bir yaklaşım sağlamaz. Özellikle, burada açıklanan protokol geri ve trofik faktörlerin 9 yoksun zaman daha hızlı dejenere az aksonlarını üretilen biyokimyasal analizler için aksonal verim maksimize ve literatürde tarif aksonal dejenerasyon-diğer kaplamalar incelemek için en uygun olan bir üçlü kaplama kullanır.
Bu prosedürde, nöronal hücre gövdeleri filtre wh üstünde izole edilmiş durumdaIle aksonlar gözeneklerinden geçmek ve taban yüzeyi boyunca büyür. Filtrenin alt yüzeyi üzerinde büyür (glia ve nöronal hücre gövdesi yabancı maddelerden arındırılmış) Saf akson biyokimyasal analizler için toplanabilir ya da in situ sabit ve imünositokimyasal teknikler 9 ile incelenebilir. Prosedür, arka kök gangliyon (DRG) embriyonik duyu nöronlarının kullanımına dayanır. Bu faktörün yoksun zaman hızlı bir şekilde geçmesi için dejenerasyon Embriyonik DRG'ler yaygın olarak sinir büyüme faktörü (NGF) tutulan zaman, bu hücrelerden nevritlerin in vitro olarak hızlı ve sağlam bir büyüme geçmesi için aksonal biyoloji incelemek için kullanılır ve. Bu yöntem ile toplanan tüm neurites saf aksonlar, böylece de, DRG nöronları, dendrit yoksundur.
Filtre uçlar aksonlarını incelemek için kullanılan diğer yöntemlere göre büyük bir avantaj oluşturmaktadır. Süreçleri olanlardan hücre soma meydana ayırt etmek için mikroskobu kullanımına dayanan çalışmalarXons sınırlı biyokimyasal bilgi sağlar. Başka bir örnek olarak, bölmeli kültür sistemleri (örneğin, 10 ya da Campenot odaları mikroakışkan cihazları 11) görüntüleme yaklaşımlara ve hücre bölmelerine ayırıcı tedavisi için yararlı olan, ancak gerekli biyokimyasal analizler için bu tekniklerin kullanımı engelleyen, aksonal malzemenin sadece küçük miktarlarda sağlamak numunenin, nispeten büyük miktarlarda. Dahası, bunların kullanımı önemli eğitim gibi özel cihazlar gerektirir ve zaman alıcı vardır. Genellikle Eksplantlardan aksonlarını izole etmek için kullanılan başka bir yaklaşım elle akson numune toplama önce (nöronal hücre gövdeleri içeren) bir eksplant merkezi kaldırmaktır. Bu akson zenginleştirilmiş preparatlar büyük miktarlarda üretmek de, bu hazırlanmasında aksonlar glia saran ve hızlı bir şekilde (en az bir deneyin bir örneği olarak) 6 kuyu art arda 20 eksplant bedenlerini çıkarılması olabilir, zaman alıcı ve fizibilite limitte.
Buna karşılık olarak, burada sunulan yöntem daha sonra western blot, immünopresipitasyon 6, kuzey blot 5 kütle spektrometrisi 6, RNA saflaştırma gibi sık bütün hücre lizatları analiz etmek için kullanılan hemen hemen her türlü biyokimyasal tekniği ile analiz edilebilir ve bol saf aksonal preparatlar üretir 7,12,13, ve diğerleri. Protokol, daha da IF ile incelemeye filtrenin alt tarafına büyüyen aksonlar düzeltmek için mümkün olduğu gibi, (IF) teknikleri bağışıklık uygulanabilir. Hiçbir hücre gövdeleri son hazırlık var çünkü bu yaklaşım büyük ölçüde aksonal özgü süreçlerin analizini kolaylaştırır. Hücre gövdeleri yüksek immunofluorescent sinyal çoğu muayene ve bu akson gibi ince yapılarından kaynaklanan bir zayıf sinyal analizi çürüten bu yana bu önemli bir avantajdır.
Aksonal dejenerasyon ar çalışma kültürü yöntemiyle İki uygulamalarıe tarif; gelişim budama ve yaralanma kaynaklı dejenerasyon modeli bir modeli (genel olarak Wallerian dejenerasyon anılacaktır). Gelişimsel budama modelleme in vivo duyusal nöronlar hedef türetilen NGF miktarlarda ve yeterli nörotrofık destek dejenere 14 almak için başarısız olan sınırlayıcı için rekabet olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Bu durum, in vivo olduğu gibi, vücut hücre yıkımı, ardından aksonal dejenerasyon başlatır, kültür ortamı, ikinci NGF çekilmesi ile DRG embriyonik kültürlerde taklit edilebilir. Wallerian dejenerasyona modellemek için, hücre gövdeleri ile filtrenin üst tarafı kazınarak. Fiziksel hücre gövdelerinden ayrıldı ve daha sonra, ilk olarak 1850 yılında 16 olgusunu bilgi A. Waller almıştır Wallerian dejenerasyon 15 olarak bilinen, hızlı ve stereotipik dejeneratif süreci, tabi olmak filtrenin alt tarafına büyümüştü aksonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdaki prosedürler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından onaylanan esaslara uygun olarak vardır. Tüm çabalar işlemler sırasında ağrı ve hayvanların sıkıntı en aza indirmek için yapılır.
Filtre 1. Kaplama
Not: Kültür filtre malzemeleri, çok-delikli plakalara yerleştirilir zaman, iki bölme tanımlanmaktadır: En iyi bölme elemanının üzerine bölgedir ve alt bölme, ekin Şekil 1A.ab aşağıdaki biridir. Eksplantlar bunlar filtrenin üst tarafına takmak üst bölmesine tohumlanır; Birçok aksonlar filtreden büyümesi ve alt bölme Şekil 1A.c içinde, filtrenin alt tarafında uzanır. (Örneğin kaplama çözeltisi, yıkama, kültür ortamı, vb uygulanması için) standart çalışma hacimleri alt bölme boyunca 2 ml ve üst bölmesi için 1 ml ve "olarak protokolde de ifade olacak, Standart hacimleri ". Eklemek ve kuyunun tarafı arasındaki boşluğa pipet ucu yerleştirerek alt bölme ile başlayarak çözüm ekleyin. Filtrenin alt sıkışmış olması kabarcıklarını önlemek için bir çözüm dağıtım yapılırken, bir tarafa ekleme yatırın.
- Filtreleri kaplama bir gün önce kaplanması başlayın. Steril doku kültürü kaputu altında, 6-çukurlu bir plaka içerisinde alan 24 mm filtre ekler yerleştirin. Alt bölmesine 2 mi ve üst 1 ml: Standart miktarlar kullanılarak oda sıcaklığında 1 saat için su içinde poli-D-lisin (1 mg / ml) ile inkübe ekler.
- Aspire poli-D-lisin ve su ile bir kere yıkayın. Aspire su, kapağını kapatın ve kaput O / N kurumaya plakaları bırakın Sıvıların aspirasyon sırasında, doğrudan filtre altında hapsolur sıvı kalıntısı kaldırmak için emin olun.
- Ertesi sabah, suda laminin (10 ug / ml) seyreltin ve sıcak karışım 37 ° C'de Cel 1 saat laminin ile uçlar inkübestandart birimleri kullanarak 37 ° C'de l inkübatör.
- Aspire laminin ve su içinde kolajen (0.1 mg / ml) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Bu durumda, üst bölmesinin alt bölmesi için 2 ml ve 2 ml kullanın.
- Aspire kollajen ve steril su ile bir kez yıkanır. ADIM 3 'de tarif edildiği gibi filtre, hemen kültür ortamı ve DRG eksplantlar almaya hazırdır.
2.. Diseksiyon Embriyonik Dorsal kök ganglion (DRG) Eksplantlarındaki
- Avertin (250 mg / kg) bir IP enjeksiyonu ile 13 günlük bir hamile bir dişi fare anestezisi. 10-15 dk bekleyin ve kornea ve pedal çekme reflekslerinin olmaması için kontrol edin. Refleksleri bir kez servikal çıkık gerçekleştirin.
- % 70 etanol ile tüm cerrahi aletler ve kadın karın dezenfekte edin. Araçlar kurumasını bekleyin. Karın cildi tutun ve karın boşluğuna maruz deri ve kas tabakaları kesti.
- Serviks ve yumurtalıklardan ayırarak rahim kaldırmak. Bir Steri içindele kaput, makas ile rahim embriyolar kaldırmak ve buz-soğuk L15 medya ile dolu bir Petri kabındaki onları toplamak. Buz üzerinde tutmak.
NOT: Gebeliğin 17,18 13 gün embriyo elde etme ile ilgili daha fazla ayrıntı için önceki teknik raporlara bakın. - Mikroskop altında, bir tarafta embriyo yatıyordu ve baş kaldırmak için küçük yaylı makas kullanın. Yan kenarları boyunca bir kesi göğüs, karın, bacak ve kuyruk atmak için emin olun. Tüm visseral organlar kadar ventral yan yattı ve kaldırmak omurgayı içeren geri tutun.
- Küçük yaylı makas ile, orta hat boyunca ventral tarafında omurga keserek tüm omurilik maruz. Forseps bir çift (# 3) ile karkas basılı tutun ve onun en rostral yönü ile omurilik tutmak için ikinci bir çift kullanın.
- Yavaş yavaş ve nazikçe vertebra boşluğundan kablosunu çekin ve ultra-ince forseps (# 5) kullanılarak omurilikten DRG'ler çimdik. Grup DRG'ler üzerinde toplanacakyemeğin alt.
- Onun açılış büyütmek için kesilmiş bir 200 ul pipet ile aspire göre gruplandırılmış DRG'ler toplayın. Bir tüp içinde DRG'ler yerleştirin ve DRG toplama bitene kadar buz üzerinde bırakın.
NOT: DRG'ler bu uç duvarlarına sopa yok, çünkü (standart sarı ipuçları kıyasla) Beyaz / saydam ipuçları tercih edilir. Medya ile Flushing ipuçları kullanmadan önce daha da duvarlara yapışmasını DRG'ler engeller.
Filtreler 3. Tohum ve sırt kök ganglion Eksplantlarından Bakım
- Standart birimleri kullanarak kaplanmış ekler için 37 ° C de tam DRG ortam ekleyin. NGF içermeyen üst bölmesi tutarken, NGF'nin 15 ng / ml 'si ile alt bölme ortamı Ek.
Not: NGF etkili bir filtre boyunca yayılır ve konsantrasyonu saat içinde dengeye da, doğrudan tohumlama yapılmadan önce alt bölüme NGF uygulanması önemli ölçüde b aksonal verimini artırır gözledikFiltrenin ottom yüzeyi. - Açıklığını büyütmek için kesilmiş bir ucu ile bir 1000 ul pipet kullanarak filtrelere tüpten DRG'ler aktarın.
- DRG'ler toplama önce uç 2-3x içine medya çizin. Bu, ucun iç tarafına yapışmasını engeller. Aynı ucu, tüm kuyuları için yeniden kullanılabilir. (Standart mavi ipuçları karşı) renksiz ipuçları kullanımı ucu yüzeye DRG yapışmasını azaltır.
- , DRG'ler aktarmak 800 ul pipet ayarlamak için. Aspire filtrenin üst tarafında medya yaklaşık 200 ul, sonra DRG içeren tüp gidin ve yukarı ve aşağı küçük bir hacim pipet - dibine battı DRG'ler tekrar süspansiyon. Bütün hacmi ve ucun ortasında ucu daldırarak pipet DRG'ler aspire.
- Bir kez tüm uçlar yüklenir, plaka kapağını kapatın ve plakayı 10x girdap, her girdap arasındaki kaput bankta hafifçe dokunarak. Bu hareketler yardım ederek akson verimi artırmak DRG eksplantlarında lavabo vefiltreye takın. Bu aynı zamanda farklı eksplantlardan aksonlar üst üste kalmamak eşit explant'larını dağıtmak yardımcı olur.
NOT: Bir önceki adımlarda açıklandığı eksplant tohumlama prosedür belirgin olarak alt-tabaka (% 75'e kadar) için eksplant eklenme genel hızını artırır. En önemlisi, pipetleme prosedür kolayca ortam yüzeyinde yüzen yerine ucun altına batmakta eksplantlar engeller. - Biyokimyasal analizler için, filtre başına (30 civarında) bir embriyo tohum DRG'ler. Morfolojik analizler için, yarım veya bir embriyo (10-15) DRG'ler üçüncü birini kullanın. Bir borunun tüm DRG (30, 15, ya da 10 DRG olup olmadığı), tek bir kuyunun içine ekilir, böylece bu karar, tüpler içine DRG'ler toplama önce yapılmalıdır.
- Her 2-3 günde bir ortam değiştirme, 37 ° C'de bir hücre kuluçka makinesi içinde kültürleri koruyun. Ortamı değiştirmek ilk üst bölmesini aspire, alt bölmesi izledi. Standart hacimde taze ortam eklemealt bölme ile başlayan s.
Not: kurutma hücre / aksonlar önlemek için, aynı anda birden fazla 3 uçlar ortamı değişmez. NGF varlığında filtreleri üzerinde yetiştirilen DRG'ler kültür içinde 2 gün sonra 2 mm'ye kadar ulaşan, uzun aksonlar uzanacaktır.
4. Trophic Faktörü Çekilme Tedavi
NGF çekilmesi bu ilk çekilmesinden sonra yaklaşık 12 saat belirir (IF faz kontrast ve β-III-tubulin tarafından belirlenir) aksonal parçalanma ile aksonal dejenerasyon neden olur. Tam parçalanma 36 saat ile elde edilir. Dejenerasyon deney tasarımına göre, son kullanıcı tarafından seçilecek olan ilerlemeye bırakılır ne kadar.
- 2 günlük aksonal genişleme safhasından sonra, NGF yoksun ve herhangi bir geri kalan (ya da endojen olarak üretilen) NGF'ye ayırmak için anti-NGF antikoru (1 ug / ml) içeren ortam için, üst ve alt bölmeleri ortam değiştirin.
- Izin vermek için hücre kuluçka makinesi (37 ° C) plakaları Dönüşİstenen zaman miktarı için devam etmek için NGF çekilmesi kaynaklı dejenerasyon.
- Western blot ile muayene için protein ekstraksiyon (6. adım) devam etmek veya doğrudan IF (adım 7) tarafından filtreleri incelemek.
5.. Aksonal Kesisi Wallerian Hastalığı tetikleyebilecek
Bu prosedür, hücre gövdesinden ayrılmış filtrenin alt tarafındaki aksonlar bırakır, ama aksi halde sağlam. Bundan sonra, bu aksonlar hızla Wallerian dejenerasyon başlatmak. İlk kesilerinden sonra 3 saat olarak görünen (IF faz kontrast veya β-III-tubulin kanıtladığı) aksonal parçalanma; 9 saat ile, aksonlar tamamen parçalanmış ve filtre ayrılır. Dejenerasyon deney tasarımına göre, son kullanıcı tarafından seçilecek olan ilerlemeye bırakılır ne kadar.
- Bir hücre kazıyıcı ile, DRG yetiştirilen eksplantlar ihtiva eden filtrenin üst kısmı kazıyın. X-, Y-ve dairesel olarak hareket eden kazıyıcı göre en malzemesinin tamamen çıkarılmasını sağlamaktarifi.
- Filtreden kazınır ve NGF (10 ng / ml) ihtiva eden önceden ısıtılmış tam DRG eden 1 ml'lik ortam ile değiştirin olan yüzen eksplantları ihtiva eden üst bölmesinden ortamı atın.
- Wallerian dejenerasyon, son kullanıcı tarafından seçilen bir zaman miktarı için devam etmesi için kuluçka makinesi (37 ° C) hücre plaka geri dönün.
- Western blot ile muayene için protein ekstraksiyon (6. adım) devam etmek veya doğrudan IF (adım 7) tarafından filtreleri incelemek.
Aksonal 6 Numunelerin. Protein Ekstraksiyonu
- Laemmli numune tamponu 75 ul ile toplama tüpleri (1.5 mi) doldurun. Filtrelerin tüm set aksonları hasat sırasında buz üzerinde tüpler tutun.
- PBS içinde DRG eksplant ile uygulanan filtre yıkayın ve filtrenin üst tarafını kazıyın. , Plakadan elemanını çıkartın bir pamuk uçlu aplikatör ile filtrenin üst kısmı temizlenir ve üst ve alt tarafı herhangi bir ek PBS aspire.
- Insert ters yerleştirinbankta aşağı ve keskin bir neşter kullanılarak ucun dışarı filtre kesti. Forseps, aşağıdan yukarıya ile filtre tutun. Makas ile filtrenin merkezine çevresi bir kesim yapın.
- Toplama tüpünün üstüne koyun filtre ve forseps ile, tüp aşağı filtrenin ortasına basın. Bunu yaparken, bir huni oluşturmalıdır. Bu Laemmli numune tamponu içinde kalmasını, böylece tüpün altına huni şekilli filtre itin.
- 4 dakika için kaynatma ile tüpler tam protein ekstraksiyonu. Tüpün üst içine baş aşağı yerleştirin forseps kullanarak ve kısa bir spin (15 saniye için 2,000 xg) sahne filtreyi kaldırmak. Kurutulmuş filtreler atın.
- Ilgi konusu proteinleri tespit etmek için western blot ardından SDS-PAGE ile protein aksonal preparasyon 10 ul giderin.
NOT: Bir referans olarak, 2 gün boyunca büyütüldü ve RIPA 100 ul içinde lize 20 eksplantlar bir akson hazırlama tamponu 4-6 'lik bir protein konsantrasyonuna sahip olacaktır lizisug / ul.
Filtreler Aksonlar 7. İmmünofloresan Sınavı
Aşağıdaki adımlar, β-III-tübülin tespiti ile örneklenen filtre ekler ilgili boyama IF gerçekleştirmek için genel manipülasyonlar özetlemektedir. Sabitleme, inkübasyon süresi, konsantrasyon ve diğer ayrıntılar diğer antijen-antikor çifti için optimize edilmelidir.
- Insertlerin aşağıdaki yıkama ve inkubasyon için iyice temizlendi, daha önce kullanılmış, 6 oyuklu plakalar, kullanmaktadır.
- Kısaca, PBS içinde ekler yıkayın. Karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde taze hazırlanmış% 4 paraformaldehid içinde tespit edin.
- Tespit edildikten sonra, kazıma ve filtrenin alt yüzeyine sadece büyümüş aksonlar toplamak için ucun üst tarafını temizleyin. IF standart inkubasyon ile devam edin.
- Hafif sallama ile oda sıcaklığında 1 saat için, standart miktarlar kullanılarak, (TBS,% 0.05 Tween 20,% 5 kaymağı alınmış süt) bloke etme çözeltisi olarak ekler inkübe edin.
- Transfer standardı birimleri kullanılarak, tampon (anti-β-III-tubulin, 1:5,000) engelleme seyreltilmiş birincil antikora ekler. Nazik çalkalama ile 4 ° C'de O / N-(~ 18 saat) inkübe edin.
- PBS (oda sıcaklığında 2 X 10 dakika) içinde iki kez ilk antikoru yıkanır.
- Transfer standardı birimleri kullanılarak, (1:2,000 keçi anti-fare) blokaj tamponunda seyreltilmiş floresan-konjuge sekonder antikor ile ekler. Hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca ışıktan kapalı inkübe edin.
- PBS (oda sıcaklığında 3 x 10 dakika) 'de ikincil antikor 3 kez yıkayın.
- IF tamamlandıktan sonra, dışarı eklemek çıkarmak son yıkama PBS uzak dökün ve bir pamuk uçlu aplikatör ile filtrenin üst tarafını temizlemek. Üst ve alt taraftan sıvı aspire.
- Yeri bankta baş aşağı yerleştirin ve keskin neşter ile ekin dışarı filtre kesti.
- , Forseps ile filtre tutun yukarı olumsuz ve mikroskopi slayt üzerine yerleştirin. Bir lamel ve floresan uyumlu mou ile Yerleşiminting ortamı. Işıktan kaplı soğuk odada kuru düz, olsun. Incelemek ve bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü yakalayabilir.
Not: 4 ° C'de saklanan ve ışıktan korunan, bu preparatlar floresans kaybıyla hafta içinde tutulabilir. - İSTEĞE BAĞLI: Seçenek olarak ise, IF insertin kaldırılmış filtreler üzerinde gerçekleştirilebilir. Bunu yapmak için, kazıma ve doğrudan tespit sonrası filtrelerin üst tarafını temizlemek.
- Bir altı plaka altındaki keskin bir neşter ve yer filtreleri akson-up ile uçlar dışarı filtreler alın.
- 7,4-7,8 ve 7,11 belirtildiği gibi Daha sonra, IF için inkübasyonlar gerçekleştirin. Bu alternatifin avantajı, örneğin, kuluçka hacimleri (7,1-7,11 gösterildiği gibi filtreler doğrudan ekler üzerinde lekeli kullanılan 3 ml kıyasla) 500 ul aşağı gidebilir, çünkü, reaktifleri kaydeder olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E13.5 farelerden alınan dorsal kök ganglion eksplantları kültür içinde 2 gün içinde 2 mm'ye kadar ulaşan, filtreler üzerine çok sayıda poli-D-lisin, laminin ve kolajen (Şekil 1B, sol) ile kaplanmış bir sekans büyür. Bu alt-tabaka kombinasyonu özellikle canlı büyümesi verir; Diğer kombinasyonlar oldukça kısadır aksonlarını verim (Şekil 1B, sağ). Ayrıca, filtre üzerinde tutulan DRG'ler plastik Şekil 1C yetişen DRG'ler daha fazla ve daha uzun aksonlar uzatmak.
Bu protokolde kullanılan çapı 1 um, neurites gözeneklerden büyümeye ve alt yüzeyi üzerinde uzanan için izin verirken, filtrenin üst tarafında hücre organları korumak gözenekleri olan filtreler. Bu durum, çekirdek (DAPI) ile β-III-tubulin Şekil 1D için boyandı filtreleri epifloresans mikroskobu ile gösterilir. Sağlam filtrelerde bu nöronların ve non-hem de, hücre çekirdeklerini gözlemlemek mümkündürondan eksplant merkezi ve bir ışınıma tabi tutulmak konsantre edildi nöronal hücreler,. Filtrenin üst tarafı kazınır Bununla birlikte, çekirdek filtreler alt tarafında, kayıp ve aksonlar tespit edilebilmesi bulunmaktadır.
Şekil 1E orijinal olarak yaklaşık 17 eksplantlannın çoğalmasını sürekli bir filtre alt bir örneğini göstermektedir. Bu örnekte, üst kısım tespit önce temizlenir ve bu nedenle immünofloresan sinyali filtrenin alt tarafına saf aksonlar temsil etmektedir. Aksonal preparatlar (Filtrenin alt tarafı) Protein ekstre hazırlama hücre gövdeleri serbest olduğunu gösteren, nükleer proteinler, Şekil 1F yoksun bulunmaktadır. RNA ekstraksiyonu ile çalışırken, alternatif olarak, diğerleri 5 ile gösterildiği gibi (farklı olarak lokalize mRNA varlığını bütün hücre lizatları ve aksonal preparatlar arasında (örneğin γ-aktin) karşılaştırarak aksonal hazırlanması saflığını teyit etmek mümkündür
Duyu nöronlarının Gelişim budama besinsel faktör yoksunluğu tabi filtrelerde örnek alınabilir. NGF varlığında akson uzantısı 2-3 gün sonra, ortam, bir NGF eksik ve herhangi bir geri kalan NGF Şekil 2A tecrit edecek bir anti-NGF antikoru ihtiva eden için değiştirilir. İstediğiniz zaman noktalarında, filtreler biyokimya veya immünsitokimya işlenir.
Şekil 2B, yoksunluk önce ve sonra β-III-tubulin lekeli filtrelerin alt tarafı tipik örneklerini göstermektedir. Bazı aksonlar boncuk göstermeye başlar rağmen mahrumiyet 12 saat sonra küçük aksonal parçalanma vardır. Ancak, kapsamlı aksonal dejenerasyon mahrumiyet 36 sonra elde edilir.
Duyu nöronlarının akson transeksiyonu neden Wallerian dejenerasyon kolayca uzak po geride bırakarak, filtrenin üst tarafı kazınarak filtreler üzerinde yetiştirilen eksplantlar modellenmiştir;Filtre Şekil 3A'da alt tarafında büyüdü aksonların rtion. Şekil 3B, önce ve in-filtre aksotominin ardından β-III-tubulin lekeli filtrelerin alt tarafı tipik örneklerini göstermektedir. Bazı aksonlar boncuk göstermeye başlar, ancak aksotominin ardından 3 saat sonra, çok az parçalanma yoktur. 7.5 saat, çoğu aksonlar parçalanmış veya tamamen gitti. Bu in vitro ve in vivo modellerde 19 Diğer olduğu gibi nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +, 5 mM, 30 dakikalık ön tedavi) ile eksplantların ön tedavi, filtreler üzerinde uyarılan Wallerian dejenerasyon korur.
Şekil 1. Filtre uçlar saf aksonal preparasyonlar büyük miktarlarda üretmek. Bir kuyu içinde bir ekleme yapılmış bir geçme yeri (a) A) bir şema, (b) veDRG eksplantlar (c). B) tek başına, poli-D-lisin ya da poli-D ile yetiştirilen kıyasla daha fazla ve daha uzun aksonlar büyümeye eksplantlarında poli-D-lisin, laminin ve kolajen sonuçları ile filtrelerin ardışık kaplama ile son konfigürasyon -lisin ve kollajen. Görüntüler aynı yüzey kaplama koşulları altında görüntüleme yazılımı. C) kullanarak örtüşen, düşük büyütme fotoğraf fayans tarafından üretilen, filtrelerde tutulan DRG dokusu) plastik. D yetiştirilen eksplantlarının çok daha fazla coşkulu aksonal büyüme göstermeye kazıma ile elde akson hazırlık filtrenin üst kısmı hücre çekirdeğinde yaklaşık 17 eksplantlar kaynaklanan ve bir 24 mm filtrenin alt tarafına yetiştirilen akson. E) Örnek yoksundur. Her ne kadar 30 kadar eksplantlar, hali hazırda bilinen biyokimyasal yaklaşımlar için yeterli aksonal malzeme elde edildi, bu terkiplerde büyüyebilir. Lizatlarının F) Muafiyet benekleri coll Seniyye dipleri karşı filtre üstleri histon H3, bir nükleer işaretleyici, filtre üstleri sınırlı olduğunu göstermektedir. Toplam protein içeriği farklı örnekleri arasında normalize edildi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2,. Aksonal dejenerasyon çalışma filtre ekler trofik faktörün çıkarılmasına neden oldu. A) Şema tipik bir NGF-yoksunluğu deney özetleyen. DRG eksplantlar) NGF muhafaza ya da 12 ya da 36 saat boyunca NGF yoksun eksplantlardan aksonal preparatlar farklı büyütmelerde Örnek görüntü (5X ve 20X hedefleri) NGF varlığında geniş aksonlar büyür ve NGF yoksunluğu. B üzerine dejenere."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3.. Filtresi ekler aksonal transection tarafından uyarılan Wallerian aksonal dejenerasyon çalışması. A) Şema tipik bir aksotomi deney özetleyen. Axon kesilmesi, filtrenin üst tarafı kazıma. B alt tarafta kesik aksonlar (hücre gövdeleri yoksun bırakarak)) sağlam eksplantlardan aksonal preparatlarının Örnek görüntüler ya da varlığında veya yokluğunda transeksiyonu sonra, 3 ya da 7.5 saat sonra elde edilir NAD + 5 mM. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik uyarlama dikkate almak için önemli parametreler, incelenecek olan nöron popülasyonu, alt-tabakanın, filtrenin gözenek boyutu ve yüzey alanı bulunmaktadır. Tüm bu parametreler elde edilen nörit hazırlama özgüllüğü, kalite ve miktar etki edecek, ve son kullanıcı tarafından dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Bu protokolde yer alan örneklerde, DRG nöronlarının kullanımı, böylece, saf (özel) aksonal hazırlama vermek için sadece aksonlar uzanan avantajına sahiptir.
Embriyonik DRG'ler aksonal büyümesi çok hızlı aksonal örnekleri kültür içinde sadece 2 gün sonra hazırlanacak sağlayan, merkezi sinir sistemi nöronları ile karşılaştırılır. 1 um'lik gözenek boyutu büyüyen aksonların etkili geçişine izin verirken alt yüzeyinden nüfuz eden hücre gövdeleri önlemek için yeterince küçük olduğu kanıtlanmıştır. Mevcut küçük boyutlarda (yani 0,4 mikron) göre ince akson için seçicilik empoze etmez.DRG eksplant çalışma için, (6-kuyu plakaları içinde kullanım için) 24 mm filtre elemanı, genellikle protein girişinin büyük miktarda gerektirir immüno de dahil olmak üzere pek çok teknikler için, aksonal protein numunesinin yeterli miktarda üretir. Ancak, daha küçük boyutlarda (12 oyuklu plakalar için, yani filtre parçaları), özellikle ayrışmış hücreleri ve / veya immünsitokimya kullanarak, bazı uygulamalar için uygundur.
Filtre elemanı etkin bir inceleme için hücre gövdelerinden nevritler izole olmasına rağmen, her iki hazne de bütün hücre tedavilere deney manipülasyonlar sınırlayan, aynı kültür ortamı paylaştığını not etmek önemlidir. Bölümlere Campenot odaları veya mikroakışkan odaları da dahil olmak üzere diğer izolasyon yaklaşımlar, farklı bölümlerden farklı muamele için izin verir. Deneyci kendi özel deneysel tasarım için en uygun olan bu hücre bölmesi izolasyon teknikleri belirlemek gerekir.
Tabii ki, filtre insertlerin izolasyon yeteneği aksonal dejenerasyon ötesinde avantajlı olabilir. Örneğin, büyüme konileri yenileyici biyokimya kolay olabilir,yetişkin DRG eksplantlarıyla filtrelerin alt tarafını kazıma tarafından incelenmiştir. Saat içinde, axotomized DRG nöronları, bu protokolde tarif edildiği gibi, daha sonra büyüme konisi yenileyici proteinlerin saflaştırılması için izole edilebilir filtrelerin alt tarafında büyüme konileri yeniden oluşturulur. Ayrıca, bu yöntemle elde edilen numuneler aksonal western blot başka biyokimyasal yöntemlerle analiz edilebilir. Örneğin, aksonlar ayrıca immüno veya açılan deney 9 tabi tutulabilir bir protein örneği elde etmek için ya da RIPA liziz CHAPS tamponlar içinde lize edilebilir. Seçenek olarak ise, aksonal numuneler daha önce tarif edildiği gibi 5, RNA ekstraksiyonu için işlenebilir.
Sunulan kültür sisteminin avantajı, duyu nöronlarının ile sınırlı değildir. Örneğin, kortikal nöronlar, filtrenin 7 alt tarafında sinaps oluşturacak dendrit ve aksonlar uzanacaktır. Bu nedenle, (sinaps ile zenginleştirilmiş) saf nörit örnekleri yalıtımlı olabilirsinapsların sadece gerçekleşecek süreçlerin ayrıntılı biyokimyasal analizler için hücre gövdeleri ed. Bu tekniğin kullanımı basittir ve hiçbir olağanüstü kritik adımlar vardır. Bununla birlikte, aksonal uzunluğu ve morfoloji filtrelerin kaplamanın kalitesine oldukça duyarlıdır. Bu nedenle, bakım, sağlam ve tutarlı aksonal örnekleri almak için zaman belirtilen miktarda taze ve homojen kaplama çözümleri kullanmak için alınmalıdır. Bu tekniğin yaygın kullanımı normal şartlar altında ve hastalık, akson fizyolojisinin bilgimizi yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
