Summary
线虫通常生长在固体琼脂平板或液体培养基接种大肠杆菌大肠杆菌 。为了防止细菌副产品混杂毒理学和营养研究，我们利用的无菌液体介质，CeHR，成长和同步大量的蠕虫病毒对各种下游应用。
Abstract
在这个协议中，我们提出了所需的材料，并作出修改C程序的。Ëlegans习惯化和媒介的复制（mCeHR）。此外，该步骤用于暴露和驯化C。生长在大肠杆菌线虫大肠杆菌对无菌液体介质描述。最后，利用无菌C.下游实验线虫说明这个程序的优点。分析并确定C的能力线虫营养需求是由不断增长的N2野生型蠕虫在无菌液体介质具有不同的血红素浓度的说明。这个过程可以与其它营养物质被复制到确定为蠕虫生长和发育的最佳浓度，或者确定药物治疗的毒理效应。不同的血红素浓度对野生型蠕虫生长的影响，通过定性显微镜观察和定量t一下确定他的蠕虫病毒，在每个血红素浓度上升的。此外，不同的养分浓度的影响可以通过利用表达的变化感兴趣的养分回应荧光传感器蠕虫检测。此外，大量的蠕虫被容易地制造，适用于使用微粒轰击转基因线虫的产生。
Introduction
土壤线虫， 线虫 ，是在众多的研究中所使用的遗传毒理学一个强大的模式生物。作为其第1 mm的尺寸，四天，便于栽培的快速生成时间，以及大的后代数量结果，这些线虫已被用于许多遗传和药理屏1,2。研究人员利用这个蠕虫利用来识别分子和保守的途径在脊椎动物系统。这些途径包括细胞死亡信号，老化和促进新陈代谢的途径，以及神经系统3-6。另外，C的透明度线虫允许使用荧光蛋白记者，它可以直接可视化，分 析基因表达模式和蛋白质定位的转基因品系的产生。
在许多研究中这种线虫培养使用线虫生长培养基（NGM）板一个固体琼脂为基础的表面或升iquid培养物接种有大肠杆菌作为食物来源7,8。这些细菌的食物来源可以混淆生化和毒理学研究，细菌副产品影响结果的解释干扰。为了避免这些复合效应，C.线虫可以培养在无菌液体介质内，不含细菌作为食物来源的。使用这种媒体，我们成功地培养数以百万计的高度同步的蠕虫许多标准C。线虫协议，包括在C差异调节基因芯片分析线虫暴露于不同浓度的血红素和生产利用基因轰击转基因蠕虫。这种介质化学定义和由埃里克·克莱格博士9制定了原来的配方修改。使用这种mCeHR媒体，我们已经成功地确定参与血红素的动态平衡的基因，称为血红素反应基因（HRG次）10，其将还没有可行的，其中利用接种有大肠杆菌 NGM琼脂平板上正常生长条件大肠杆菌 。
在这个协议中，我们描述的程序，引入和维护C。生长在大肠杆菌线虫大肠杆菌的无菌mCeHR并利用此方法来获得大量的蠕虫病毒用于生产转基因C。使用微粒轰击线虫线。这表明使用无菌介质中，用于确定C的营养需求的效用，我们也存在研究线虫利用血红素作为一个例子。这些研究表明，利用mCeHR介质允许对大量C的快速增长线虫由蠕虫的研究人员利用许多下游应用。
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Protocol
1，蠕虫菌株
- C.获得线虫野生型布里斯托尔 N2菌株的秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）（http://www.cbs.umn.edu/cgc），并保持他们在NGM板接种大肠杆菌大肠杆菌菌株OP50 7。注意：转基因虫株IQ6011（Phrg-1 :: GFP），如前所述11利用所产生。 IQ6011可从相应的作者提出要求。
2：改性C的线虫居住和繁殖培养基（mCeHR）
准备mCeHR液体介质所描述的12岁以下。这种无菌液体介质允许蠕虫无需任何额外的食物来源增长。进行使用严格的无菌条件下，例如在层流罩无菌液体培养基和无污染的蠕虫的所有操作。
- 获得超巴氏杀菌脱脂牛奶从一家杂货店。使用冷藏亲管而不是室温产物。此前在mCeHR媒体，连胜用琼脂平板上脑心浸液（BHI）牛奶和孵化3天在30°C和37°C到检查不育。奶转移至50毫升无菌试管中并储存于-80℃下
- 准备以下每个组件，并结合顺序并给予准备1升mCeHR量（ 表1A）：10毫升2毫米胆碱二酸柠檬酸，将10毫升的维生素和生长因子组合（见配方表1B），将10ml 2.4毫肌醇 ，将10毫升2毫氯高铁血红素，氯化加入250毫升去离子水。通过0.22μm过滤器单元施加吸力和过滤器。
- 加入20毫升的核酸混合物（配方见表1C），加入100毫升矿物组合（配方在表1D），20毫升170毫克/毫升的乳清蛋白水解物，加入20ml的必需氨基酸，将10毫升的非必需氨基酸的酸，将20ml的450 mM的KH 2 PO 4，加入50ml 1.45 M D-葡萄糖，加入10ml 1M的HEPES，钠盐，加入250毫升去离子水。
- 适用于吸入到过滤消毒的组件。取下过滤器，并加入1毫升5毫克/毫升的胆固醇。确保介质的pH值约为6-6.5。注：此溶液可以贮存于-80℃下长达一年。
- 添加20％（V / V），超巴氏杀菌的有机脱脂牛奶的mCeHR介质后方可使用。开等分牛奶时，使用严格的无菌技术（例如在层流罩）。存储介质在4°C。
3，准备C.线虫文化在无菌mCeHR液体培养基
- 生长在1060毫米NGM板蠕虫直到有许多妊娠蠕虫和OP50 大肠杆菌的最小量大肠杆菌在板上。
- 通过用5毫升的M9缓冲液（配方见表1F）漂洗各板取出的蠕虫，并结合在50ml锥形管中。
- 允许蠕虫为settle通过离开管静置5〜10分钟，然后小心地取出含有大肠杆菌上清液大肠杆菌 。
- 重复步骤3.2和3.3倍持续的过程之前，除去尽可能多的剩余细菌的可能。
- 悬浮在0.1N的NaCl的蠕虫在一个体积是3的倍数，例如1.5毫升3毫升或6毫升其中个别蠕虫可在管看出。
- 通过加入5 1N NaOH和5％的次氯酸钠在1点02分06秒比对虫悬浮液（漂白剂）溶液漂白蠕虫。例如，加入1ml 5的1N NaOH：2毫升5％次氯酸钠：6毫升蜗杆悬浮液。添加到蠕虫停牌前混合NaOH和漂白剂。
- 涡旋该溶液大力直到妊娠蠕虫溶解并只蛋的悬浮液（约5至10分钟）内可见。监视用相衬显微镜用10X物镜的过程。
- 之后，蠕虫已经完全溶解后，立即将沉淀鸡蛋在800×g离心45秒，在4°C。除去上清液，并用10ml无菌水通过离心沉淀，在800×g离心45秒，在4℃下冲洗沉淀两次
- 漂白后，卵丸粒转移到含有10ml补充有100微克/毫升四环素mCeHR媒体的25cm 2组织培养瓶。采用无菌技术进行此过程。如果需要，添加更多的抗生素，包括250微克/毫升萘啶酸，以防止细菌生长在无菌液体培养。
- 孵育所述液体培养物在20℃下在一个摇动的培养箱中在约70转每分钟。
- 检查蠕虫日常要注意发展阶段和增长速度。
注：蠕虫最初将生长缓慢，需要7〜10天，成为妊娠。然而，由于蠕虫使其恢复到液体培养基中的世代时间将减少到大约4天的野生型（N2）的蠕虫。 - 之后，蠕虫有德韦大步，以在液体介质中的妊娠阶段，蠕虫培养转移到锥形管中，并使用吊桶式转子在4℃下沉淀的蠕虫在800×g离心5分钟。
- 去除上清，并轻轻重悬沉淀蠕虫中的0.1M NaCl的相同体积。例如，使用10 ml 0.1 M氯化钠蠕虫在10毫升mCeHR的培养。允许蠕虫定居5分钟冰上。
- 进行与步骤3.5-3.8上述的漂白过程，并允许蠕虫在无菌液体培养基中生长的第二代。如果有必要，再加入抗生素以抑制细菌的生长。
- 再次使蠕虫成为妊娠然后如步骤3.12和3.13中所述沉淀和重新悬浮的蠕虫在0.1M NaCl的，如在步骤3.5-3.8中所述，然后再漂白，以产生一个同步的人口。生长在液体介质中的L1幼虫蠕虫不从现在开始抗生素。
4，同步从液体蠕虫文化
- 颗粒和悬浮在步骤3.12和3.13上述在0.1 M氯化钠的蠕虫。按照步骤3.5-3.8上述漂白剂。
- 重悬卵沉淀在10毫升M9的缓冲区，并允许幼虫孵化O / N在20°C在一个旋转平台摇床。注：卵孵化成幼虫的L1，但不会进一步发展，在L1阶段同步蠕虫。
- 保持和继代培养的蠕虫，沉淀的L1幼虫在800×g离心5分钟，然后重悬幼虫在10毫升mCeHR的，并转移到的25cm 2烧瓶中。允许蠕虫在20℃旋转平台上的成长。维持3000蠕虫/毫升/厘米2的最大密度，以确保足够的营养的蠕虫。
注：在此阶段，抗生素不能当程序进行了使用在层流罩无菌技术，以保持无菌条件要求。蠕虫应每天检查监测的增长。
5，免费用于无菌培养基培养子弹声和解冻蠕虫
- 冻结无菌异步蠕虫病毒培养或在液氮中同步L1幼虫。沉淀的蠕虫在800×g离心5分钟，然后以0.5毫升每小瓶悬浮S中缓冲液（6.45毫KHPO 4，43.55毫KHPO 4，146.25 mM氯化钠）。添加第缓冲器等体积的含30％体积/体积甘油到每个小瓶中，前长期储存在液态氮的蠕虫转移到-80℃。冻结每毫升在每个小瓶中约1×10 6个蠕虫。
- 通过培养瓶中，在37℃下进行约2分钟，直到几乎所有的冰的融化解冻蠕虫。在层流罩，蠕虫转移到含有mCeHR无菌瓶中，把它们摆放在20°C
6，确定高铁血红素浓度对生长及繁殖的mCeHR的影响
- 使用无菌mCeHR媒体来测定C的营养生长依赖线虫 。为了确定影响Ø对蠕虫生长和发育f血红素浓度，使用同步无菌氮气蠕虫或感兴趣的其他菌株。如第4段所述的L1幼虫同步。
- 在接下来的一天，小球和计数同步L1幼虫并稀释至1蠕虫每微升无菌介质中。使10mM的氯高铁血红素氯在0.3M的NH 4 OH，用浓盐酸调节pH至8。
- 加入800微升mCeHR媒体的24孔板。加100蠕虫向每个孔中加入100μl的介质。在浓度范围为0μM，1.5μM至1,000μM，一式三份添加氯化高铁血红素到每个孔中。确保所有孔中含有0.3M的NH 4 OH的浓度相同。吹吸，以确保100 L1幼虫被加入到每个孔之前轻轻重悬的蠕虫。
- 每天检查蠕虫，并注意在每口井的增长在每个浓度。计数的蠕虫数目后孵育9天，并绘制对应于每个血红素蠕虫/毫升数浓度（ 图1）。
氯化血红素浓度7。对血红素传感器蠕虫影响
- 含孵 育4同步L1血红素传感器蠕虫（Phrg-1 :: GFP）在mCeHR微米，8微米，10微米和20微米高铁血红素。
- 图片用荧光共聚焦显微镜，48小时培养后（ 图2）的蠕虫。
8，利用mCeHR产生转基因C。线虫使用微粒轰击
注意：用于生成和执行微粒轰击使用UNC-119（ED3）中mCeHR蠕虫生长在图3中13中概述的步骤。
- 蠕虫准备
- 将大约1×10 6异步UNC-119（ED3）蠕虫在90ml mCeHR媒体在175 平方厘米瓶前一周轰击。允许蠕虫生长在20°C O呐晃动平台〜70转（ 图3-1）。
注：一个星期后，该蠕虫密度应显著大于许多成年妊娠蠕虫。约3×10 7个蠕虫将需要用于微粒轰击。 - 寒意JM109 大肠杆菌大肠杆菌接种于冰上10厘米NGM板。
- 转让无菌蠕虫两个50毫升锥形管和离心蠕虫在800×g离心2分钟。吸去上清，重悬在每个管中的蠕虫在50毫升M9缓冲液（ 图3-2）。
- 允许成虫通过重力沉淀为10至15分钟，在冰上。
注：2毫升颗粒现在应该包含> 90％的成虫。这2毫升颗粒应该有大约5×10 6蠕虫和足以让一个微粒轰击。 - 大衣冷冻JM109的整个表面接种NGM板与2毫升颗粒蠕虫。允许被完全吸收的液体，然后离开板对投诉进行（ 图3-3）前30分钟在冰上。
- 将大约1×10 6异步UNC-119（ED3）蠕虫在90ml mCeHR媒体在175 平方厘米瓶前一周轰击。允许蠕虫生长在20°C O呐晃动平台〜70转（ 图3-1）。
- 金颗粒的制备
- 称量金颗粒30毫克成硅化离心管中。加入1 ml 70％的乙醇和旋涡振荡管5分钟。
- 允许管坐15分钟，然后离心以6,000×g离心10秒以沉淀的金颗粒。使用移液管尖端通过仔细触摸笔尖管相反的一侧的金颗粒去除上清。
- 用1毫升无菌水，涡旋混合1分钟洗涤金颗粒并短暂离心管中以6000×g离心10秒。重复该洗涤步骤两次，然后重悬金颗粒在0.5ml的无菌50％的甘油。
注意：在金颗粒的最终浓度为60毫克/毫升，它可以在4℃下存放1至2个月
- 准备DNA的金颗粒混合
- 结合10微克所要的质粒DNA与10及＃956;克硅化1.5 ml离心管的UNC-119救援质粒。加入50微升的去离子水和100μl的良好悬浮的金颗粒溶液，然后涡旋混合1分钟。
- 加入150μl的2.5M的CaCl 2并再次旋涡振荡溶液1分钟。向此溶液中，加入60微升的0.1M亚精胺并涡旋混合3〜5分钟。
- 脉冲离心溶液以6,000×g离心10秒，去除上清液，加入300μl的70％乙醇中。旋涡以及1分钟，脉搏离心机在6000×g离心，去除170微升100％乙醇的上清，重悬。大力旋涡振荡5〜10分钟，然后离心脉冲，去除上清溶液。
- 轰击（ 图3-3）
注：此协议进行了材料/设备表中指定的粒子输送系统。遵循颗粒输送设备中可用的指令。- <LI>将薄纸片成15厘米的板。使用镊子，浸7大载体分别为100％的乙醇，奠定他们在组织干。
- 彻底清洁基因枪室，大载体支架和目标板用70％乙醇。清洁和高压灭菌每个轰击过程之前停止屏幕。
- 加载macrocarrriers到使用镊子，然后按入底座使用该座位工具的持有人。
- 均匀地散布20微升DNA包被的金颗粒在每个大载体的中心，然后使溶液完全干燥。
- 清洁压力分压器与乙醇的两部分，并组装用乙醇清洗破裂盘。螺丝组装压力分频器和爆破片入轰击室。
- 组装的蒸压停止屏与大载体支架和放置设备上所需的金属架子和锁定到位。
- 将组装好的MACRocarrier设备进入下面的压力分配器所分配的时隙基因枪腔和配合的压力分频器。
- 大盘开NGM板的蠕虫到目标板架，并关闭该室的门。
- 轰击蠕虫，调整压力至该打破断裂盘需要的。打开真空至28英寸汞柱的压力，然后按下开火按钮，直到磁盘破裂。
- 释放真空并从装置中取出NGM板。从板块洗净蠕虫和再分配中接种JM109 大肠杆菌 2010厘米NGM板大肠杆菌 （ 图3-4）。
- 允许蠕虫生长10〜14天，在25°C和饿死的板块。蠕虫从UNC-119缺陷救出将具有正常运动，并且可以在此时被识别。因为这些代表独立的转基因株系（FIGUR挑选单独的板块至少10“野生型”蠕虫病毒的进一步分析Ë3-5）。
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Representative Results
C.培养在营养成分的测定无菌液体介质辅助工具所要求的蠕虫，而不由大肠杆菌产生的次生代谢产物的干扰线虫大肠杆菌 。野生型N2蠕虫使其恢复到mCeHR媒体三代以内并呈增长媲美生长在NGM细菌平板蠕虫。事实上，这些蠕虫成为4天内为带有3.5天，生长在OP50细菌的蠕虫相比，妊娠。
使用mCeHR的一个优点被认为在研究，审查这些蠕虫14的确切营养需要。在图1中的蠕虫生长在mCeHR补充有增加血红素的量，可达1毫米。这些蠕虫的观察有明显的延迟增长低于4微米血红素浓度，以虫子发展到L4幼虫阶段，但无法在后mCeHR九天进步到妊娠阶段。以10μM和20的浓度56，M血红素蠕虫发展到在4天内的妊娠阶段，并产生大量后代。后代的最大数量，当蠕虫生长在mCeHR含有20微米血红素被看见。蠕虫继续在100微米和500微米血红素开发和生产的后代。然而，幼虫后代的数目显著下降相比，以20μM的血红素的最佳血红素浓度下生长的蠕虫。血红素浓度等于或高于800μM导致发育不良，病弱的蠕虫在L3幼虫阶段，这表明这些血红素浓度有毒的蠕虫。
除了 在确定最佳血红素浓度和亚铁血红素剥夺和血红素毒性对C的影响线虫生长，血红素记者菌株可以利用较小的浓度范围内，以间接评估蠕虫的血红素状态。该IQ6011蠕虫是一种蠕虫病毒的转基因表达血红素应答转录记者，P HRG-1 如图2所示。GFP的表达被抑制在20μM血红素并且随着血红素浓度降低。在血红素浓度的增量变化可以准确地关联与在mCeHR媒体基因的反应和表达。
除了能够仔细地控制提供给蠕虫的营养浓度，mCeHR无菌介质使得大量的同步蠕虫的有效增长。此功能可开采微粒轰击（ 图3）。使用此程序中的至少一个集成线已制定了从进行每微粒轰击（ 表2）。
图1。C.线虫血红素生长曲线。蠕虫生长在一个范围内血红素浓度从0至1,000μm的mCeHR 9天。在每个浓度的蠕虫数目进行计数，并绘制。在1.5微米血红素浓度蠕虫是L4和无法进一步发展。在800微米血红素的蠕虫发育迟缓在L2-L3阶段，表明血红素的毒性作用。
图2。响应血红素传感器（Phrg-1 :: GFP）的菌株不同血红素浓度mCeHR。同步转基因C。线虫表达HRG-1 :: GFP生长在补充有4 mCeHR媒体，8，10或20μM的血红素48小时。图像用蔡司LSM 710 confoca升显微镜。比例尺为100μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3示意C.微粒轰击线虫使用mCeHR成长UNC-119蠕虫。（1）约3×10 7 UNC-119（ED3）蠕虫生长在90ml mCeHR媒体。 （2）Gravids被允许在50ml锥形管中沉降在冰上10-15分钟。 （3）2毫升的颗粒约5×10 6妊娠蠕虫被均匀分布到一个非种子选手NGM板。该蠕虫被轰炸12微克的UNC-119救援质粒络合到金颗粒的利益质粒和6微克。 （4）T他炮轰蠕虫被分割到2010厘米接种大肠杆菌板大肠杆菌菌株JM109中。 （5）经过2周的潜伏期，在25℃，板与野生型虫被选定为的转基因表达强度和偏析率分析。
| 表1A | |
| CeHR，1升 | |
| 使用无菌技术和一个1升（0.22μm）的真空过滤装置，过滤原液和水的下面的卷中描述的顺序。 | |
| 胆碱二酸柠檬酸 | 10毫升 |
| 维生素和生长因子组合 | 10毫升 |
| 肌醇 | 10毫升 |
| 氯化高铁血红素 | 10毫升 |
| 去离子水 | 250毫升 |
| 核酸组合 | 20毫升 |
| 矿物组合 | 百毫升 |
| 乳清蛋白水解物 | 20毫升 |
| 必需氨基酸混合 | 20毫升 |
| 非必需氨基酸混合 | 10毫升 |
| KH 2 PO 4 | 20毫升 |
| D-葡萄糖 | 50毫升 |
| HEPES，钠盐 | 10毫升 |
| 去离子水 | 250毫升 |
| 量将800毫升在这一点上 从真空去除过滤单元再加入： | |
| 胆固醇 | 1毫升 |
| 超巴氏杀菌脱脂牛奶 | 200毫升 |
| 表1B | |
| 维生素和生长因子混合，加入100毫升 | |
| 解决方案1：到了60毫升水加： | |
| N-乙酰基-α-D-葡糖胺 | 0.15克 |
| DL-丙氨酸 | 0.15克 |
| 烟酰胺 | 0.075克 |
| D-泛硫乙胺 | 0.0375克 |
| DL-泛酸，半钙盐 | 0.075克 |
| 叶酸 | 0.075克 |
| 吡哆胺2HCl分析 | 0.0375克 |
| 盐酸吡哆醇 | 0.075克 |
| 黄素单核苷酸，钠盐 | 0.075克 |
| 盐酸硫胺 | 0.075克 |
| 解决方案2：准备下列化学品在5毫升1-KOH： | |
| 对氨基苯甲酸 | 0.075克 |
| D-生物素 | 0.0375克 |
| 氰钴胺素（B12） | 0.0375克 |
| 亚叶酸钙盐 | 0.0375克 |
| 烟酸 | 0.075克 |
| 吡哆醛-5 - 磷酸 | 0.0375克 |
| 解决方案3：0.0375克（±）α-L-硫辛酸，在1ml乙醇氧化形式： | |
| 结合的解决方案1，2和3以及使终体积到100毫升。避光于4℃或冷冻分装于-20°C。 使少量的股票为这个组合，从而它正在迅速使用。 | |
| 表1C | |
| 核酸混合，加入100毫升 | |
| 到60毫升水加： | |
| 腺苷5'-单磷酸，钠盐 | 1.74克 |
| 胞苷5'-磷酸 | 1.84克 |
| 鸟苷2' - 和3'-单磷酸 | 1.82克 |
| 或 | |
| 鸟苷5'磷酸 | 2.04克 |
| 尿苷5' - 磷酸二钠盐 | 1.84克 |
| 胸腺嘧啶（最后添加） | 0.63克 |
| 把解决方案至100毫升，并存储在黑暗中在4℃或冷冻分装于-20°C。 使少量的股票为这个组合，从而它正在迅速使用。 | |
| 矿物组合，1升 | |
| 氯化镁2•6H 2 O | 4.1克 |
| 柠檬酸钠 | 2.9克 |
| 柠檬酸钾一水合物 | 4.9克 |
| 氯化亚铜2•2H 2 O | 0.07克 |
| 的MnCl 2•4H 2 O | 0.2克 |
| 氯化锌 | 0.1克 |
| 的Fe（NH 4）2（SO 4）2•6H 2 O | 0.6克 |
| 氯化钙2•2H 2 O（随时添加最后一个） | 0.2克 |
| 使少量的股票为这个组合，从而它正在迅速使用。 | |
| 其他组件 | |
| KH 2 PO 4 | 450毫米 |
| 胆碱二酸柠檬酸 | 2毫米 |
| 肌醇 | 2.4毫米 |
| D-葡萄糖 | 145万 |
| 氯化高铁血红素 | 2mM的在0.1N的NaOH pH 8.0的 |
| HEPES，钠盐 | 1米原液 |
| 胆固醇 | 5毫克/毫升在乙醇中 |
| 乳清蛋白水解酶 | 170毫克/毫升 |
| 表1F | |
| M9缓冲液，1升 | |
| KH 2 PO 4 | 3克 |
| 的Na 2 HPO 4 | 6克 |
| 氯化钠 | 5克 |
| H 2 O的 | 1升 |
| 高压灭菌30分钟 | |
| 1M的用MgSO 4（无菌） | 1毫升 |
表1配方。为mCeHR和mCeHR的组件。
| 轰击 | 线与野生型救援 | 线救援/转基因 | 稳定线 |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| 平均 | 4.8 | 3.2 | 1 |
表2。AVERA转基因C的GE数使用微粒轰击线虫产生。
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Discussion
在这个协议中，我们提出一个修改的无菌液体介质mCeHR，允许快速下线虫一代生产大量的蠕虫病毒。该媒体展示了几个优点蠕虫生长没有污染E。大肠杆菌或细菌的副产品和可被利用的营养和毒理学研究。利用E的大肠杆菌或其他细菌在这些研究中有几个缺点。例如，细菌的生长可以在各种条件下的改变和细菌代谢可能正在检测的分子，混杂结果的解释。因此，在确定的培养基中的发展进行这些研究是非常有利的。
虽然C。线虫已经生长在液体培养基中在以前的研究15中，C.生长蠕虫线虫维持液（CEMM）表现出明显的延迟产生时间16，不像我们OBSERVE在mCeHR媒体。我们的主要目标是利用C。线虫来研究营养平衡，特别强调血红素和金属新陈代谢。考虑到这一点，mCeHR，并由本集团产生的修改实现这一目标，并直接导致了一些需要保持动态平衡血红素在蠕虫，并最终在脊椎动物模型系统17，18基因的鉴定。重新mCeHR-1的媒体也可以利用为其他线虫种类包括Panagrellus升平，Oscheius myriophila，和C。 remanei。除了 低金属配方mCeHR-2和mCeHR-3可被利用在研究探讨重金属毒性和要求12。
之前驯化，N2蠕虫表现出约7至10天在mCeHR媒体较长生成时间。由于蠕虫病毒传代培养，这一代的时间减少到4天，类似于生长在OP5蠕虫0细菌。然而，生成时间可能是因为在进料，运动，或特定营养需求的缺陷振振有词不再对某些突变体蠕虫。
当使用无菌液体介质它是讲究无菌技术是利用是至关重要的。通常，抗生素的使用被最小化，并最终消除由于蠕虫使其恢复到该介质和残留的细菌被消除。抗生素的最初要求，以确保当确立，因为它可以防止残留的细菌，可以压倒蠕虫病毒培养物的生长的文化是无菌的。经过接连两次漂白，抗生素是从文化的抗生素连续使用省略，只口罩可怜无菌操作技术，这对于不断增长的蠕虫axenically。在层流柜使用这些技术至关重要，作者已经能够axenically成长的蠕虫没有污染。另外，正确的MED存储ia和组件是蠕虫的维护和增长至关重要。该蠕虫应检查增长率和传代培养，以防止拥挤，从而导致持久形成的必需的营养物质被耗尽。这可以通过确保蠕虫的密度不超过3000蠕虫/毫升/厘米2来防止。研究者认为是新的成长C.线虫 axenically可以通过日常检查蠕虫和每周计数蠕虫做到这一点。
秀丽隐杆线虫的研究人员利用它的透明性通过生成的转基因表达虫荧光标记的标记，使基因表达和蛋白定位的可视化。允许生成的低拷贝整合体是避免外的阵列和升高的基因表达的问题，利用基因枪轰击注意到使用转基因注射19产生。以前，人们使用转基因产生的缺点C的微粒轰击线虫是用于蛋盘的准备，以产生大量的必要的程序20 UNC-119（ED3）蠕虫的要求。每个转换需要20鸡蛋板的蠕虫所需的数量。使用无菌mCeHR液体培养提供了更有效的增长和随后的轰炸更多的蠕虫。另外，轰击可用于与药物一起使用的选择，以避免使用UNC-119（ED3）蠕虫21。
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Disclosures
作者宣称没有任何竞争的经济利益或利益冲突。
Acknowledgments
这项工作是由HealthGrants DK85035和DK074797（H）全国学院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
