Summary
C. elegans é normalmente cultivadas em placas de agar sólido ou em meio líquido semeadas com E. coli. Para evitar subprodutos bacterianos de confundir os estudos toxicológicos e nutricionais, utilizamos um meio líquido axênico, CEHR, para crescer e sincronizar um grande número de vermes para uma gama de aplicações a jusante.
Abstract
Neste protocolo, apresentamos os materiais necessários, bem como o procedimento para a tomada de C modificado. Legans e habituação e de reprodução da mídia (mCeHR). Além disso, as etapas para expor e aclimatação C. elegans crescidos em E. coli para axênica meios líquidos são descritos. Finalmente, experimentos a jusante que utilizam axênica C. elegans ilustrar os benefícios deste procedimento. A capacidade de analisar e determinar C. elegans exigência nutricional foi ilustrada pelo crescimento N2 tipo selvagem vermes em meio líquido axênicos com concentrações variadas de heme. Este procedimento pode ser replicado com outros nutrientes para determinar a concentração óptima para o crescimento e desenvolvimento de sem-fim ou, para determinar os efeitos toxicológicos de tratamentos com drogas. Os efeitos da concentração do heme variadas sobre o crescimento de tipo selvagem vermes foram determinados por meio de observação microscópica qualitativa e quantificando tele número de vermes que cresciam em cada concentração de heme. Além disso, o efeito de concentrações variadas de nutrientes pode ser ensaiada utilizando vermes que expressam sensores fluorescentes que respondem a alterações nos teores de nutrientes de interesse. Além disso, um grande número de vermes foram facilmente produzida para a geração de C. elegans transgénicos utilizando bombardeamento com micropartículas.
Introduction
O nematóide do solo, Caenorhabditis elegans, é um poderoso organismo modelo utilizado em inúmeros estudos da genética à toxicologia. Como resultado do seu tamanho 1 mm de tempo de geração rápida de quatro dias, a facilidade de cultivo, e um grande número da progenitura, estes nemátodos têm sido utilizados num certo número de telas genéticos e farmacológicos 1, 2. Pesquisadores tirar proveito deste worm para identificar moléculas e vias conservadas em sistemas de vertebrados. Estas vias incluem sinais de morte celular, as vias de envelhecimento e metabolismo, e o sistema nervoso 3-6. Além disso, a transparência da C. elegans permite a geração de linhas transgénicas usando repórteres de proteínas fluorescentes, que podem ser visualizadas directamente para analisar os padrões de expressão de genes e localização de proteínas.
Em muitos estudos desse nematóide é cultivado em uma superfície à base de agar sólido usando nematóide meio de crescimento placas (NGM) ou lculturas iquid semeada com Escherichia coli como uma fonte de alimento 7,8. Estas fontes alimentares bacterianas podem confundir estudos bioquímicos e toxicológicos com a interferência de bactérias subprodutos que afetam a interpretação dos resultados. A fim de evitar estes efeitos combinados, C. elegans podem ser cultivadas num meio líquido axênicos que é desprovido de bactérias como uma fonte de alimento. Usando essa mídia, cultivadas com sucesso milhões de vermes altamente sincronizadas para muitos padrão C. protocolos elegans, incluindo a análise de microarray de genes diferencialmente regulados em C. elegans expostas a diferentes concentrações de heme e a produção de vermes transgénicas usando bombardeamento de genes. Esta mídia é quimicamente definidos e modificados a partir de uma receita original formulada pelo Dr. Eric Clegg 9. Utilizando este suporte mCeHR, identificámos com sucesso genes envolvidos na homeostase do heme, que se refere a genes que respondem a heme (hrg s) 10, o qual farianão ter sido possível em condições de crescimento normais que utilizam placas de agar semeadas com E. NGM coli.
Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a introdução e manutenção de C. elegans crescidos em E. coli para o mCeHR axênica e utilizar este método para obter um grande número de vermes para a produção transgénica C. linhas elegans utilizando micropartículas bombardeio. Nós também apresentamos estudos que mostram a utilidade de usar mídia axênicos para determinar a exigência nutricional de C. elegans utilizando heme como um exemplo. Estes estudos mostram que o uso de meios de comunicação mCeHR permite o crescimento rápido de um grande número de C. elegans para muitas aplicações a jusante utilizados por pesquisadores verme.
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Protocol
1. Cepas Worm
- Obter C. elegans do tipo selvagem estirpes Bristol N2 a partir do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) e mantê-los em placas NGM semeados com E. OP50 coli 7. Nota: verme transgênico cepas IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizados foram gerados como descrito anteriormente 11. IQ6011 pode ser solicitado ao autor correspondente.
2. Preparação de modificação C. elegans Habitação e Reprodução Médio (mCeHR)
Prepare mCeHR meios líquidos, como descrito abaixo de 12. Esta mídia líquido axênica permite que os vermes a crescer sem quaisquer fontes de alimentos adicionais. Realizar todas as manipulações dos meios líquidos axênicas e worms axênicos usando condições rigorosamente estéreis, como uma capela de fluxo laminar.
- Obter leite livre de gordura ultra-pasteurizado de uma mercearia. Use o pró refrigeradoduto e não o produto a temperatura ambiente. Antes de ser utilizado na mCeHR meio, a sequência de leite em Brain Heart Infusion (BHI) em placas de agar e incubar durante 3 dias a 30 ° C e 37 ° C para verificar a esterilidade. Colocar o leite para tubos de 50 ml estéreis e armazenar a -80 ° C
- Prepare a cada um dos seguintes componentes e combinar na ordem e quantidades apresentadas para preparar 1 litro de mCeHR (Tabela 1A): 10 ml de 2 mM de citrato de colina diácido, 10 ml de vitaminas e mistura de factor de crescimento (ver receita na Tabela 1B), 10 ml de 2,4 mM de mio-inositol, 10 ml de 2 mM de cloreto de hemina, 250 ml de água deionizada. Aplicar sucção e filtra-se através de uma unidade de filtro de 0,22 um.
- Adicionar 20 ml da mistura de ácido nucleico (receita na Tabela 1C), 100 ml de mistura de minerais (receita na Tabela 1E), 20 ml de 170 mg / ml de hidrolisado de lactalbumina, 20 ml de aminoácidos essenciais, 10 ml de aminoácidos não essenciais Os ácidos, de 20 ml de 450 mM de KH 2 PO 4,50 ml de 1,45 M de D-glucose, 10 ml de HEPES 1 M, sal de sódio, 250 ml de água desionizada.
- Aplicar sucção para filtrar esterilizar os componentes. Retire o filtro e adicionar 1 ml de 5 mg / ml de colesterol. Certifique-se que o pH do meio é de cerca de 6-6,5. Nota: Esta solução pode ser armazenada a -80 ° C durante até um ano.
- Adicionar 20% (v / v), ultra-pasteurizado de leite desnatado orgânico para o meio mCeHR antes da utilização. Use técnica escrupulosamente estéril (por exemplo, numa câmara de fluxo laminar), quando a abertura e alíquotas do leite. Armazene a mídia a 4 ° C.
3. Prepare C. elegans para a Cultura em Axenic mCeHR Líquido Médio
- Crescer vermes em dez 60 milímetros placas NGM até há muitos vermes grávidas e uma quantidade mínima de OP50 E. coli nas placas.
- Remover as minhocas de cada placa por enxaguamento com 5 ml de tampão M9 (receita na Tabela 1F), e combinar num tubo de 50 ml.
- Permita que os vermes para settle, deixando o tubo em repouso durante 5 a 10 min, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante contendo a E. coli.
- Repita os passos 3.2 e 3.3 2x para remover tanto as bactérias residuais quanto possível, antes de continuar o procedimento.
- Ressuspender as minhocas em 0,1 N de NaCl num volume que é um múltiplo de três, por exemplo, 1,5 ml, 3 ml ou 6 ml, em que os vermes individuais pode ser visto no tubo.
- Branquear os vermes por adição de NaOH 5 N e de hipoclorito de sódio a 5% solução (lixívia) numa proporção de 01:02:06 para a suspensão verme. Por exemplo, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml de hipoclorito de sódio a 5%: 6 ml de suspensão de vírus. Misture o NaOH e branqueador antes da adição à suspensão de verme.
- Vortex se vigorosamente a solução até as minhocas grávidas são dissolvidos e apenas os ovos são visíveis dentro da suspensão (cerca de 5 a 10 min). Monitorar o processo usando um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10X.
- Após os vermes se ter dissolvido completamente, a pelota imediatamenteovos de 800 g durante 45 segundos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com 10 ml de água estéril, por centrifugação a pelota em 800 xg durante 45 seg a 4 ° C.
- Após o branqueamento, transferir o sedimento de ovo a um frasco de 25 de tecido cm 2 de cultura contendo 10 ml de meio mCeHR suplementadas com 100 ug / ml de tetraciclina. Realizar este procedimento usando técnicas estéreis. Se for o caso, adicionar antibióticos adicionais, incluindo 250 ug / ml de ácido nalidíxico, para prevenir o crescimento bacteriano nas culturas líquidas axênicos.
- Incubar as culturas liquidas a 20 ° C num incubador com agitação a cerca de 70 rpm.
- Verificar os vermes diária observar a fase de desenvolvimento e a taxa de crescimento.
Nota: Worms inicialmente crescem lentamente e exigem 7 a 10 dias para se tornar grávido. No entanto, como os vermes aclimatar ao meio líquido o tempo de geração irá diminuir a aproximadamente 4 dias para o tipo selvagem (N2) vermes. - Depois que os vermes têm desenvolvido para a fase grávida em meio líquido, a transferência da cultura para um tubo sem-fim cónico e sedimentar as minhocas a 800 xg por 5 min a 4 ° C utilizando um rotor de balde oscilante.
- Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento de vírus num volume igual de 0,1 M de NaCl. Por exemplo, utilizar 10 ml de 0,1 M de NaCl para vermes cultivados em 10 ml de mCeHR. Permita que os vermes que se contentar com 5 min no gelo.
- Realizar o procedimento de clareamento, como descrito acima em passos 3,5-3,8, e permitir que os vermes a crescer para uma segunda geração nos meios líquidos axênicas. Se necessário, adicionar o antibiótico de novo para inibir o crescimento bacteriano.
- Novamente permitir que os vermes se tornar prenhe então granulada e ressuspender os vermes em 0,1 M de NaCl, tal como descrito nos passos 3.12 e 3.13, então lixívia novamente como descrito nos passos de 3,5-3,8, para produzir uma população sincronizada. Crescer os vermes larvais L1 em meios líquidos sem antibióticos a partir de agora.
4. Sincronizando Worms de líquidoCultura
- Pellet e ressuspender os vermes em NaCl 0,1 M, como descrito acima nos passos 3.12 e 3.13. Lixívia como descrito acima nos passos 3,5-3,8.
- Ressuspender o sedimento de ovo em 10 ml de tampão M9 e permitir que as larvas eclodem O / N a 20 ° C num agitador de plataforma rotativa. Nota: Os ovos eclodem em larvas L1, mas não vai desenvolver ainda mais, sincronizando os vermes na fase L1.
- Para manter e vermes subcultura, pelota larvas L1 a 800 xg durante 5 min, em seguida, voltar a suspender as larvas em 10 ml de mCeHR e transferência para um frasco de 25 cm 2. Permitir que os vermes a crescer a 20 ° C numa plataforma rotativa. Manter uma densidade máxima de 3.000 vermes / ml / cm 2 para garantir nutrição adequada para os vermes.
Nota: Nesta fase, os antibióticos não são necessárias para manter as condições axénicas, quando os procedimentos são efectuados utilizando técnicas esterilizadas numa hote de fluxo laminar. Worms deve ser verificado diariamente para acompanhar o crescimento.
5. Grátiszing e descongelamento Worms para culturas Axenic Médio
- Congelar culturas vermes assíncronos axênicos ou larvas L1 sincronizado em nitrogênio líquido. Vermes pelete a 800 x g durante 5 min e em seguida ressuspender em tampão S (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, NaCl 146,25 mM) usando 0,5 ml para cada frasco. Adicionar um volume igual de tampão de S com 30% v / v de glicerol a cada frasco e transferir os vermes para -80 ° C, antes de armazenamento a longo prazo em N2 líquido. Congelar a cerca de 1 x 10 6 por ml vermes em cada frasco.
- Descongelar vermes por incubação dos tubos a 37 ° C durante aproximadamente 2 minutos até quase todo o gelo é derretido. Em uma câmara de fluxo laminar, transferir os vermes para um frasco estéril contendo mCeHR e colocá-los a 20 ° C.
6. Determinar o efeito de Hemin Concentração de Crescimento e Reprodução em mCeHR
- Use mídia mCeHR axênicos para ensaio de crescimento dependente de nutrientes de C. elegans. Para determinar o efeito of concentração hemina sobre o crescimento e desenvolvimento sem fim, use sincronizado vermes N2 axênicos ou outras cepas de interesse. Sincronizar larvas L1, como descrito acima na seção 4.
- No dia seguinte, pelota e contar larvas L1 sincronizado e diluir a 1 verme por mL de mídia axênicas. Adicione cloreto de hemina a 10 mM em 0,3 M de NH 4 OH e ajustar a pH 8, utilizando HCl concentrado.
- Adicionar 800 ul de meio mCeHR para uma placa de 24 poços. Adicionar 100 vermes para cada poço em 100 ul de meio. Adicionar cloreto de hemina a cada poço em concentrações que variam de 0 uM, 1,5 uM a 1,000 uM em triplicado. Assegurar que todos os poços contêm a mesma concentração de 0,3 M de NH 4 OH. Suavemente ressuspensas os vermes antes pipetando para assegurar que 100 larvas L1 são adicionados a cada poço.
- Examine os vermes diariamente e observe o crescimento em cada concentração em cada poço. Contar o número de vermes após 9 dias de incubação e traçar o número de vermes / ml correspondem a cada hemeconcentração (Figura 1).
7. Efeito da Hemin Concentração em Heme Sensor Worms
- Incubar sincronizados L1 vermes sensores heme (Phrg-1 :: GFP) em mCeHR contendo 4 pM, 8 pM, 10 uM e 20 uM de hemina.
- Imagem os vermes usando microscopia confocal de fluorescência, 48 pós horas de incubação (Figura 2).
8. Utilizando mCeHR gerar Transgênicos C. elegans Usando Microparticle Bombardeio
Nota: O procedimento para a criação e a realização de bombardeamento com micropartículas usando vermes cultivados em mCeHR unc-119 (ed3) é mostrada na figura 3 13.
- Preparação Worm
- Transferir cerca de 1 x 10 6 assíncronas unc-119 (ed3 vermes) em 90 ml de meio mCeHR em um balão de 175 centímetros 2 uma semana antes do bombardeamento. Permita que os vermes a crescer a 20 ° C ona plataforma de agitação em ~ 70 rpm (Figura 3-1).
Nota: Uma semana mais tarde, a densidade de sem-fim deve ser significativamente maior com diversos vermes adultos grávidos. Aproximadamente 3 x 10 7 vermes será necessária para bombardeamento com micropartículas. - Frio JM109 E. coli semeadas 10 placas NGM cm no gelo.
- Transferir os vermes axênicos para dois tubos de 50 ml e centrifugar cónicas dos vermes a 800 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os vermes em cada tubo de 50 ml de tampão M9 (Figura 3-2).
- Permita que os vermes adultos para sedimentar por gravidade por 10 a 15 min em gelo.
Nota: Os sedimentos de 2 ml agora deve conter> 90% vermes adultos. Este sedimento 2 ml devem ter aproximadamente 5 x 10 6 de vermes e é suficiente para um bombardeamento de micropartículas. - Casaco de toda a superfície da placa de JM109 refrigerados semeadas NGM com o sedimento de 2 ml de vermes. Deixe o líquido ser absorvido completamente em seguida, deixar a placapor 30 min no gelo antes de prosseguir (Figura 3-3).
- Transferir cerca de 1 x 10 6 assíncronas unc-119 (ed3 vermes) em 90 ml de meio mCeHR em um balão de 175 centímetros 2 uma semana antes do bombardeamento. Permita que os vermes a crescer a 20 ° C ona plataforma de agitação em ~ 70 rpm (Figura 3-1).
- Preparação de partículas de ouro
- Pesar 30 mg de partículas de ouro para um tubo de microcentrífuga siliconizada. Adicionar 1 ml de etanol 70% e vortex do tubo durante 5 min.
- Permitir que o tubo em repouso durante 15 min, depois, centrifugar a 6000 xg durante 10 seg para sedimentar as partículas de ouro. Retirar o sobrenadante utilizando uma pipeta, tocando cuidadosamente a ponta para o lado oposto do tubo com as partículas de ouro.
- Lavar as partículas de ouro com 1 ml de água estéril, vortex durante 1 min e centrifugar brevemente o tubo a 6.000 xg durante 10 seg. Repetir o passo de lavagem, duas vezes, em seguida, voltar a suspender as partículas de ouro, em 0,5 ml de glicerol a 50% estéril.
Nota: A concentração final das partículas de ouro será de 60 mg / ml e pode ser armazenado durante 1 a 2 meses a 4 ° C.
- Preparar a mistura de partículas de DNA a ouro
- Combinar 10 ug do ADN de plasmídeo desejado com 10 &# 956; g do unc-119 plasmídeo de resgate em uma siliconizada 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Adicionar 50 mL de água DI e 100 ul de solução de partículas bem ressuspenso ouro depois vórtice durante 1 min.
- Adicionar 150 ul de 2,5 M CaCl2 e vortex a solução novamente durante 1 min. A esta solução, adicionar 60 ul de espermidina 0,1 M e vortex durante 3 a 5 min.
- Pulso centrifugar a solução a 6.000 xg durante 10 seg, remover o sobrenadante e adicionar 300 ul de etanol a 70%. Vortex bem durante 1 min, centrifugar a 6.000 xg pulso, remove-se o sobrenadante e ressuspender em 170 ul de etanol a 100%. Vortex vigorosamente a solução durante 5 a 10 minutos, em seguida centrifuga pulso e remover o sobrenadante.
- Bombardeio (Figura 3-3)
Nota: Este protocolo realiza-se com o sistema de entrega de partículas especificado na Tabela de Materiais / equipamento. Siga as instruções para o instrumento de entrega de partículas disponível.- <li> Coloque uma folha de papel de tecido em uma placa de 15 cm. Com uma pinça, mergulhe sete macrocarriers individualmente em etanol 100% e colocá-las sobre o tecido para secar.
- Limpe bem a câmara de biobalística, titular microtransportador, e placa-alvo com etanol 70%. Limpe e autoclave as telas de parada antes de cada procedimento de bombardeio.
- Coloque as macrocarrriers no suporte usando uma pinça e imprensa no suporte usando a ferramenta de estar.
- Uniformemente distribuído 20 ul do DNA de partículas de ouro revestidas, no centro de cada microtransportador e, em seguida, permitir que a solução seque completamente.
- Limpar as duas partes do divisor de pressão com etanol e montar com etanol limpo discos de ruptura. Aperte o divisor de pressão montado e discos de ruptura na câmara de bombardeamento.
- Montar uma tela de parada autoclavado com o titular da microtransportador e coloque o aparelho em cima da prateleira de metal necessárias e trava no lugar.
- Insira o macr montadoAparelho ocarrier na câmara biolística na ranhura colocado abaixo do divisor de tensão e alinhar com o divisor de tensão.
- Tape a placa NGM aberto com os vermes na prateleira placa-alvo e fechar a porta da câmara.
- Para bombardear vermes, ajustar a pressão para que a necessária para quebrar os discos de ruptura. Ligue o vácuo de 28 polegadas de pressão de Hg, em seguida, pressione o botão de fogo até que os discos de ruptura.
- Solte o vácuo e retirar a placa NGM do aparelho. Lave os vermes da placa e redistribuir em vinte placas de 10 cm NGM semeados com JM109 E. coli (Figura 3-4).
- Permitir que os vermes se crescer durante 10 a 14 dias a 25 ° C e as placas de fome. Worms resgatados de defeito unc-119 terá movimento normal e pode ser identificada neste momento. Escolha pelo menos 10 "tipo selvagem" vermes de pratos separados para análise uma vez que estes representam linhagens transgênicas independentes (Figure 3-5).
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Representative Results
Cultivar C. elegans em axênicos ajudas meio líquido na determinação de nutrientes que são necessários por vermes, sem a interferência de metabólitos secundários produzidos por E. coli. Vermes de tipo selvagem N2 aclimatar a mídia mCeHR dentro de três gerações e mostrar um crescimento comparável a vermes cultivadas em placas bacterianas NGM. Na verdade, esses vermes se tornar grávida dentro de 4 dias, em comparação com 3,5 dias para vermes cultivadas em OP50 bactérias.
Uma vantagem de usar mCeHR foi observado em estudos que examinaram as necessidades de nutrientes exacta destes vermes 14. Na Figura 1 os vermes foram cultivadas em mCeHR suplementado com quantidades crescentes de heme, de até 1 mM. Observações desses vermes mostrou um atraso distinto em crescimento em concentrações de heme abaixo de 4 mm, com vermes em desenvolvimento para o estágio larval L4, mas incapaz de avançar para a fase gravídico após nove dias em mCeHR. Em concentrações de 10 ^ M e 2056; M heme os vermes desenvolver ao palco gravídico em 4 dias e produzem grande número de descendentes. Um número máximo de progenitura foi observado quando os vermes foram cultivadas em mCeHR contendo 20 uM do heme. Worms continuou a desenvolver e produzir descendência de 100 mm e 500 mm de heme. No entanto, o número de descendência larval diminuiu significativamente em relação aos vermes cultivados na concentração do heme óptima de 20 uM do heme. Concentrações iguais ou superiores a Heme 800 mM resultou em atrofiadas, worms doentios na fase larval L3, o que indica que estas concentrações foram heme tóxico para os vermes.
Além de determinar a concentração óptima do heme e o efeito da privação de heme e toxicidade do heme em C. crescimento elegans, estirpes heme repórter pode ser utilizada para avaliar indirectamente o estado do heme do sem-fim no interior de um intervalo de concentrações menores. O worm IQ6011 é um worm transgênica que expressa uma heme sensível repórter transcricional, P hrg-1 Figura 2. Expressão da GFP é reprimida a 20 uM heme e aumenta à medida que a concentração do heme é diminuída. As alterações incrementais na concentração do heme podem ser correlacionados com a resposta exacta e expressão de genes em meios mCeHR.
Além de ser capaz de controlar cuidadosamente as concentrações de nutrientes fornecidos para o sem-fim, meios de mCeHR axênica permite o crescimento eficiente de um grande número de vermes sincronizados. Esta característica pode ser explorada para o bombardeamento com micropartículas (Figura 3). Usando este procedimento, pelo menos, uma linha integrada têm sido desenvolvidos a partir de cada bombardeamento de micropartículas realizado (Tabela 2).
Figura 1. C. elegans heme curva de crescimento. Worms foram cultivadas em uma gama de concentrações de heme 0 uM a 1,000 uM em mCeHR durante 9 dias. O número de vermes em cada concentração foi contado e traçados. No 1.5 ^ M heme concentrações vermes foram L4 e incapaz de desenvolver ainda mais. A 800 mM heme os vermes foram atrofiado em fases L2-L3 e mostraram efeitos de toxicidade heme.
Figura 2. Resposta do sensor de heme (Phrg-1 :: GFP) tensão para diferentes concentrações de heme em mCeHR. Sincronizado transgênico C. elegans expressando hrg-1 :: GFP foram cultivados em meio mCeHR suplementadas com 4, 8, 10, ou 20 heme mM por 48 horas. As imagens foram tiradas com uma confoca Zeiss LSM 710l microscópio. Barra de escala é 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Esquemático de bombardeamento de micropartículas em C. elegans usando unc-119 vermes cultivados em mCeHR. (1) Aproximadamente 3 x 10 7 de unc-119 (ed3) vermes são cultivadas em 90 ml mCeHR media. (2) Gravids foram autorizados a instalar no gelo por 10-15 minutos em 50 ml tubos cônicos. (3) Um sedimento de 2 ml de aproximadamente 5 x 10 6 de vermes fêmeas grávidas foi espalhado uniformemente sobre uma placa NGM não semeada. Os vermes foram bombardeados com 12 mg de plasmídeo de interesse e 6 mg de unc-119 plasmídeo resgate complexado com partículas de ouro. (4) Tele bombardeado vermes foram divididos em vinte placas de 10 cm semeados com a E. JM109 coli. (5) Depois de 2 semanas de incubação a 25 ° C, com placas de tipo selvagem vermes foram seleccionados para análise da força de expressão do transgene e as taxas de segregação.
| Tabela 1A | |
| CEHR, 1 L | |
| Utilizando uma técnica esterilizada e um 1 L (0,22 mM) da unidade de filtro de vácuo, filtra-se os seguintes volumes da solução-mãe e água na ordem descrita. | |
| Citrato de colina diácido | 10 ml |
| Vitamina e fator de crescimento mix | 10 ml |
| mio-inositol | 10 ml |
| Cloreto Hemin | 10 ml |
| Água deionizada | 250 ml |
| Mistura de ácidos nucleicos | 20 ml |
| Mineral Mix | 100 ml |
| Lactalbumina hidrolisado | 20 ml |
| Mix de aminoácidos essenciais | 20 ml |
| Mix não-essencial de Aminoácidos | 10 ml |
| KH 2 PO 4 | 20 ml |
| D-Glicose | 50 ml |
| HEPES, sal de sódio | 10 ml |
| Água deionizada | 250 ml |
| Volume será de 800 ml, neste ponto Remova a unidade de filtro de vácuo, em seguida, acrescentar: | |
| Colesterol | 1 ml |
| Leite desnatado ultra-pasteurizado | 200 ml |
| Tabela 1B | |
| Vitamina e factor de crescimento de mistura, 100 ml | |
| Solução 1: Para 60 ml de água add: | |
| N-acetil-α-D-glucosamina | 0,15 g |
| DL-alanina | 0,15 g |
| Nicotinamida | 0,075 g |
| D-pantethine | 0,0375 g |
| DL-ácido pantotênico, sal de cálcio hemi | 0,075 g |
| O ácido fólico | 0,075 g |
| Pyridoxamine 2HCl | 0,0375 g |
| HCl piridoxina | 0,075 g |
| Flavin mononucleótido, sal de sódio | 0,075 g |
| Cloridrato de tiamina | 0,075 g |
| Solução 2: Preparar os seguintes produtos químicos em 5 ml 1 N KOH: | |
| ácido p-aminobenzóico | 0,075 g |
| D-biotina | 0,0375 g |
| Cianocobalamina (B12) | 0,0375 g |
| O ácido folínico, sal de cálcio | 0,0375 g |
| O ácido nicotínico | 0,075 g |
| Piridoxal 5-fosfato | 0,0375 g |
| Solução 3: 0,0375 g (±) α-L-lipóico, forma oxidada, em 1 ml de etanol: | |
| Combine as soluções 1, 2, e 3 e levar o volume final para 100 ml. Loja no escuro a 4 ° C ou congelar alíquotas a -20 ° C. Faça pequenos volumes de estoques para esta mistura por isso é usado rapidamente. | |
| Tabela 1C | |
| Mistura de ácido nucleico, 100 ml | |
| Para 60 ml de água add: | |
| A adenosina 5 '-monofosfato, o sal de sódio | 1,74 g |
| Citidina 5 '-fosfato | 1,84 g |
| A guanosina 2 '- e 3'-monofosfato | 1,82 g |
| OR | |
| A guanosina 5 '-fosfato | 2,04 g |
| A uridina 5 '-fosfato, sal de dissódio | 1,84 g |
| Timina (adicionar último) | 0,63 g |
| Levar a solução para 100 ml e armazenar no escuro a 4 ° C ou congelar alíquotas a -20 ° C. Faça pequenos volumes de estoques para esta mistura por isso é usado rapidamente. | |
| Mineral Mix, 1 L | |
| MgCl2 • 6H 2 O | 4,1 g |
| Citrato de sódio | 2,9 g |
| Citrato de potássio mono-hidratado | 4,9 g |
| CuCl2 • 2H 2 O | 0,07 g |
| MnCl2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl2 | 0,1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 6H 2 O • | 0,6 g |
| CaCl 2 • 2H 2 O (sempre adicionar último) | 0,2 g |
| Faça pequenos volumes de estoques para esta mistura por isso é usado rapidamente. | |
| Outros Componentes | |
| KH 2 PO 4 | 450 mM |
| Citrato de di-ácido de colina | 2 mM |
| mio-inositol | 2,4 mM |
| D-Glicose | 1,45 M |
| Cloreto Hemin | 2 mM em 0,1 N NaOH a pH 8,0 |
| HEPES, sal de sódio | 1 M de solução de estoque |
| Colesterol | 5 mg / ml em etanol |
| Lactalbumina enzimática hidrolisada | 170 mg / mL |
| Tabela 1F | |
| M9 Buffer, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H2O | 1 L |
| Autoclave 30 min | |
| 1 M de MgSO4 (estéril) | 1 ml |
Tabela 1. Receitas para componentes de mCeHR e mCeHR.
| Bombardeamento | Linhas com tipo selvagem de resgate | Linhas com rescue / transgene | Linhas estáveis |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Média | 4.8 | 3.2 | 1 |
Tabela 2. Averanúmero ge de C. transgênico elegans gerado usando bombardeamento com micropartículas.
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Discussion
Neste protocolo, apresentamos uma mCeHR mídia modificado axênica líquido que permite a rápida C. geração elegans com a produção de um grande número de vermes. Esta mídia mostra várias vantagens como os vermes são cultivados sem contaminar E. coli ou subprodutos de bactérias e pode ser explorada em estudos nutricionais e toxicológicos. O uso de E. coli ou outras bactérias em tais estudos tem vários inconvenientes. Por exemplo, o crescimento das bactérias podem mudar, sob várias condições e as bactérias podem metabolizar as moléculas que estão a ser ensaiados, confundindo a interpretação dos resultados. Portanto, o desenvolvimento de um meio definido para realizar estes estudos é altamente vantajosa.
Embora C. elegans foram cultivadas em meio líquido em estudos anteriores 15, worms cultivadas no C. meio de manutenção elegans (CEMM) mostram um atraso distinta em tempos de geração de 16, ao contrário do que nós observe em meio mCeHR. Nosso principal objetivo era explorar C. elegans para estudar a homeostase de nutrientes com ênfase específica em heme e metabolismo de metal. Com isto em mente, mCeHR e modificações geradas pelo nosso grupo de realizar este objetivo e tem conduzido diretamente para a identificação de um número de genes necessários para manter a homeostase do heme no verme e, finalmente, em sistemas modelo de vertebrados 17, 18. Reformulados mCeHR-1 de mídia também pode ser explorada por outras espécies de nematóides, incluindo Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila e C. remanei. Além formulações de metal de baixa mCeHR-2 e mCeHR-3 pode ser explorada em estudos que examinam a toxicidade e exigências 12 heavy metal.
Antes de aclimatação, vermes N2 apresentam um tempo de geração de cerca de 7 a 10 dias em meio mCeHR. À medida que os vermes são subcultivadas, desta vez geração diminui a 4 dias, semelhante ao dos vermes cultivados em OP50 bactérias. No entanto, o tempo de geração pode ser mais longo para certos vermes mutantes, plausivelmente por causa de defeitos na alimentação, o movimento, ou necessidades nutricionais específicas.
Ao usar meios líquidos axênicos é fundamental que as técnicas estéreis exigentes são utilizados. Normalmente, o uso de antibióticos é minimizada e, eventualmente eliminado como os vermes aclimatar ao meio e as bactérias residuais são eliminados. Os antibióticos são inicialmente necessárias para assegurar que as culturas estão axênica quando estabelecida uma vez que impede o crescimento de bactérias residuais que pode sobrecarregar as culturas de vermes. Após duas rodadas sucessivas de branqueamento, os antibióticos são omitidos das culturas como o uso contínuo de antibióticos só mascara técnicas assépticas pobres que são essenciais para o crescimento de vermes com culturas puras. Usando essas técnicas em uma câmara de fluxo laminar, os autores foram capazes de crescer os vermes com culturas puras sem contaminação. Além disso, o armazenamento adequado do medIA e componentes é essencial para a manutenção e crescimento de verme. Os vermes deve ser verificado para a taxa de crescimento e subcultivadas para evitar aglomeração, o que pode levar à formação de dauer como nutrientes essenciais estão esgotados. Isto pode ser evitado assegurando que a densidade de vermes não exceda 3000 vermes / ml / cm 2. Pesquisadores que são novos para o crescimento de C. elegans culturas puras pode conseguir isso através da verificação dos vermes diária e contando os vermes semanal.
C. elegans pesquisadores tirar proveito de suas propriedades transparentes através da geração de vermes transgênicos expressando marcadores fluorescente-tag que permitem a visualização da expressão gênica e localização de proteínas. Utilizando bombardeio biobalística permitido para a geração de baixas integrantes cópia que evitaram as questões de matrizes extracromossómicos e expressão genética elevada notou com transgênicos gerados usando a injeção 19. Anteriormente, uma desvantagem de gerar transgênicos usandobombardeamento com micropartículas de C. elegans foi o requisito para a preparação da chapa de ovo para gerar um grande número de unc-119 (ed3 vermes) necessárias para o processo 20. Cada transformação necessária 20 placas de ovos para o número de vermes necessários. Usando axênica cultura líquido mCeHR permite um crescimento mais eficiente e, posteriormente, mais vermes para bombardeios. Além disso, os bombardeamentos pode ser usado em conjunção com a selecção de drogas para evitar o uso de unc-119 (ED3) vermes 21.
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Disclosures
Os autores declaram que não há concorrentes interesses financeiros ou conflitos de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de HealthGrants DK85035 e DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
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