Summary
אנו מציגים biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לגילוי הכלאת DNA. בעקבות functionalization הבדיקה ssDNA, הסגוליות, הרגישות, וגבול הגילוי נלמדים ביעדי ssDNA משלימים ולא משלימים. תוצאות ממחישות את השפעתם של אירועי הכלאת DNA על מערכת אלקטרוכימיים, עם גבול גילוי של 3.8 ננומטר.
Abstract
מזעור של נהלים המעבדתיים אנליטיים למייקרו בקנה המידה מספק יתרונות משמעותיים בכל הקשור לזמן תגובה, עלות, ושילוב של מדרגות עיבוד מראש. ניצול מכשירים אלה לקראת הניתוח של אירועי הכלאת DNA הוא חשוב משום שהיא מציעה טכנולוגיה להערכה בזמן אמת של סמנים ביולוגיים בנקודה של הטיפול למחלות שונות. עם זאת, כאשר טביעת רגל המכשיר מפחיתה את הדומיננטיות של עליות תופעות פיסיקליות שונות. תופעות אלה משפיעים על דיוק הייצור ואמינות תפעול של המכשיר. לכן, יש צורך גדול כדי להמציא באופן מדויק והפעלת מכשירים אלו באופן לשעתק על מנת לשפר את הביצועים הכוללים. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים ושיטות המשמשות לייצור והתפעול של biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לניתוח מדויק של אירועי הכלאת DNA. Biochip מורכב משני חלקים: שבב microfluidic עםשלושה מיקרו ערוצים מקבילים עשויים polydimethylsiloxane (PDMS), ו3 x 3 מיקרו שבב אלקטרוכימיים ערוך. אירועי הכלאת DNA מזוהים באמצעות ניתוח אלקטרוכימיים ספקטרוסקופיה עכבה (EIS). ניתוח EIS מאפשר וריאציות ניטור של המאפיינים של המערכת אלקטרוכימיים כי הם דומיננטיים בקני מידת אורך אלה. עם היכולת לעקוב אחר שינויים של שתי העברת המטען והתנגדות diffusional עם biosensor, אנחנו מדגימים את הסלקטיביות למטרות ssDNA משלימות, גבול גילוי מחושב של 3.8 ננומטר, ו13% תגובתיות צולבת עם ssDNA שאינו משלימים אחרים הבא 20 דקות של דגירה. מתודולוגיה זו יכולה לשפר את הביצועים של מכשירים ממוזערים על ידי הבהרה על ההתנהגות של דיפוזיה במשטר מיקרו בקנה מידה ועל ידי הפעלת המחקר של אירועי הכלאת DNA.
Introduction
מעבדה על שבב microfluidic מכשירים (LOC) מספקים יתרונות רבים באבחון קליני, ניטור סביבתי ומחקר ביו. התקנים אלה לנצל ערוצי microfluidic לשלוט זרימת נוזל לאזורים של השבב שבו מגוון רחב של נהלים יכול להתקיים כולל ערבוב מגיב, זיקה מבוססת מחייב, הולכים אותות, ותא culturing 1-4. מיקרופלואידיקה מספקת יתרונות רבים על פני כלי אבחון קליניים קונבנציונליים כגון קוראי צלחת microwell או מבחני משמרת ג'ל electrophoretic. מכשירי microfluidic דורשים 2 עד 3 סדרי הגודל (nanoliters בניגוד למיקרוליטר) פחות חומרים כימיים לביצוע מבחני דומים. כמו כן, מכשירים אלה יכולים להגדיל את המהירות שבה כמה אירועים ביולוגיים להתרחש עקב הכליאה קטנה יותר של המינים בתוך הערוצים 5,6. שלישית, ניתן לשלב חיישנים בתוך המכשירים microfluidic תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה ותחריט, אשר יכול לספק detectio ללא תוויתn. לבסוף, התקנים אלה הם זולים לייצור ודורש קצת עבודה על החלק של הטכנאי לפעול 7-10.
זיהוי ללא תווית בדרך כלל מתבצע באמצעות מתמר אופטי או חשמלי. מכשירים אופטיים יכולים להציג ביצועים טובים יותר חישה עקב הפרעה נמוכה יותר עם analytes במדגם. עם זאת, הביצועים שלהם נפגעת במקרים בהם הרקע של המדגם יש את אותו אורך גל מהדהד כמו החיישן 11. ישנם יתרונות רבים לשימוש באותות חשמליים כדי לבצע זיהוי ביולוגי וכימי במערכות microfluidic. הייצור הוא מטבעו פחות מסובך מאז חיישנים אלה בדרך כלל דורשים רק אלקטרודות בדוגמת לפעול. בנוסף, אותות חשמליים יכולים להיות ממשק ישיר עם ציוד המדידה ביותר, תוך שיטות אות מסוימות עשויות לדרוש מתמר להמיר את האות 12-15. חיישנים חשמליים נפוצים למדוד שינויים בimpedancפעילות הדואר 16,17, קיבול 18, או חיזור 19. עם זאת, אתגרים חדשים מוצגים כמערכות אלה ממוזערים. האתגרים החשובים ביותר להתגבר כוללים: הכנת מדגם וערבוב של נוזלים (עקב נמוך נפח הדגימה ומספר ריינולדס), השפעות פיזיות וכימיות (כולל כוחות נימים, חספוס פני השטח, אינטראקציות כימיות בין חומרי הבנייה וanalytes), איתות נמוכה יחס לרעש (המיוצר על ידי האזור המופחת פני השטח ונפח) 20-23, והפרעה אפשרית מanalytes אלקטרו הפעיל בדגימות מורכבות ביולוגיות (למשל, דם ורוק). חקירה נוספת של תופעות אלה תגרום להנחיות לייצור ותפעול מדויקים של מכשירים אלה באופן לשחזור שישפרו על הביצועים הכוללים שלהם.
זיהוי הכלאת DNA נעשה שימוש נרחב כדי לאבחן הפרעות גנטיות 24,25 וצורות שונות של cancאה 26. בכל שנה, זנים רבים של שפעת מזוהות בחולים באמצעות תוצאות של טכניקות הכלאת DNA 27. נגיף שפעת חשבונות לבד עבור 36,000 מקרי מוות בכל שנה בארצות הברית 28. דוגמאות כאלה יכולות להפיק תועלת ממכשיר microfluidic ספסל העליון שיכול לבצע את אותן טכניקות assay כassay משמרת צלחת קורא או ג'ל עם נמוך נפח דגימה ובכל חלק של העלות מבלי להקריב את רגישות או סגוליות. בשל יתרונות הרבים של חישה אלקטרוכימיים ללא תווית, זה כבר בשימוש נרחב לגילוי של אירועי הכלאת DNA 29,30. התקנה שבו אלקטרודות מאקרו בקנה מידה (בטווח של מילימטר) טבולות בכוסות עם הפתרון של עניין יכול לשמש כדי לספק נתונים רגישים מאוד בנוגע לקינטיקה מחייבת של רצפי DNA חד גדילים לרצפים המשלימים ההתאמה שלהם. לאחרונה, יש כבר כמה התקדמות בשילוב חישה אלקטרוכימיים בMICRofluidics להכלאת DNA. מחקרים שבוצעו לגבי קינטיקה הכלאה יום 31 ובאינטגרציה של חיישנים לגילוי 15 בערוצי microfluidic. עם זאת, עדיין קיים צורך במכשיר מהיר תפוקה גבוהה microfluidic שיכול לנתח אירועי הכלאת DNA במקביל ללא צעדי הכנת מדגם מסובכים.
המכשיר שהוצג בעבודה זו מספק פלטפורמה שמאפשרת לאינטראקציות מרובות כדי להיות מוקרנים במקביל וללא צעדי הכנת מדגם מסובכים. הפרוטוקול שלנו מציג כיצד microfluidic מבוסס שבבים אלקטרוכימיים הם microfabricated עם מערכות מיקרו אלקטרו טכנולוגיה (MEMS) 32,33. אנו מתארים את תהליך הייצור של שני השבב microfluidic, עשוי polydimethylsiloxane (PDMS), והשבב אלקטרוכימיים, מורכב ממערך של אלקטרודות. Functionalization הכימי של biochip עם בדיקות ssDNA הוא התייחס גם. לבסוף, אבילity של biosensor כדי לזהות באופן ספציפי ולנתח מטרות ssDNA בא לידי ביטוי. בסך הכל, biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic הוא טכניקה מהירה וניתוח תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין מולקולות ביולוגיות ומתמר ביצוע, ויכול להיות מנוצל במגוון רחב של יישומי מעבדה על שבב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 Microfabrication של השבב microfluidic
- הכן צ'יפ אלקטרוכימי
- תבנית זהב אלקטרודות
- יש לשטוף את רקיק ריק 4 '' סיליקון (איכות כיתה ראש) עם אצטון, מתנול, וisopropanol ("עמי" נקי). יש לשטוף את isopropanol מהרקיק במים ללא יונים (DI) ואחריו על ידי ייבוש עם N 2 אקדח.
- לגדול שכבת 1 מיקרומטר עבה SiO 2 פסיבציה עם אדים כימיים בתצהיר משופר פלזמה כלי (PECVD). להפקיד רובד 200 עבה של כרום ואחריו שכבת 2,000 עבה של זהב עם כלי המקרטעת DC.
- photoresist החיובי (פרמטרים ספינינג: 3,000 סל"ד, 1,000 סל"ד / sec, 30 שניות) ספין "PR1" כדי ליצור סרט אחיד ~ 1.6 מיקרומטר עבה. טרום לאפות את הרקיק 1 דקות ב100 ° C על פלטה חשמלית.
- לחשוף את הרקיק עם 190 mJ / 2 סנטימטר באורך גל nm 405 דרך photomask. לפתח את הרקיק ל30 שניות ב352 developer ולשטוף את הרקיק עם DI ויבש עם N 2 אקדח.
- לחרוט זהב עם etchant זהב ל1.5 דקות. לחרוט הכרום עם etchant כרום ל~ 30 שניות. יש לשטוף את הרקיק עם DI ויבש עם N 2 אקדח.
- להפשיט photoresist עם נוהל "עמי" נקי.
הערה: מחמצן חזק ונפיץ. - נקה את הרקיק עם 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 תערובת (נקייה "פיראנה") 1 דקות. יש לשטוף את הרקיק עם DI ויבש עם N 2 אקדח.
- תבנית אלקטרודות פלטינה
- photoresist החיובי (פרמטרים ספינינג: 3,000 סל"ד, 1,000 סל"ד / sec, 30 שניות) ספין "PR2" כדי ליצור סרט אחיד ~ 1.4 מיקרומטר עבה. טרום לאפות את הרקיק 1 דקות ב100 ° C על פלטה חשמלית.
- לחשוף את הרקיק עם 30 mJ / 2 סנטימטר באורך גל nm 405 דרך photomask. אופים את פרוסות ל45 שניות ב125 ° C על פלטה חשמלית. מבול לחשוףהרקיק עם 1,000 mJ / 2 סנטימטר ב405 אורך גל בלי photomask. לפתח את הרקיק למשך 2 דקות ב6: יזם AZ400K 1 ולשטוף את הרקיק עם DI ויבש עם N 2 אקדח.
- להפקיד רובד 400 עבה של טיטניום ואחריו שכבה עבה 1,600 Å של פלטינה באמצעות מערכת אידוי E-קורה.
- הרם את photoresist באמבטית אצטון ultrasonicated למשך 5 דקות ואחריו שטיפה עם אצטון וisopropanol. יש לשטוף את הרקיק עם DI ויבש עם N 2 אקדח.
- תבנית זהב אלקטרודות
- הכן ערוצי Assay
- הכן עובש לערוצי Assay
- יש לשטוף את רקיק ריק 4 '' סיליקון (איכות כיתה מבחן) עם נוהל "עמי" נקי. יש לשטוף את isopropanol מהרקיק עם DI ואחרי ייבוש עם N 2 אקדח.
- photoresist השלילי (פרמטרים ספין "PR3" 2-צעד ספינינג:. צעד אחד - 600 סל"ד, 120 סל"ד / sec, 10 שניות שלב שני - 1,150 סל"ד, 383 סל"ד / sec,27 שניות) כדי ליצור סרט אחיד ~ 100 מיקרומטר עבה. טרום לאפות את הרקיק על פלטה (פרמטרים אפייה 2 שלבים:. צעד אחד - כבש את מטמפרטורת חדר עד 65 מעלות צלזיוס ב300 ° C / שעה ולהחזיק טמפרטורה עבור 10 דקות שלב 2 - רמפה עד 95 מעלות צלזיוס ב300 ° C / שעה וטמפרטורת אחיזה ל30 דקות).
- לחשוף את הרקיק עם 2,500 mJ / 2 סנטימטר באורך גל nm 405 דרך photomask. פוסט לאפות את הרקיק על ידי ramping עד 95 מעלות צלזיוס ב300 ° C / שעה ולהחזיק טמפרטורה עבור 10 דקות על פלטה חשמלית. לפתח את הרקיק עבור 10 דקות בפרופילן גליקול Monomethyl Ether אצטט מפתח (PGMEA). יש לשטוף את הרקיק עם isopropanol ויבש עם N אקדח 2.
- לפברק ערוצי Assay
- הכן 10: polydimethylsiloxane 1 (PDMS) תערובת (20 גרם של אלסטומר, 2 גרם של סוכן ריפוי) ודגה לחלוטין בתא ואקום עבור 20 דקות.
- להגדיר מתחם סביב רקיק התבנית עם רדיד אלומיניום ויוצקים באיטיות PDMS הדפוקעל העובש.
- אופים את התבנית עם PDMS בתנור תיבה (פרמטרים אפייה 2 שלבים:. צעד אחד - 5 דקות כבש את מטמפרטורת חדר ל80 ° C שלב 2 - להחזיק ב80 מעלות צלזיוס למשך 17 דקות).
- לקלף PDMS מהתבנית ומניחים על נייר אלומיניום. חותך את שבבי assay עם סכין מנתח, להגדיר חורים עם כלי חבטות ביופסיה.
- הכן עובש לערוצי Assay
.2 להרכיב את המכשיר
- ידני ליישר את ערוצי assay PDMS עם אלקטרודות עובדות על השבב אלקטרוכימיים. PDMS מקלות גם לשבב אלקטרוכימיים, איטום הערוצים ומניעת דליפה.
- חבר צינור גמיש (OD 0.087 '' ומזהה 0.015 '') למרפק פלסטיק או מחבר ישר באמצעות צינור גמיש קצר כמתאם (OD .1875 '' ומזהה 0.0625 ''). צרף מחברים לכל אחד מפתחי הכניסה מחורר במכשיר.
- חבר מזרק בקצה השני שלצינורות ולמקם את המזרק במשאבת מזרק. לחלופין לשנות את המערכת של מזרק, צינור, ומחבר לפי הצעד נדרש הליך בסעיף 3 והפתרון המתאים לו.
.3 לנתח DNA הכלאה
הערה: הצג את כל פתרון באיטיות לתוך הערוץ בקצב זרימה של 200 μl / שעה עד שכל הערוץ מלא.
- Functionalize כל microchannel אנכי עם רצף בדיקה ssDNA שונה (לבצע במקביל ל3 microchannels האנכית נפרדת):
- ממלא כל microchannel עם פתרון דגירה בדיקה שונה ssDNA (חיץ פוספט 10 מ"מ, phosphine 100 mM NaCl, 10 מיקרומטר טריס (2-carboxyethyl) (TCEP), ובדיקת 1 מיקרומטר ssDNA), ודגירה עבור שעה 1 ואחריו שטיפת microchannel עם PBS.
- מלא את microchannel עם תמיסה המכילה 1 מ"מ של 6-mercapto-1-hexanol (MCH) במאגר של 10 מ"מ PBS, 100 mM NaCl ו1.395 מ"מ TCEP, וincuבייט עבור שעה 1 ואחריו שטיפת microchannel עם PBS.
- הרם את PDMS, לסובב 90 ° לכיוון אופקי, ולמקם את מטה וחושפים שורות נפרדות של תאי תגובה עם כל שורה המכילה דלפק ייחודי ואלקטרודה השוואתית (איור S1).
- מלא את microchannels עם פתרון מדידת שליטה של 4x מרוכז ציטראט מלוחים נתרן חיץ (SSC), והדגירה של 20 דקות.
- מדידת רקע: מלא את microchannels עם 5 מ"מ ferricyanide / 5 של ברזל מ"מ בפתרון PBS ולהקליט את ערכי העכבה של המערכת אלקטרוכימיים לתדרים שונים (ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימי; EIS) באמצעות potentiostat מחובר לעבודה, הדלפק, ואלקטרודות התייחסות ( טווח תדרים מMHz 1 עד 0.1 הרץ, 10 נקודות נתונים תדירות לעשור, 25 משרעת mV, 5 קיטוב mV לעומת אלקטרודה ההפניה): פרמטרים EIS. חזור על מדידה זו עבור כל אלקטרודה עובדת בmicrochannels. למדוד הכלאת DNA (לבצע עבור כל יעד ssDNA שאינו משלים ומשלים).
- מלא את microchannels עם יעד פתרון מדידת ssDNA של 4x מרוכז חיץ SSC המכיל 1 מיקרומטר של היעד ssDNA, ודגירה של 20 דקות. מדוד את DNA על פי צעד 3.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך ייצור לשליטה ומדויק למכשיר הניסוי הוא חיוני במחקר. זה מאפשר לחוקרים לקבל ניסויי תפוקה לשחזור וגבוהים. כאן יש לנו הפגנו תשואה גבוהה, תהליך microfabrication שחזור גבוה של biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic (איור 1). עם שיעור כישלון נמוך, כמה מכשירים הראו נושאי מליטה שיובילו לדליפת פתרון. על מנת לאמת את הפעילות אלקטרוכימי של biochip, מדידות voltammetry מחזוריות נעשות בmicrochannels מלאה ferricyanide / פרוציאני זוג רדוקס אלקטרו פעיל. איור 2 מראה את התגובה אלקטרוכימיים לשחזור של תשע אלקטרודה עבודה שונה על גבי השבב. תוצאות אלו מראות כי הפעילות אלקטרוכימי היא זהה בכל תשעת התאים של biochip המאפשר מדידות תפוקה גבוהה.
רוב חיישני הכלאת DNA לשתק ssDNAבדיקות על גבי משטח חיישן. כזהב משמש לדפוס אלקטרודות חישה למכשירי microfluidic, thiols הם מועמדים טובים ליצירת קשרים קוולנטיים חזקים עם חיישן משטחי 34. טכניקת נטיה נפוצה אחת מעורבת הוספת קבוצת תיאול פונקציונלי (-SH) בקצה אחד של ssDNA. קשר דיסולפיד SS מגן על קבוצת תיאול החופשית מפני התחמצנות עד שהוא מוכן לשימוש. ברגע שדיסולפיד הוא מופחת על ידי טריס (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) בנוסף, תיאול החופשי (-SH) הופך להיות זמין לאג"ח DNA למשטח זהב. ללא TCEP, אג"ח דיסולפיד של ssDNA גם להרכיב על האלקטרודה, אבל הקשר הוא חלש בהרבה מאג"ח תיאול-זהב ולא יישאר יציב לאורך כל הניסוי. בעבודה זו, monolayer ssDNA יציב לגילוי הכלאה הושג עם זמני דגירה בין שעה לשעות. ברגע שבדיקות ssDNA הורכבו על גבי האלקטרודה, 6-mercapto-1-hexanol (MCH) משמש לpassivateאזורים חשופים y על פני השטח כדי להפחית את תופעות מחייבות שאינם ספציפיות 35. קבוצת תיאול של MCH מאפשרת להרכבה עצמית על הזהב וקבוצת הידרוקסיל מפחיתה ספיחה הלא ספציפית של ssDNA בפתרון. ריכוז TCEP הגבוה משמש כדי להקטין את קבוצות תיאול שאולי חמצון ליצור קשרי דיסולפיד. ללא תוכן TCEP הגבוה במאגר, MCH יהווה monolayers לא יציב ונתוני העכבה היה להשתנות בהתאם עקב וריאציות עם מטען המשטח. יש MCH אחר פונקציה חשובה כאשר משתמשים בו כפסיבציה עם מולקולות ssDNA. תהליך ספיחת חמצוני של MCH מזריק אלקטרונים לאלקטרודה ומקטין את פוטנציאל פני השטח. זה גורם לאפקט אלקטרוסטטי עם ssDNA הבדיקה אניוני כבר משותק וssDNA עומד זקופה הרחק מהאלקטרודה 36. בדיקות זקופות להגביר את יעילות ההכלאה מאוד מאז היעד יש גדילי ssDNA גישה הרבה יותר קלה לדואראורך ntire של רצף הבדיקה. צעד פסיבציה זה חיוני להקמת מדידת בסיס עכבה יציבה של החיישן, הפחתת אותות חיוביים כוזבים והסרת כל מולקולות קשורות בחולשה מפני השטח.
מנגנון biosensing של אירועי הכלאת DNA מבוסס על כוחות הדחייה בין DNA הטעון השלילי ומולקולות אלקטרו פעיל אחרות. כאשר אירוע מתרחש הכלאה, כוחות הדחייה חזקים בין DNA הכלאה ומולקולות אלקטרו הפעיל להקשות על מיני אלקטרו פעיל לנטרל כיוון האלקטרודה 37. כאן אנו משתמשים ferricyanide זוג של ברזל / כמחוון מיני חיזור לכוחות הדחייה הללו, הנמדדים באמצעות ספקטרוסקופיית אלקטרוכימיים עכבה (EIS). אנו מנצלים מנגנון biosensing זה בbiochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic, ולהפגין את יכולתה לזהות אירועי הכלאת DNA 33. איור 3 מציג אתהסלקטיביות של biosensor על ידי הממחיש וריאציות עכבה כתוצאה מאירועי הכלאה בין שלוש בדיקות ssDNA ויעד ssDNA המשלים שלהם. 13% תגובתיות צולבת עם ssDNA שאינו משלימים האחרים הבאים 20 דקות של דגירה כבר הוכיחה. תוצאות אלו מראות את הכדאיות של מכשיר microfabricated למדוד אירועי הכלאת DNA באופן לשחזור ותפוקה גבוהה. יש לנו גם הפגנו הרגישות של biosensor על ידי החדרת ריכוזים שונים של יעד ssDNA משלים לבדיקת החישה. איור 4 מראה את הפונקציונליות של biosensor עם מגמה של הגדלת ערכי עכבה לריכוזי יעד ssDNA גבוהים יותר. בעקבות חישובים של התנגדות diffusional הוגבלה 33 לריכוזים שונים של יעד ssDNA המשלים, ניתוח רגרסיה ליניארית הביא גבול תיאורטי של זיהוי של 3.8 ננומטר על ידי החישוב של ssDNA המקביל ריכוז יעד לאות הרקע. בסך הכל, biochip מראה את היכולת לחוש את הנוכחות של אירועי הכלאת DNA במהירות.
צילום איור 1 של מכשיר ארוז תחת בדיקה (ממדי שבב: 3.5 סנטימטר x 3.5 סנטימטר, גובה microchannel הוא 100 מיקרומטר ו500 מיקרומטר ברוחב).
איור 2 אימות אלקטרוכימי. Voltammograms המחזורי של 9 (3 X 3 ברשת) אלקטרודות עובדות בנוכחות בני זוג חיזור של ברזל / ferricyanide. שחזור בין אלקטרודות בדוגמת מוצג על ידי הצורה הדומה, גבהים שיא, והפרדת שיא עבור כל אלקטרודות.יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 ספציפי של biosensor. ההשפעה של אירועי הכלאה בין מטרות ssDNA שונות ושלוש בדיקות ssDNA שונות על התנגדות העברת מטען. על אירוע הכלאת DNA, כוח הדחייה החזק בין גדילי הדנ"א כפול הטעון השלילי ותוצאות המולקולות של הברזל / ferricyanide הטעונים השלילי בהתנגדות העברת תשלום גבוהה יותר.
פונקציונליות איור 4 של biosensor. עלילת נייקוויסטמדידות ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימיים בעקבות כניסתה של 0.01, 0.1, 1, ויעד 1 מיקרומטר ssDNA (חץ מציין הגדלת ריכוזי יעד ssDNA). ערכי העכבה מוגברות בתדרים נמוכים (~ 15 הרץ) לריכוזי ssDNA יעד גבוה הן בשל כוחות הדחייה חזקים בין dsDNA והמולקולות של הברזל / ferricyanide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנהלים שלנו להדגים את הייצור של biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic והניצול שלה לניתוח אירועי הכלאת DNA. באמצעות תהליך microfabrication תשואה גבוהה בשליטתנו לפתח מכשיר מורכב מערוצי microscale המשולבים עם מערך של חיישני אלקטרוכימיים. אנחנו פיתחנו פרמטרים עיבוד מבוקרים להליך photolithography של השבב אלקטרוכימיים ועובש ערוץ microfluidic דרך גישה איטרטיבית. צעדים אלה מספקים קווים מנחים ליצירת עתיד של התקנים אנליטיים ממוזערים אחרים. חשוב לציין, שהם מספקים שיטה כדי לייעל את הפרמטרים biosensing שונים כגון יחס אות לרעש, יציבות, ורגישות. בעקבות ייצור מכשיר, אנו functionalize מתמרים אלקטרוכימי עם הבדיקה ssDNA כbioreceptor, מתן מטרה אנליטיים ייחודית. למרות שהנהלים אלה מדגימים שיעור כישלון מכשיר נמוך, דליפת פתרון תערוכות להיות majoנושא r הבא הרכבה של המכשיר וזמן ההופעה של assay הכלאת DNA. חקירה נוספת של כישלון מליטה במכשירים כאלה תשפר את התשואה של התהליך ולהפוך אותו אידיאלי למחקר מיקרו ביו מערכות.
במחקרים שלנו, אנו מראים את היכולת של biochip במדויק ובאופן ספציפי לחוש אירועי הכלאת DNA. כחלק מפרמטרים עיצוב למייקרו מכשיר אנליטי חדש, יש להביא בחשבון את הייצור של המכשיר, הדורש גישה איטרטיבית כדי לייעל את הפרמטרים ייצור (לדוגמא, פרמטרים photolithography, ממדי microchannel, סוג של המתכת שהונחה). כדי לזהות ביעילות אירועי הכלאת DNA, הרכבה הבדיקה ssDNA ותנאי הכלאה צריכים להיות מותאמות גם כן (לדוגמא., זמן דגירה, ריכוז חיץ, ריכוז בדיקה, מניעת הספיחה לא ספציפית).
היכולת במהירות מסך FOr רצפי DNA מסוימים הוא מאוד מועילים בתחומי חקר הסרטן, גילוי שפעת והנדסה גנטית. שיטות זיהוי ערוכות ביותר לנצל תווית כדי לייצר את האות ולהשתמש בצעדי כביסה ודגירה מרובים. ניצול מכשירי microfluidic המוצע, הכלאת DNA תבוצע עם מספר גבוה של רצפי DNA באותו המכשיר ללא הצורך בתוויות מכל סוג. אנחנו מדמיינים יישומים לטווח קרוב שילוב יכולות מתוחכמות יותר לbiochip כדי לשפר את הביצועים והמודולריות שלה. לדוגמא, יש מיקרופלואידיקה מבוססת שסתום הפוטנציאל לספק biochip עם יכולות ניתוח אוטומטיות ומבוקר. דוגמא נוספת היא functionalizing המכשיר עם bioreceptors אחר, מתן נכסי חישה ייחודיים שיכול לשמש במגוון רחב יותר של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים קרן רוברט וו דויטש, איום ביטחון הפחתת הסוכנות (DTRA), וקרן המדע מתעוררים הגבולות הלאומיים במחקר וחדשנות (אפרים) לתמיכה כספית. המחברים מודים גם ננוטכנולוגיה של אוניברסיטת מרילנד וFabLab לתמיכת מתקן חדר נקי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | 0.0625" |
| 1 ml syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 | |
References
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
