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Bioengineering

लेबल मुक्त डीएनए संकरण विश्लेषण के लिए एक microfluidic आधारित विद्युत Biochip

Published: September 10, 2014 doi: 10.3791/51797
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

हम डीएनए संकरण का पता लगाने के लिए एक microfluidic आधारित विद्युत biochip प्रस्तुत करते हैं. SsDNA जांच functionalization के बाद, विशिष्टता, संवेदनशीलता, और सीमा का पता लगाने पूरक और गैर पूरक ssDNA लक्ष्य के साथ अध्ययन कर रहे हैं. परिणाम 3.8 एनएम की एक सीमा का पता लगाने के साथ, विद्युत प्रणाली पर डीएनए संकरण की घटनाओं के प्रभाव को वर्णन.

Abstract

सूक्ष्म पैमाने में विश्लेषणात्मक benchtop प्रक्रियाओं के miniaturization प्रतिक्रिया समय, लागत, और पूर्व प्रसंस्करण कदम के एकीकरण के संबंध में महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. यह बिंदु का ख्याल विभिन्न रोगों के लिए कम से बायोमार्कर की वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए एक प्रौद्योगिकी प्रदान करता है क्योंकि डीएनए संकरण की घटनाओं का विश्लेषण करने की दिशा में इन उपकरणों का उपयोग महत्वपूर्ण है. हालांकि, जब डिवाइस पदचिह्न विभिन्न भौतिक घटना का बढ़ता प्रभुत्व कम हो जाती है. ये घटना निर्माण सटीक और डिवाइस के संचालन विश्वसनीयता प्रभावित करते हैं. इसलिए, सही ढंग से समग्र प्रदर्शन में सुधार के क्रम में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से इन उपकरणों के निर्माण और संचालित करने के लिए एक बड़ी जरूरत है. यहाँ, हम प्रोटोकॉल और निर्माण और डीएनए संकरण की घटनाओं का सटीक विश्लेषण के लिए एक microfluidic आधारित विद्युत biochip के आपरेशन के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन. biochip दो भागों से बना है: एक microfluidic चिप के साथतीन polydimethylsiloxane (PDMS) से बना समानांतर सूक्ष्म चैनलों, और 3 एक्स 3 arrayed विद्युत माइक्रो चिप. डीएनए संकरण की घटनाओं विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (EIS) विश्लेषण का उपयोग कर पता चला रहे हैं. EIS विश्लेषण इन लंबाई तराजू पर प्रमुख हैं कि विद्युत प्रणाली की संपत्तियों की निगरानी विविधताओं सक्षम बनाता है. Biosensor साथ दोनों चार्ज हस्तांतरण और diffusional प्रतिरोध के परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता के साथ, हम 20 मिनट निम्नलिखित पूरक ssDNA लक्ष्य को चयनात्मकता, 3.8 एनएम के एक गणना की सीमा का पता लगाने, और अन्य गैर पूरक ssDNA साथ एक 13% पार जेट का प्रदर्शन ऊष्मायन की. इस पद्धति सूक्ष्म पैमाने शासन में प्रसार के व्यवहार पर elucidating द्वारा और डीएनए संकरण की घटनाओं के अध्ययन को सक्षम करने से छोटी उपकरणों के प्रदर्शन में सुधार कर सकते हैं.

Introduction

Microfluidic प्रयोगशाला पर एक चिप (एलओसी) उपकरणों नैदानिक ​​निदान, पर्यावरण निगरानी और जैव चिकित्सा अनुसंधान में कई फायदे प्रदान करते हैं. इन उपकरणों प्रक्रियाओं की एक किस्म 1-4 संवर्धन अभिकर्मक मिश्रण, बाध्यकारी आधारित आत्मीयता, संकेत पारगमन, और सेल सहित जगह ले जा सकते हैं जहां चिप के क्षेत्रों के लिए तरल पदार्थ के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए microfluidic चैनलों का उपयोग. Microfluidics ऐसे microwell प्लेट पाठकों या electrophoretic जेल शिफ्ट assays के रूप में पारंपरिक नैदानिक ​​नैदानिक ​​उपकरणों पर कई लाभ प्रदान करता है. इसी तरह assays के प्रदर्शन करने के लिए कम अभिकर्मकों (microliters के विरोध के रूप nanoliters) microfluidic उपकरणों परिमाण के 2 से 3 आदेश की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, इन उपकरणों के कुछ जैविक घटनाओं चैनलों 5,6 के भीतर प्रजातियों के छोटे कारावास की वजह से होते हैं जिसके द्वारा गति बढ़ा सकते हैं. तीसरा, सेंसर लेबल से मुक्त detectio प्रदान कर सकते हैं जो लिथोग्राफी और नक़्क़ाशी तकनीक का उपयोग microfluidic उपकरणों, के भीतर एकीकृत किया जा सकता हैएन. अन्त में, इन उपकरणों के उत्पादन और 7-10 संचालित करने के लिए तकनीशियन की ओर से छोटे से काम की आवश्यकता के लिए सस्ती कर रहे हैं.

लेबल से मुक्त पता लगाने के लिए आम तौर पर एक ऑप्टिकल या बिजली ट्रांसड्यूसर का उपयोग किया जाता है. ऑप्टिकल उपकरणों की वजह से नमूने में analytes साथ कम हस्तक्षेप करने के लिए बेहतर संवेदन प्रदर्शन पेश कर सकते हैं. फिर भी, उनके प्रदर्शन नमूना की पृष्ठभूमि संवेदक 11 के रूप में ही गूंज तरंगदैर्ध्य है जहां मामलों में समझौता किया है. Microfluidic प्रणालियों में जैविक और रासायनिक पता लगाने के प्रदर्शन करने के लिए विद्युत संकेतों का उपयोग करने के कई फायदे हैं. इन सेंसरों आम तौर पर केवल संचालित करने के लिए नमूनों इलेक्ट्रोड की आवश्यकता के बाद से निर्माण स्वाभाविक कम जटिल है. अन्य संकेत के तौर तरीकों संकेत 12-15 कन्वर्ट करने के लिए एक ट्रांसड्यूसर की आवश्यकता हो सकती है, जबकि इसके अलावा, विद्युत संकेतों को सीधे सबसे माप उपकरणों के साथ interfaced किया जा सकता है. विद्युत सेंसर आमतौर impedanc में बदलाव को मापनेई 16,17, समाई 18, या redox गतिविधि 19. इन प्रणालियों छोटी कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि नई चुनौतियां पेश कर रहे हैं. काबू पाने के लिए सबसे महत्वपूर्ण चुनौतियों में शामिल हैं: नमूना तैयार करने और (कारण कम नमूना मात्रा और रेनॉल्ड्स संख्या के लिए) के तरल पदार्थ के मिश्रण, भौतिक और रासायनिक प्रभाव (केशिका बलों सहित, सतह खुरदरापन, निर्माण सामग्री और analytes के बीच रासायनिक बातचीत), कम संकेत जटिल जैविक नमूने (जैसे, रक्त और लार) में विद्युत सक्रिय analytes से 20-23, और संभावित हस्तक्षेप (कम सतह क्षेत्र और मात्रा द्वारा उत्पादित) से शोर अनुपात. इन प्रभावों की आगे की जांच उनके समग्र प्रदर्शन पर सुधार होगा कि एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से इन उपकरणों का सही निर्माण और संचालन के लिए दिशा निर्देश दिए जाएंगे.

डीएनए संकरण का पता लगाने आनुवंशिक विकारों 24,25 और CANC के विभिन्न रूपों का निदान करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता हैएर 26. हर साल, इन्फ्लूएंजा के कई उपभेदों डीएनए संकरण तकनीक 27 से परिणाम का उपयोग रोगियों में पहचाने जाते हैं. इन्फ्लूएंजा वायरस संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले 28 में 36,000 लोगों की मृत्यु प्रत्येक वर्ष के लिए खातों. ऐसे उदाहरण संवेदनशीलता या विशिष्टता का त्याग किए बिना कम नमूना मात्रा के साथ एक थाली पाठक या जेल शिफ्ट परख के रूप में और लागत का एक अंश में एक ही परख तकनीक प्रदर्शन कर सकते हैं कि एक पीठ टॉप microfluidic डिवाइस से फायदा हो सकता है. कारण लेबल से मुक्त विद्युत संवेदन के कई फायदे के लिए, यह डीएनए संकरण की घटनाओं 29,30 का पता लगाने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. (मिलीमीटर रेंज में) वृहद पैमाने पर इलेक्ट्रोड ब्याज के समाधान के साथ बीकर में डूबा हुआ है, जहां एक सेटअप उनके मिलान पूरक दृश्यों के लिए एकल असहाय डीएनए दृश्यों के बंधन कैनेटीक्स के बारे में बहुत संवेदनशील डेटा प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हाल ही में, माइकर में विद्युत संवेदन शामिल करने में कुछ अग्रिम रहे हैंडीएनए संकरण के लिए ofluidics. अध्ययन संकरण कैनेटीक्स 31 और microfluidic चैनलों में पता लगाने के लिए 15 के लिए सेंसर के एकीकरण के संबंध में प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, अभी भी जटिल नमूना तैयार कदम बिना समानांतर में डीएनए संकरण की घटनाओं का विश्लेषण कर सकते हैं कि एक तेजी से उच्च throughput microfluidic डिवाइस की आवश्यकता मौजूद है.

इस काम में प्रस्तुत युक्ति एकाधिक बातचीत समानांतर में और जटिल नमूना तैयार कदम बिना जांच किए जाने के लिए अनुमति देता है कि एक मंच प्रदान करता है. हमारी प्रोटोकॉल विद्युत biochips सूक्ष्म विद्युत प्रणाली (एमईएमएस) प्रौद्योगिकी 32,33 के साथ microfabricated कर रहे हैं कि कैसे microfluidic आधारित प्रस्तुत करता है. हम इलेक्ट्रोड की एक सरणी के शामिल (PDMS) polydimethylsiloxane से बना microfluidic चिप, और विद्युत चिप दोनों के निर्माण की प्रक्रिया का वर्णन. ssDNA जांच के साथ biochip की रासायनिक functionalization भी संबोधित किया है. अंत में, abilविशेष रूप से ssDNA ठिकानों का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए biosensor के अल्पसंख्यक प्रदर्शन किया है. कुल मिलाकर, microfluidic आधारित विद्युत biochip एक तेजी से और उच्च throughput विश्लेषण तकनीक है. यह जैविक अणुओं और आयोजित करने transducers के बीच बातचीत की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रयोगशाला पर एक चिप आवेदनों की एक किस्म में उपयोग किया जा सकता है.

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Protocol

Microfluidic चिप की 1 Microfabrication

  1. विद्युत चिप तैयार
    1. पैटर्न गोल्ड इलेक्ट्रोड
      1. एसीटोन, मेथनॉल, और isopropanol ("एमी" स्वच्छ) के साथ एक खाली 4 '' सिलिकॉन वेफर (प्रधानमंत्री ग्रेड गुणवत्ता) कुल्ला. एन 2 बंदूक के साथ सुखाने के द्वारा पीछा विआयनीकृत पानी (डीआई) के साथ वेफर से isopropanol कुल्ला.
      2. प्लाज्मा बढ़ाकर रासायनिक वाष्प जमाव (PECVD) उपकरण के साथ एक 1 माइक्रोन मोटी 2 Sio passivation परत आगे बढ़ें. एक डीसी sputtering उपकरण के साथ सोने के 2,000 एक मोटी परत के बाद क्रोमियम की एक 200 एक मोटी परत जमा.
      3. स्पिन "PR1" सकारात्मक photoresist (कताई पैरामीटर: 3,000 आरपीएम, 1000 rpm / सेकंड, 30 सेकंड) 1.6 माइक्रोन मोटी वर्दी फिल्म ~ बनाने के लिए. पूर्व सेंकना एक गर्म थाली पर 100 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए वेफर.
      4. 190 एमजे / एक photomask के माध्यम से 405 एनएम तरंगदैर्ध्य में 2 सेमी के साथ वेफर बेनकाब. 352 देव में 30 सेकंड के लिए वेफर का विकासeloper एन 2 बंदूक के साथ डि साथ वेफर और सूखी कुल्ला और.
      5. 1.5 मिनट के लिए सोने एचेंट साथ सोने खोदना. ~ 30 सेकंड के लिए क्रोमियम एचेंट साथ क्रोमियम खोदना. डि साथ वेफर कुल्ला और एन 2 बंदूक के साथ सूखी.
      6. "एमी" स्वच्छ प्रक्रिया के साथ photoresist पट्टी.
        नोट: मजबूत आक्सीकारक और संभावित विस्फोटक.
      7. 1 एच 2 एसओ 4: 4 के साथ वेफर साफ एच 2 ओ 2 मिश्रण ("पिरान्हा" स्वच्छ) 1 मिनट के लिए. डि साथ वेफर कुल्ला और एन 2 बंदूक के साथ सूखी.
    2. पैटर्न प्लैटिनम इलेक्ट्रोड
      1. स्पिन "PR2" सकारात्मक photoresist (कताई पैरामीटर: 3,000 आरपीएम, 1000 rpm / सेकंड, 30 सेकंड) 1.4 माइक्रोन मोटी वर्दी फिल्म ~ बनाने के लिए. पूर्व सेंकना एक गर्म थाली पर 100 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए वेफर.
      2. 30 एमजे / एक photomask के माध्यम से 405 एनएम तरंगदैर्ध्य में 2 सेमी के साथ वेफर बेनकाब. एक गर्म थाली पर 125 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड के लिए वेफर सेंकना. बाढ़ का पर्दाफाश1000 एमजे / एक photomask बिना 405 एनएम तरंगदैर्ध्य में 2 सेमी के साथ वेफर. 6 में 2 मिनट के लिए वेफर का विकास: 1 AZ400K डेवलपर और डि साथ वेफर कुल्ला और एन 2 बंदूक के साथ सूखी.
      3. एक ई बीम वाष्पीकरण प्रणाली का उपयोग प्लैटिनम की एक 1600 की एक मोटी परत के बाद टाइटेनियम की एक 400 एक मोटी परत जमा.
      4. एसीटोन और isopropanol से कुल्ला द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए एक ultrasonicated एसीटोन स्नान में photoresist लिफ्ट बंद. डि साथ वेफर कुल्ला और एन 2 बंदूक के साथ सूखी.
  2. परख चैनल तैयार
    1. परख चैनल के लिए मोल्ड तैयार
      1. "एमी" स्वच्छ प्रक्रिया के साथ एक खाली 4 '' सिलिकॉन वेफर (टेस्ट ग्रेड गुणवत्ता) कुल्ला. डि साथ वेफर से isopropanol कुल्ला एन 2 बंदूक के साथ सुखाने के द्वारा पीछा किया.
      2. स्पिन "PR3" नकारात्मक photoresist (2 कदम कताई पैरामीटर:. एक कदम - 600 आरपीएम, 120 आरपीएम / सेकंड, 10 सेकंड दो कदम - 1,150 आरपीएम, 383 आरपीएम / सेक,27 सेकंड) वर्दी फिल्म ~ 100 माइक्रोन मोटी बनाने के लिए. पूर्व सेंकना एक गर्म प्लेट (2 कदम पाक मापदंडों पर वेफर:. एक कदम - 300 डिग्री सेल्सियस / घंटा पर 65 डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के तापमान से रैंप और 10 मिनट के लिए तापमान पकड़ चरण 2 - 95 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप 300 डिग्री सेल्सियस / घंटा और 30 मिनट के लिए पकड़ तापमान).
      3. 2500 एमजे / एक photomask के माध्यम से 405 एनएम तरंगदैर्ध्य में 2 सेमी के साथ वेफर बेनकाब. पोस्ट सेंकना 300 डिग्री सेल्सियस / घंटा पर 95 डिग्री सेल्सियस के ऊपर ramping और वेफर एक गर्म थाली पर 10 मिनट के लिए तापमान पकड़ो. Propylene Glycol Monomethyl ईथर एसीटेट (PGMEA) डेवलपर में 10 मिनट के लिए वेफर का विकास करना. एन 2 बंदूक के साथ isopropanol और सूखी साथ वेफर कुल्ला.
    2. परख चैनल बनाना
      1. 20 मिनट के लिए एक निर्वात चैम्बर में 1 polydimethylsiloxane (PDMS) मिश्रण (elastomer के 20 ग्राम, इलाज एजेंट की 2 जी) और पूरी तरह से देगास: 10 तैयार करें.
      2. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ मोल्ड वेफर चारों ओर एक दीवार को परिभाषित करें और धीरे धीरे uncured PDMS डालनामोल्ड पर.
      3. एक बॉक्स भट्ठी में PDMS साथ मोल्ड सेंकना (2 कदम पाक पैरामीटर:. एक कदम - 5 मिनट 80 डिग्री करने के लिए कमरे के तापमान से रैंप सी चरण 2 - 17 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर पकड़).
      4. एल्यूमीनियम पन्नी पर मोल्ड और जगह से पील दूर PDMS. एक बायोप्सी छिद्रण उपकरण के साथ छेद को परिभाषित, एक सर्जन चाकू के साथ परख चिप्स काटें.

2 डिवाइस इकट्ठे

  1. मैन्युअल विद्युत चिप पर काम कर इलेक्ट्रोड के साथ PDMS परख चैनलों संरेखित. PDMS चैनलों सील और रिसाव को रोकने, विद्युत चिप को अच्छी तरह से चिपक जाती है.
  2. एक प्लास्टिक कोहनी या सीधे कनेक्टर एक एडाप्टर (आयुध डिपो .1875 '' और आईडी 0.0625 '') के रूप में एक छोटी लचीला ट्यूब का उपयोग करने के लिए एक लचीला टयूबिंग (आयुध डिपो 0.087 '' और आईडी 0.015 ') कनेक्ट करें. डिवाइस में छेद छिद्रित inlets से प्रत्येक के लिए कनेक्टर्स संलग्न.
  3. के दूसरे छोर पर एक सिरिंज कनेक्टट्यूबिंग और एक सिरिंज पंप में सिरिंज जगह है. वैकल्पिक रूप से धारा 3 में आवश्यक प्रक्रिया कदम और अपनी इसी समाधान के अनुसार एक सिरिंज का सेट, एक ट्यूब, और एक योजक बदल जाते हैं.

3 डीएनए संकरण का विश्लेषण करें

नोट: पूरे चैनल भरा है जब तक 200 μl / घंटा की एक प्रवाह दर पर चैनल में धीरे धीरे हर समाधान का परिचय.

  1. एक अलग ssDNA जांच अनुक्रम के साथ एक खड़ी microchannel functionalize (3 अलग खड़ी microchannels के समानांतर में प्रदर्शन):
    1. प्रत्येक एक अलग ssDNA जांच ऊष्मायन समाधान के साथ microchannel भरें (10 मिमी फॉस्फेट बफर, 100 मिमी NaCl, 10 माइक्रोन Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP), और 1 माइक्रोन जांच ssDNA), और microchannel rinsing द्वारा पीछा 1 घंटे के लिए सेते पीबीएस के साथ.
    2. एक 10 मिमी पीबीएस, 100 मिमी NaCl और 1.395 मिमी TCEP के एक बफर में 6 mercapto-1-HEXANOL (एमसीएच) के 1 मिमी युक्त समाधान, और incu साथ microchannel भरें1 घंटे के लिए पीटा पीबीएस के साथ microchannel rinsing द्वारा पीछा किया.
  2. , PDMS लिफ्ट बंद एक क्षैतिज अभिविन्यास के लिए 90 डिग्री से बारी बारी से, और एक अद्वितीय काउंटर और संदर्भ इलेक्ट्रोड (चित्रा S1) युक्त प्रत्येक पंक्ति के साथ प्रतिक्रिया कक्षों की अलग पंक्तियों को बेनकाब करने के लिए नीचे जगह है.
  3. 4x के नियंत्रण माप समाधान के साथ microchannels खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बफर केंद्रित भरें, और 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. पृष्ठभूमि माप:; (काम, काउंटर से जुड़े एक potentiostat का उपयोग कर, और संदर्भ इलेक्ट्रोड 5 मिमी पीबीएस समाधान में / 5 मिमी ferrocyanide ferricyanide साथ microchannels भरें और (EIS विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी) विभिन्न आवृत्तियों के लिए विद्युत प्रणाली की प्रतिबाधा मूल्यों रिकॉर्ड EIS मापदंडों: 1 मेगाहर्ट्ज से 0.1 हर्ट्ज, प्रति दशक 10 आवृत्ति डेटा अंक, 25 एम वी आयाम, संदर्भ इलेक्ट्रोड बनाम 5 एम वी ध्रुवीकरण) के लिए आवृत्ति रेंज. Microchannels में प्रत्येक कार्य इलेक्ट्रोड के लिए इस माप दोहराएँ. (प्रत्येक गैर पूरक और अनुपूरक ssDNA लक्ष्य के लिए प्रदर्शन) डीएनए संकरण उपाय.
    1. 4x का लक्ष्य ssDNA माप समाधान के साथ microchannels भरें लक्ष्य ssDNA की 1 माइक्रोन युक्त एसएससी बफर केंद्रित है, और 20 मिनट के लिए सेते हैं. 3.4 कदम के अनुसार डीएनए उपाय.

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Representative Results

प्रयोगात्मक उपकरण के लिए एक चलाया और सटीक विनिर्माण प्रक्रिया अनुसंधान में आवश्यक है. यह शोधकर्ताओं प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च throughput प्रयोगों प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम एक microfluidic आधारित विद्युत biochip (चित्रा 1) के एक उच्च उपज, उच्च reproducibility microfabrication प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है. एक कम विफलता दर के साथ, कुछ उपकरणों के समाधान रिसाव के लिए नेतृत्व कि संबंधों के मुद्दों से पता चला है. Biochip की विद्युत गतिविधि को मान्य करने के लिए, चक्रीय Voltammetry माप एक विद्युत सक्रिय redox जोड़े ferricyanide / ferrocyanide से भरा microchannels में किया जाता है. 2 चिप पर नौ अलग अलग काम इलेक्ट्रोड की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विद्युत प्रतिक्रिया से पता चलता है. इन परिणामों के विद्युत गतिविधि उच्च throughput माप की अनुमति biochip के सभी नौ कक्षों में यही पता चलता है कि.

अधिकांश डीएनए संकरण सेंसर ssDNA स्थिरएक संवेदक सतह पर जांच. सोने के पैटर्न के लिए microfluidic उपकरणों के लिए संवेदन इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल किया जाता है, thiols सेंसर 34 सतहों के साथ मजबूत सहसंयोजक बांड फार्म के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं. एक आम विकार तकनीक ssDNA के एक छोर पर एक कार्यात्मक thiol (-SH) समूह जोड़ने शामिल किया गया. इसे इस्तेमाल करने के लिए तैयार है जब तक एसएस डाइसल्फ़ाइड बंधन ऑक्सीकरण से मुक्त thiol समूह की सुरक्षा करता है. डाइसल्फ़ाइड Tris से कम है एक बार (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) इसके अलावा, मुक्त thiol (-SH) एक सोने की सतह को डीएनए बांड के लिए उपलब्ध हो जाता है. TCEP बिना, ssDNA की डाइसल्फ़ाइड बांड भी इलेक्ट्रोड पर इकट्ठा करेंगे, लेकिन बांड thiol सोने बांड की तुलना में बहुत कमजोर है और प्रयोग के दौरान स्थिर नहीं रहेगी. इस काम में, संकरण का पता लगाने के लिए एक स्थिर ssDNA monolayer एक और दो घंटे के बीच ऊष्मायन समय के साथ हासिल किया गया है. SsDNA जांच इलेक्ट्रोड पर इकट्ठा किया गया है एक बार, 6 mercapto-1-HEXANOL (एमसीएच) एक passivate करने के लिए प्रयोग किया जाता हैसतह पर वाई उजागर क्षेत्रों गैर विशिष्ट बाध्यकारी प्रभाव 35 कम करने के लिए. मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य के thiol समूह सोने पर स्वयं विधानसभा के लिए अनुमति देता है और हाइड्रॉक्सिल समूह समाधान में ssDNA की गैर विशिष्ट सोखना कम कर देता है. उच्च TCEP एकाग्रता डाइसल्फ़ाइड बांड फार्म को ऑक्सीकरण हो सकता है कि thiol समूहों को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बफर में उच्च TCEP सामग्री के बिना, मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य अस्थिर monolayers फार्म होगा और प्रतिबाधा डेटा की वजह से सतह चार्ज के साथ विविधताओं के अनुसार भिन्न होता है. SsDNA अणुओं के साथ passivation के रूप में प्रयोग जब मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य एक और महत्वपूर्ण कार्य किया है. मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य की ऑक्सीडेटिव सोखना प्रक्रिया इलेक्ट्रोड में इलेक्ट्रॉनों injects और सतह संभावित कम कर देता है. इस anionic जांच ssDNA साथ एक electrostatic प्रभाव पहले से ही स्थिर होता है और ssDNA ईमानदार दूर इलेक्ट्रोड 36 से खड़ा है. ईमानदार जांच बहुत ssDNA किस्में ई बहुत आसान उपयोग कर सकते है लक्ष्य के बाद से संकरण दक्षता में वृद्धिजांच अनुक्रम का ntire लंबाई. इस passivation कदम, संवेदक की एक स्थिर प्रतिबाधा आधारभूत माप की स्थापना झूठी सकारात्मक संकेतों को कम करने और सतह से किसी भी कमजोर बाध्य अणुओं को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है.

डीएनए संकरण की घटनाओं की biosensing तंत्र नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए और अन्य विद्युत सक्रिय अणुओं के बीच प्रतिकर्षण बलों पर आधारित है. एक संकरण घटना होती है, तो संकरित डीएनए और विद्युत सक्रिय अणुओं के बीच मजबूत प्रतिकर्षण बलों यह कठिन विद्युत सक्रिय प्रजातियों इलेक्ट्रोड 37 की ओर फैलाना है. यहाँ हम विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (EIS) का उपयोग कर मापा जाता है जो इन प्रतिकर्षण बलों के लिए redox प्रजातियों सूचक के रूप में एक ferricyanide / ferrocyanide जोड़े का उपयोग करें. हम microfluidic आधारित विद्युत biochip में इस biosensing तंत्र का उपयोग, और डीएनए संकरण की घटनाओं में 33 का पता लगाने के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन. 3 से पता चलता हैतीन ssDNA जांच और उनके पूरक ssDNA लक्ष्य के बीच संकरण की घटनाओं का एक परिणाम के रूप में प्रतिबाधा विविधताओं illustrating द्वारा biosensor के चयनात्मकता. ऊष्मायन के 20 मिनट निम्न अन्य गैर पूरक ssDNA साथ एक 13% पार जेट प्रदर्शन किया गया है. इन परिणामों के एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च throughput ढंग से डीएनए संकरण की घटनाओं को मापने के लिए microfabricated डिवाइस की व्यवहार्यता दिखा. हम भी संवेदन जांच करने के लिए पूरक ssDNA लक्ष्य के विभिन्न सांद्रता शुरू करने से biosensor की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है. 4 उच्च ssDNA लक्ष्य सांद्रता के लिए प्रतिबाधा मूल्यों में वृद्धि की प्रवृत्ति के साथ biosensor की कार्यक्षमता पता चलता है. पूरक ssDNA लक्ष्य के विभिन्न सांद्रता के लिए प्रतिबंधित diffusional प्रतिरोध 33 की गणना के बाद, एक रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण इसी ssDNA की गणना से 3.8 एनएम का पता लगाने के एक सैद्धांतिक सीमा में हुई पृष्ठभूमि संकेत के लिए लक्ष्य एकाग्रता. कुल मिलाकर, biochip तेजी से डीएनए संकरण की घटनाओं की उपस्थिति को महसूस करने की क्षमता को दर्शाता है.

चित्रा 1
परीक्षण के अंतर्गत पैक डिवाइस की संख्या 1 तस्वीर (चिप आयाम: 3.5 सेमी x 3.5 सेमी; microchannel ऊंचाई 100 मीटर और चौड़ाई में 500 माइक्रोन है).

चित्रा 2
चित्रा 2 विद्युत मान्यता. 9 (3 एक्स 3 ग्रिड) की चक्रीय voltammograms ferricyanide / ferrocyanide redox जोड़ी की उपस्थिति में काम कर इलेक्ट्रोड. नमूनों इलेक्ट्रोड के बीच reproducibility के सभी इलेक्ट्रोड के लिए इसी तरह के आकार, शिखर हाइट्स, और शिखर जुदाई से दिखाया गया है."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा biosensor के 3 विशिष्टता. अलग ssDNA लक्ष्य और चार्ज हस्तांतरण के विरोध पर तीन अलग ssDNA जांच के बीच संकरण की घटनाओं का प्रभाव. डीएनए संकरण घटना पर, नकारात्मक आरोप लगाया डबल असहाय डीएनए और उच्च चार्ज हस्तांतरण प्रतिरोध में नकारात्मक आरोप लगाया ferrocyanide / ferricyanide अणुओं परिणाम के बीच मजबूत प्रतिकर्षण बल.

चित्रा 4
Biosensor की चित्रा 4 कार्यशीलता. Nyquist साजिश0.01, 0.1, 1, और 1 माइक्रोन लक्ष्य ssDNA की शुरूआत के बाद विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी माप का (तीर ssDNA लक्ष्य सांद्रता बढ़ रही है इंगित करता है). उच्च लक्ष्य ssDNA सांद्रता के लिए कम आवृत्तियों (~ 15 हर्ट्ज) पर वृद्धि हुई प्रतिबाधा मूल्यों dsDNA और ferrocyanide / ferricyanide अणुओं के बीच मजबूत प्रतिकर्षण बलों के कारण होते हैं.

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Discussion

हमारी प्रक्रियाओं एक microfluidic आधारित विद्युत biochip के निर्माण और डीएनए संकरण की घटनाओं के विश्लेषण के लिए इसके उपयोग का प्रदर्शन. एक उच्च उपज नियंत्रित microfabrication प्रक्रिया के माध्यम से हम विद्युत transducers के एक सरणी के साथ एकीकृत microscale चैनलों के शामिल एक डिवाइस विकसित. हम चलने का एक दृष्टिकोण के माध्यम से विद्युत चिप और microfluidic चैनल मोल्ड के photolithography प्रक्रिया के लिए नियंत्रित प्रसंस्करण पैरामीटर तैयार कर लिया है. ये कदम अन्य छोटी विश्लेषणात्मक उपकरणों के भविष्य के निर्माण के लिए दिशा निर्देश प्रदान करते हैं. महत्वपूर्ण बात है, वे इस तरह के संकेत करने वाली शोर अनुपात, स्थिरता, और संवेदनशीलता के रूप में विभिन्न biosensing मापदंडों अनुकूलन करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. उपकरण निर्माण के बाद, हम एक अद्वितीय विश्लेषणात्मक उद्देश्य उपलब्ध कराने, एक bioreceptor रूप ssDNA जांच के साथ विद्युत transducers functionalize. इन प्रक्रियाओं कम युक्ति विफलता दर का प्रदर्शन हालांकि, समाधान रिसाव एक majo होने का पता चलता हैडिवाइस की और डीएनए संकरण परख के प्रदर्शन के दौरान विधानसभा निम्नलिखित R मुद्दा. इस तरह के उपकरणों में संबंध विफलता की आगे की जांच प्रक्रिया की उपज में सुधार और सूक्ष्म जैव प्रणाली के अध्ययन के लिए यह आदर्श बनाना होगा.

हमारे अध्ययन में, हम सही और विशेष रूप से डीएनए संकरण की घटनाओं भावना को biochip की क्षमता दिखा. एक नई विश्लेषणात्मक माइक्रो डिवाइस के लिए डिजाइन मानकों के हिस्से के रूप में, एक को ध्यान में निर्माण मानकों को अनुकूलित करने के लिए चलने का एक दृष्टिकोण की मांग जो डिवाइस के निर्माण लेना चाहिए (उदाहरण के लिए, photolithography मापदंडों, microchannel आयाम, जमा धातु के प्रकार). कुशलतापूर्वक डीएनए संकरण की घटनाओं का पता लगाने के लिए, ssDNA जांच विधानसभा और संकरण की स्थिति के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित किया जाना है (जैसे., ऊष्मायन समय, बफर एकाग्रता, जांच एकाग्रता, गैर विशिष्ट सोखना की रोकथाम).

जल्दी एफओ स्क्रीन करने की क्षमताआर विशेष डीएनए दृश्यों कैंसर अनुसंधान, इन्फ्लूएंजा का पता लगाने और जेनेटिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में बहुत लाभदायक है. अधिकांश arrayed तरीकों का पता लगाने के संकेत उत्पादन और कई धोने और ऊष्मायन चरणों का उपयोग करने के लिए एक लेबल का उपयोग. प्रस्तावित microfluidic उपकरणों का उपयोग, डीएनए संकरण किसी भी तरह के लेबल के लिए आवश्यकता के बिना एक ही डिवाइस में डीएनए दृश्यों की उच्च संख्या के साथ प्रदर्शन किया जाएगा. हम अपने प्रदर्शन और प्रतिरूपकता सुधार करने के लिए biochip के लिए अधिक परिष्कृत क्षमताओं को एकीकृत निकट अवधि के आवेदनों की कल्पना. उदाहरण के लिए, वाल्व आधारित microfluidics स्वचालित और नियंत्रित विश्लेषण क्षमताओं के साथ biochip प्रदान करने की क्षमता है. एक अन्य उदाहरण, अन्य bioreceptors साथ डिवाइस functionalizing अनुप्रयोगों का एक व्यापक रेंज में इस्तेमाल किया जा सकता है कि अद्वितीय संवेदन गुण प्रदान कर रहा है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों वित्तीय सहायता के लिए रॉबर्ट डब्ल्यू Deutsch फाउंडेशन, डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी (DTRA), और अनुसंधान में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन इमर्जिंग फ्रंटियर्स और अभिनव (EFRI) स्वीकार करते हैं. लेखकों को भी cleanroom सुविधा समर्थन के लिए मैरीलैंड Nanocenter और उसके Fablab धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'' Silicon wafer Ultrasil 4-5664 Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1") Microchem positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2") Hoechst Celanse positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3") Microchem negative photoresist
Gold etchant Transene TFA No dilution
Chromium etchant Transene 1020AC No dilution
PDMS elastomer Dow Corning 3097366 1004
PDMS curing agent Dow Corning 3097358 1004
Biopsy punching tool Healthlink BP20
Tygon flexible tubing Cole Parmer  R 3603 0.015"
Tygon flexible adapter Cole Parmer  06417-41 0.0625"
1 ml syringe Beckton-Dickenson 301025
Monobasic potassium phosphate Fluka 1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous Sigma RES20765-A7
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine Aldrich C4706
6-mercapto-1-hexanol Aldrich 451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer Sigma 93017
Potassium hexacyanoferrate(III) Aldrich 455946
Complementary ssDNA #1 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) Oxford Instruments PlasmaLab System 100 Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit AJA International ATC 1800-V For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system Denton Custom-built For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat CH Instruments 660D
Syringe pump KD Scientific KDS230

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 91 विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी डीएनए संकरण biosensor biochip microfluidics लेबल से मुक्त पता लगाने प्रतिबंधित प्रसार microfabrication
लेबल मुक्त डीएनए संकरण विश्लेषण के लिए एक microfluidic आधारित विद्युत Biochip
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