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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Une biopuce microfluidique électrochimique à base d'analyse ADN hybridation Sans étiquette

Published: September 10, 2014 doi: 10.3791/51797
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

Nous présentons une biopuce microfluidique à base électrochimique-pour la détection d'hybridation d'ADN. Après ssADN sonde fonctionnalisation, la spécificité, la sensibilité et la limite de détection sont étudiées avec des objectifs de ssADN complémentaires et non complémentaires. Les résultats illustrent l'influence des événements d'hybridation d'ADN sur le système électrochimique, avec une limite de détection de 3,8 nM.

Abstract

La miniaturisation des procédures analytiques de paillasse dans la micro-échelle fournit des avantages significatifs en ce qui concerne le temps de réaction, le coût, et l'intégration des étapes de pré-traitement. L'utilisation de ces dispositifs vers l'analyse des événements d'hybridation de l'ADN est important car il offre une technologie pour de vrai l'évaluation des temps de biomarqueurs au point-of-care pour diverses maladies. Toutefois, lorsque l'empreinte de l'appareil diminue la domination de divers phénomènes physiques augmente. Ces phénomènes influent sur la précision de fabrication et la fiabilité de fonctionnement du dispositif. Par conséquent, il existe un grand besoin pour la fabrication de précision et de faire fonctionner ces dispositifs d'une manière reproductible dans le but d'améliorer la performance globale. Ici, nous décrivons les protocoles et les méthodes utilisées pour la fabrication et le fonctionnement d'une biopuce microfluidique à base électrochimique pour une analyse précise des événements d'hybridation d'ADN. La biopuce est composé de deux parties: une puce microfluidique avectrois micro-canaux parallèles en polydiméthylsiloxane (PDMS), et une micro-puce Arrayed électrochimique 3 x 3. Les événements d'hybridation d'ADN sont détectés en utilisant la spectroscopie d'impédance électrochimique (SIE) d'analyse. L'analyse permet EIS variations de surveillance des propriétés du système électrochimique qui sont dominantes à ces échelles de longueur. Avec la possibilité de surveiller les changements à la fois de transfert de charge et de résistance à la diffusion avec le biocapteur, nous démontrons que la sélectivité pour les objectifs de ADNsb complémentaires, une limite de détection calculée de 3,8 nM, et une réactivité croisée avec d'autres ADN à un brin non-complémentaire de 13% après 20 min d'incubation. Cette méthode permet d'améliorer les performances des dispositifs miniaturisés en éclaircissant sur le comportement de diffusion à l'échelle micro-régime et en permettant l'étude des événements d'hybridation d'ADN.

Introduction

Lab-on-a-chip microfluidique dispositifs (LOC) de fournir de nombreux avantages dans le diagnostic clinique, la surveillance environnementale et la recherche biomédicale. Ces dispositifs utilisent des canaux microfluidiques pour commander l'écoulement de fluide dans les régions de la puce où une variété de procédures peut avoir lieu notamment de mélange des réactifs, l'affinité de liaison sur la base, la transduction du signal, et la culture de cellules 4.1. Microfluidique offre de nombreux avantages par rapport aux outils de diagnostic cliniques conventionnels tels que des lecteurs de plaques de microtitration ou des essais de retard sur gel d'électrophorèse. Les dispositifs microfluidiques nécessitent 2 à 3 ordres de grandeur (au lieu de nanolitres microlitres) de moins de réactifs pour réaliser des tests similaires. En outre, ces dispositifs peuvent accroître la vitesse à laquelle certains événements biologiques se produisent en raison de la plus petite confinement des espèces dans les canaux 5,6. En troisième lieu, les capteurs peuvent être intégrés dans des dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie et de gravure, qui peuvent fournir detectio sans étiquetten. Enfin, ces dispositifs sont peu coûteux à produire et nécessiter peu de travail de la part du technicien pour fonctionner 7-10.

Détection sans étiquette est habituellement effectuée en utilisant un capteur optique ou électrique. Les unités optiques peuvent présenter de meilleures performances de détection en raison de faibles niveaux d'interférence avec des analytes dans l'échantillon. Néanmoins, leur performance est compromise dans les cas où le fond de l'échantillon a la même longueur d'onde de résonance que le capteur 11. Il ya de nombreux avantages à l'aide de signaux électriques pour effectuer une détection chimique et biologique dans les systèmes microfluidiques. La fabrication est intrinsèquement moins compliqué puisque ces capteurs ne nécessitent généralement des électrodes à motifs pour fonctionner. En outre, les signaux électriques peuvent être directement interfacés avec la plupart des équipements de mesure pendant que les autres modalités de signaux peuvent nécessiter un transducteur pour convertir le signal de 12 à 15. Capteurs électriques mesurent généralement des changements dans impedance 16,17, capacité 18 ou 19 redox activité. Cependant, de nouveaux défis sont présentés comme ces systèmes sont miniaturisés. Les défis les plus importants à surmonter sont les suivants: préparation de l'échantillon et le mélange des fluides (en raison de la faible volume d'échantillon et le nombre de Reynolds), les effets physiques et chimiques (y compris les forces de capillarité, la rugosité de surface, les interactions chimiques entre les matériaux de construction et les analytes), faible signalisation sur-bruit (produit par la réduction de la superficie de la surface et du volume) de 20 à 23, et tout risque d'interférence à partir de substances à analyser électro-actif dans des échantillons biologiques complexes (par exemple, de sang et de salive). Une enquête plus approfondie de ces effets se traduira par des lignes directrices pour une fabrication précise et le fonctionnement de ces dispositifs d'une manière reproductible qui permettraient d'améliorer leur performance globale.

La détection d'hybridation d'ADN est largement utilisé pour le diagnostic des maladies génétiques et 24,25 différentes formes de cancer 26. Chaque année, plusieurs souches de la grippe sont identifiés chez les patients utilisant les résultats de techniques d'hybridation d'ADN 27. Le virus de la grippe représente à lui seul 36 000 décès chaque année aux États-Unis 28. Ces exemples pourraient bénéficier d'une paillasse dispositif microfluidique qui peut effectuer les mêmes techniques d'essai comme un essai de déplacement de lecteur de plaque ou d'un gel avec un volume d'échantillon et à une faible fraction du coût, sans sacrifier la sensibilité ou la spécificité. En raison des nombreux avantages de l'étiquette libre-détection électrochimique, il a été largement utilisée pour la détection d'événements d'hybridation d'ADN 29,30. Une configuration d'électrodes, où la macro-échelle (de l'ordre du millimètre) sont plongées dans des béchers avec la solution d'intérêt peut être utilisée pour fournir des données très sensibles en ce qui concerne la cinétique de liaison des séquences d'ADN simples brins à leurs séquences complémentaires correspondantes. Récemment, il ya eu quelques progrès en intégrant la détection électrochimique en microfluidics pour hybridation de l'ADN. Des études ont été effectuées en ce qui concerne la cinétique d'hybridation 31 et de l'intégration de capteurs de détection 15 dans les canaux microfluidiques. Cependant, il existe encore un besoin pour un dispositif microfluidique à haut débit rapide qui permet d'analyser les événements d'hybridation d'ADN en parallèle, sans étapes compliquées de préparation de l'échantillon.

Le dispositif présenté dans ce travail fournit une plate-forme qui permet de multiples interactions qui seront projetés en parallèle et sans étapes compliquées de préparation des échantillons. Notre protocole présente comment microfluidique à base de biopuces électrochimiques sont microfabriqués avec les systèmes micro-électromécaniques (MEMS) 32,33. On décrit le procédé de fabrication à la fois de la puce microfluidique, en polydiméthylsiloxane (PDMS), et la puce électrochimique, composé d'un réseau d'électrodes. La fonctionnalisation chimique de la biopuce avec des sondes ADN simple brin est également abordé. Enfin, la capalité du biocapteur pour détecter spécifiquement et analyser des cibles d'ADN simple brin est démontrée. Dans l'ensemble, la biopuce microfluidique à base électrochimique-est une technique rapide et l'analyse à haut débit. Il peut être utilisé pour étudier les interactions entre les molécules biologiques et les transducteurs conductrices, et peut être utilisé dans une variété d'applications de laboratoires sur puce.

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Protocol

1. microfabrication de la puce microfluidique

  1. Préparer électrochimique Chip
    1. Motif d'or électrodes
      1. Rincez un vide '' tranche 4 de silicium (prime de qualité de qualité) avec de l'acétone, le méthanol et l'isopropanol («AMI» propre). Rincer le isopropanol de la tranche avec de l'eau déminéralisée (DI) suivie d'un séchage avec N 2 armes à feu.
      2. Croître une couche de passivation d'épaisseur 1 pm de SiO 2 avec un dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (PECVD) outil. Déposer une couche épaisse de 200 Å de chrome suivie d'une épaisse couche de 2000 Å d'or avec un outil de pulvérisation DC.
      3. Spin "PR1" résine photosensible positif (filature paramètres: 3000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) afin de créer un film uniforme ~ 1,6 um d'épaisseur. Pré-cuire la plaque pendant 1 minute à 100 ° C sur une plaque chauffante.
      4. Exposer la tranche à 190 mJ / cm 2 à 405 nm de longueur d'onde à travers un photomasque. Développer la tranche de 30 secondes à 352 developer et rincer la plaquette avec DI et sec avec N 2 armes à feu.
      5. Graver la médaille d'or avec gravure d'or pendant 1,5 minutes. Graver le chrome avec gravure de chrome pour ~ 30 sec. Rincer la plaquette avec DI et sec avec N 2 armes à feu.
      6. Bande de la résine photosensible avec "AMI" procédure de nettoyage.
        REMARQUE: oxydant puissant et potentiellement explosif.
      7. Nettoyer la plaquette avec 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 ("piranha" clean) pendant 1 min. Rincer la plaquette avec DI et sec avec N 2 armes à feu.
    2. Motif Platinum électrodes
      1. Spin "PR2" résine photosensible positif (filature paramètres: 3000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) afin de créer un film uniforme ~ 1,4 um d'épaisseur. Pré-cuire la plaque pendant 1 minute à 100 ° C sur une plaque chauffante.
      2. Exposer la tranche à 30 mJ / cm 2 à 405 nm de longueur d'onde à travers un photomasque. Cuire la galette pendant 45 secondes à 125 ° C sur une plaque chauffante. Flood exposerla plaquette à 1000 mJ / cm 2 à 405 nm de longueur d'onde sans un photomasque. Développer la plaquette pendant 2 min dans 6: 1 développeur de AZ400K et rincer la plaquette avec DI et sec avec N 2 armes à feu.
      3. Déposer une couche d'épaisseur de 400 Å de titane suivie d'une couche d'épaisseur 1600 Å de platine à l'aide d'un système d'évaporation par faisceau d'électrons.
      4. Soulever résine photosensible dans un bain d'ultrasons pendant l'acétone 5 min puis rincer avec de l'acétone et l'isopropanol. Rincer la plaquette avec DI et sec avec N 2 armes à feu.
  2. Préparer dosage Chaînes
    1. Préparer Moule pour dosage Chaînes
      1. Rincez un vide '' plaquette de silicium 4 (qualité grade de test) avec "AMI" procédure de nettoyage. Rincer le isopropanol de la plaquette avec DI suivie d'un séchage avec N 2 armes à feu.
      2. Spin "PR3" résine photosensible négative (2 étapes filature paramètres:. Étape - 600 rpm, 120 rpm / s, 10 s Étape deux - 1150 rpm, 383 rpm / sec,27 sec) pour créer un film uniforme ~ 100 um d'épaisseur. Pré-cuire la galette sur une plaque chauffante (paramètres de cuisson 2 étapes:. Première étape - montée en puissance de la température ambiante à 65 ° C à 300 ° C / h et maintenir la température pendant 10 min Étape 2 - rampe jusqu'à 95 ° C à 300 ° C / h et la température de maintien pendant 30 minutes).
      3. Exposer la tranche à 2500 mJ / cm 2 à 405 nm de longueur d'onde à travers un photomasque. Post-cuire la galette rampe d'accélération jusqu'à 95 ° C à 300 ° C / h et maintenir la température pendant 10 minutes sur une plaque chauffante. Développer la plaquette pendant 10 min dans Monométhylique du Propylène Glycol Ether Acetate (PGMEA) développeur. Rincer la plaque avec de l'isopropanol et sec avec N 2 armes à feu.
    2. Fabriquer dosage Chaînes
      1. Préparation 10: 1 polydiméthylsiloxane (PDMS) mélange (20 g d'élastomère, 2 g d'agent de reticulation) et complètement dégazer dans une chambre à vide pendant 20 min.
      2. Définir une enceinte autour de la plaquette de moule de papier d'aluminium et verser lentement le PDMS non durcisur le moule.
      3. Cuire le moule avec les PDMS dans un four de boîte (paramètres de cuisson 2 étapes:. Étape - 5 min rampe depuis la température ambiante à 80 ° C Étape 2 - maintenir à 80 ° C pendant 17 min).
      4. Peler les PDMS du moule et placer sur une feuille d'aluminium. Couper les puces de dosage avec un couteau de chirurgien, définir des trous avec un outil de poinçonnage biopsie.

2 Monter le périphérique

  1. Aligner manuellement les canaux de dosage PDMS avec les électrodes de travail sur la puce électrochimique. PDMS colle bien à la puce électrochimique, l'étanchéité des canaux et empêcher les fuites.
  2. Connectez un tuyau flexible (DO 0,087 '' et ID 0,015 ') à un coude en plastique ou connecteur droit à l'aide d'un tube flexible à court comme un adaptateur (OD 0,1875' 'et ID 0,0625' '). Fixez les connecteurs à chacune des entrées percées de trous dans le dispositif.
  3. Raccorder une seringue à l'autre extrémité dele tube et placer la seringue dans une pompe à seringue. Alternativement changer le jeu d'une seringue, un tube, et un connecteur selon l'étape de la procédure prévue aux articles 3 et sa solution correspondante.

3 Analyser hybridation de l'ADN

REMARQUE: Introduire chaque solution lentement dans le canal à un débit de 200 ul / h de débit jusqu'à ce que tout le canal est rempli.

  1. Fonctionnaliser chaque microcanal vertical avec une séquence de la sonde ADN à un brin différent (en parallèle pour effectuer des micro-canaux verticaux séparés 3):
    1. Remplir chaque microcanal avec une solution sonde d'incubation ADNsb différent (10 mM de tampon phosphate, 100 mM de NaCl, 10 uM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), et 1 uM sonde ADN sb), et incuber pendant 1 heure suivie d'un rinçage du microcanal avec du PBS.
    2. Remplir les micro-canaux avec une solution contenant 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) dans un tampon de PBS à 10 mM, NaCl 100 mM et 1,395 mM de TCEP, et incubate pendant 1 heure suivie d'un rinçage avec du PBS microcanal.
  2. Soulevez le PDMS, une rotation de 90 ° pour une orientation horizontale, et placer pour exposer des rangées séparées de chambres de réaction à chaque ligne contenant un guichet unique et l'électrode de référence (Figure S1).
  3. Remplissez les microcanaux avec une solution de mesure de contrôle de 4x concentrés citrate de solution saline sodium (SSC) tampon, et incuber pendant 20 min.
  4. mesure de fond: Complétez les microcanaux avec 5 mM de ferricyanure / 5 ferrocyanure mM dans une solution de PBS et enregistrer les valeurs d'impédance du système électrochimique pour des fréquences différentes (spectroscopie d'impédance électrochimique; EIE) à l'aide d'un potentiostat connecté au travail, contre, et des électrodes de référence ( EIS paramètres: gamme de fréquence de 1 MHz à 0,1 Hz, 10 points de données de fréquence par décennie, 25 mV d'amplitude, 5 mV par rapport à la polarisation de l'électrode de référence). Répétez cette mesure pour chaque électrode de travail dans les microcanaux. Mesurer hybridation de l'ADN (effectuer pour chaque cible de ssADN non complémentaire et complémentaire).
    1. Remplir les micro-canaux avec une solution de mesure cible ADNsb de 4x tampon SSC concentré contenant 1 pM de l'ADN à un brin cible, et incuber pendant 20 min. Mesurer l'ADN selon l'étape 3.4.

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Representative Results

Procédé de fabrication précise et contrôlable pour le dispositif expérimental est essentiel dans la recherche. Il permet aux chercheurs d'obtenir des expériences de débit reproductibles et élevés. Ici, nous avons démontré un rendement élevé, un processus de microfabrication haute reproductibilité d'une biopuce microfluidique à base électrochimique (Figure 1). Avec un faible taux d'échec, quelques dispositifs ont montré des problèmes de liaison qui mènent à une fuite de solution. Afin de valider l'activité électrochimique de la biopuce, les mesures de voltamétrie cyclique sont effectuées dans les micro-canaux remplis d'un couple redox de ferricyanure / ferrocyanure électro-actif. Figure 2 montre la réponse électrochimique reproductible de neuf électrode de travail différent sur ​​la puce. Ces résultats montrent que l'activité électrochimique est le même dans tous les neuf chambres de la biopuce permettant des mesures à haut débit.

La plupart des capteurs d'hybridation d'ADN immobiliser ssADNdes sondes sur une surface du capteur. Comme l'or est utilisé pour modèle les électrodes de détection pour les dispositifs microfluidiques, les thiols sont de bons candidats pour former des liaisons covalentes fortes avec les surfaces de capteur 34. Une technique de conjugaison commun impliqué l'ajout d'un groupe thiol fonctionnel (SH) à une extrémité de l'ADN sb. La liaison disulfure SS protège le groupe thiol libre de l'oxydation jusqu'à ce qu'il soit prêt à être utilisé. Une fois que le disulfure est réduit de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) De plus, le thiol libre (-SH) devient disponible pour lier l'ADN sur une surface d'or. Sans PTCE, les liaisons disulfures de la ssADN assemblera également sur l'électrode, mais le lien est beaucoup plus faible que la liaison thiol-or et ne resteront pas stables tout au long de l'expérience. Dans ce travail, une monocouche ADNsb stable pour la détection de l'hybridation a été réalisée avec des temps d'incubation de une à deux heures. Une fois que les sondes d'ADN simple brin ont été assemblés sur l'électrode, la 6-mercapto-1-hexanol (MCH) est utilisé pour passiver unrégions exposées y sur la surface pour réduire les effets de liaison non spécifiques 35. Le groupe thiol de la MCH permet d'auto-assemblage sur l'or et le groupe hydroxyle réduit l'adsorption non-spécifique de l'ADN à un brin dans la solution. La forte concentration TCEP est utilisé pour réduire les groupes thiol qui peut avoir oxydés pour former des liaisons disulfures. Sans la forte teneur en PTCE dans la mémoire tampon, le SMI serait former des monocouches instables et les données d'impédance varie en conséquence en raison de variations avec la charge de surface. Le SMI a une autre fonction importante lorsque vous l'utilisez comme passivation avec des molécules ADN simple brin. Le procédé d'adsorption à l'oxydation de la MCH injecte des électrons dans l'électrode et permet de réduire le potentiel de surface. Cela provoque un effet électrostatique avec la sonde ADN à un brin déjà immobilisé anionique et l'ADNsb se tient debout à partir de la distance de l'électrode 36. Sondes verticales augmentent considérablement l'efficacité de l'hybridation de la cible depuis brins d'ADNss ont accès plus facile à l'entire longueur de la séquence de la sonde. Cette étape de passivation est cruciale pour l'établissement d'une mesure d'impédance de référence stable de la sonde, ce qui réduit les signaux faux positifs et d'éliminer les molécules faiblement liés à la surface.

Le mécanisme de biodétection d'événements d'hybridation d'ADN est basé sur des forces de répulsion entre l'ADN chargé négativement et d'autres molécules électro-actives. Quand un événement d'hybridation se produit, des forces de répulsion plus fortes entre l'ADN hybridée et les molécules électro-actives, il est plus difficile pour les espèces électro-actives de se diffuser vers l'électrode 37. Ici, nous utilisons un ferricyanure / ferrocyanure deux que l'indicateur d'espèces redox pour ces forces de répulsion, qui sont mesurés en utilisant la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS). Nous utilisons ce mécanisme de biocapteurs dans la biopuce microfluidique à base électrochimique, et de démontrer sa capacité à détecter des événements d'hybridation d'ADN 33. Figure 3 montre lessélectivité du biocapteur en illustrant les variations d'impédance en raison d'événements d'hybridation entre les trois sondes ADN simple brin et son ADN à un brin complémentaire cible. Une réactivité croisée avec d'autres ADN à un brin non complémentaires suivantes 20 min d'incubation à 13% a été démontrée. Ces résultats démontrent la faisabilité du dispositif miniature micro-usiné pour mesurer des événements d'hybridation d'ADN d'une manière reproductible et à haut débit. Nous avons également démontré la sensibilité du biocapteur par l'introduction de différentes concentrations de cible ADN à un brin complémentaire de la sonde de détection. Figure 4 montre le fonctionnement du biocapteur avec une tendance à l'augmentation des valeurs d'impédance pour les concentrations plus élevées ADN simple brin cible. A la suite des calculs de la résistance à la diffusion restreinte 33 pour différentes concentrations de cible ADNsb complémentaire, une analyse de régression linéaire a donné lieu à une limite théorique de détection de 3,8 nM par le calcul de l'ADN à un brin correspondant concentration cible pour le signal de fond. Dans l'ensemble, la biopuce représente la capacité de détecter rapidement la présence d'événements d'hybridation d'ADN.

Figure 1
Figure 1: Photographie de dispositif emballé sous test (dimensions de puces: 3,5 cm x 3,5 cm, hauteur de microcanaux est de 100 um et 500 um de largeur).

Figure 2
Figure 2: validation électrochimique. Des voltamogrammes cycliques de 9 (3 x 3 grille) des électrodes de travail en présence de ferrocyanure / ferricyanure couple redox. La reproductibilité entre les électrodes à motif est représenté par la forme analogue, les hauteurs de pic, et la séparation des pics de toutes les électrodes.Cible "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 Spécificité du biocapteur. L'incidence des événements d'hybridation entre les différentes cibles d'ADN simple brin et de l'ADN simple brin trois sondes différentes sur la résistance de transfert de charge. Lors d'un événement d'hybridation de l'ADN, la force de répulsion forte entre l'ADN double brin chargé négativement et les résultats molécules ferrocyanure / ferricyanure chargés négativement à une résistance plus élevée de transfert de charge.

Figure 4
Figure 4 Fonctionnalité du biocapteur. Diagramme de Nyquistdes mesures de spectroscopie d'impédance électrochimique suite à l'introduction de 0,01, 0,1, 1 et 1 uM cible ADN simple brin (La flèche indique l'augmentation des concentrations cibles ADN simple brin). Les valeurs de l'augmentation d'impédance à basse fréquence (~ 15 Hz) pour des concentrations cibles ADN simple brin supérieur sont dus aux forces de répulsion entre les solides et les molécules d'ADNdb ferrocyanure / ferricyanure.

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Discussion

Nos travaux montrent la fabrication d'une biopuce à base électrochimique microfluidique, et son utilisation pour l'analyse d'événements d'hybridation d'ADN. Grâce à un processus de microfabrication à haut rendement contrôlée, nous développons un dispositif composé de canaux micrométriques intégrés à un réseau de transducteurs électrochimiques. Nous avons mis au point des paramètres de traitement de la procédure de contrôle de photolithographie de la puce électrochimique et le moule à travers un canal microfluidique approche itérative. Ces étapes fournissent des lignes directrices pour la création future d'autres dispositifs d'analyse miniaturisés. Surtout, ils fournissent une méthode pour optimiser les différents paramètres de biodétection, comme le rapport signal-sur-bruit, la stabilité et la sensibilité. À la suite de la fabrication du dispositif, on fonctionnaliser les capteurs électrochimiques avec la sonde ADN à un brin en un biorécepteur, fournissant un but analytique unique. Bien que ces procédures montrent taux de défaillance de l'appareil faible, fuite de solution se révèle être une majoVolume de r après l'assemblage du dispositif et pendant l'exécution de l'essai d'hybridation d'ADN. Une enquête plus poussée de l'échec de liaison dans ces dispositifs permettrait d'améliorer le rendement du processus et le rendre idéal pour l'étude des micro-bio-systèmes.

Dans nos études, nous montrons la capacité de la biopuce pour détecter avec précision et en particulier des événements d'hybridation d'ADN. Dans le cadre des paramètres de conception d'un nouveau micro-dispositif d'analyse, il convient de prendre en considération la fabrication de l'appareil, ce qui exige une approche itérative pour optimiser les paramètres de fabrication (par exemple, les paramètres de photolithographie, les dimensions des microcanaux, le type du métal déposé). Afin de détecter efficacement les événements d'hybridation d'ADN, l'ADN sb ensemble de sonde et les conditions d'hybridation doivent être optimisés ainsi (par ex., Temps d'incubation, la concentration du tampon, la concentration de la sonde, la prévention de l'adsorption non-spécifique).

La capacité de déceler rapidement for des séquences particulières d'ADN est très bénéfique dans les domaines de la recherche sur le cancer, la détection de la grippe et du génie génétique. La plupart des méthodes de détection disposés utilisent un marqueur pour produire le signal et en utilisant de multiples étapes de lavage et d'incubation. En utilisant les dispositifs microfluidiques proposées, hybridation de l'ADN est effectué avec un nombre élevé de séquences d'ADN dans le même dispositif, sans la nécessité d'étiquettes de toute nature. Nous envisageons des applications à court terme intégrant des capacités plus sophistiquées pour la biopuce à améliorer sa performance et modularité. Par exemple, la microfluidique à base de soupape a le potentiel de fournir des capacités de la biopuce et automatiques contrôlées analyse. Un autre exemple est la fonctionnalisation de l'appareil avec d'autres biorécepteurs, offrant des propriétés de détection uniques qui peuvent être utilisés dans un large éventail d'applications.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient la Fondation Robert W. Deutsch, l'Agence de réduction de la Defense Threat (DTRA), et la Fondation nationale des sciences émergentes frontières dans la recherche et l'innovation (EFRI) pour un soutien financier. Les auteurs remercient également le NanoCenter Maryland et son Fablab de soutien de salle blanche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'' Silicon wafer Ultrasil 4-5664 Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1") Microchem positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2") Hoechst Celanse positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3") Microchem negative photoresist
Gold etchant Transene TFA No dilution
Chromium etchant Transene 1020AC No dilution
PDMS elastomer Dow Corning 3097366 1004
PDMS curing agent Dow Corning 3097358 1004
Biopsy punching tool Healthlink BP20
Tygon flexible tubing Cole Parmer  R 3603 0.015"
Tygon flexible adapter Cole Parmer  06417-41 0.0625"
1 ml syringe Beckton-Dickenson 301025
Monobasic potassium phosphate Fluka 1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous Sigma RES20765-A7
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine Aldrich C4706
6-mercapto-1-hexanol Aldrich 451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer Sigma 93017
Potassium hexacyanoferrate(III) Aldrich 455946
Complementary ssDNA #1 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) Oxford Instruments PlasmaLab System 100 Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit AJA International ATC 1800-V For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system Denton Custom-built For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat CH Instruments 660D
Syringe pump KD Scientific KDS230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
  2. Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
  3. Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
  4. Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
  5. Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
  6. Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
  7. Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
  8. Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
  9. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
  10. Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
  11. Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
  12. Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
  13. Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
  14. Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
  15. Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
  16. Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
  17. Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
  18. Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
  19. Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
  20. Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
  21. Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
  22. Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
  23. Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
  24. Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
  25. Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
  26. Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
  27. Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
  28. Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
  29. Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
  30. Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
  31. Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
  32. Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
  33. Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
  34. Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
  35. McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
  36. Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
  37. Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).

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