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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Published: September 10, 2014 doi: 10.3791/51797
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

Vi presentiamo un biochip elettrochimico basato microfluidica-per la rilevazione ibridazione DNA. A seguito di ssDNA sonda funzionalizzazione, la specificità, sensibilità, e il limite di rilevazione sono studiati con obiettivi ssDNA complementari e non complementari. I risultati illustrano l'influenza degli eventi di ibridazione DNA sul sistema elettrochimico, con un limite di rilevazione di 3,8 nM.

Abstract

La miniaturizzazione delle procedure analitiche da banco in micro-scala offre vantaggi significativi per quanto riguarda il tempo di reazione, costi, e l'integrazione delle fasi di pre-elaborazione. Utilizzando questi dispositivi verso l'analisi degli eventi di ibridazione del DNA è importante perché offre una tecnologia per la valutazione in tempo reale dei biomarcatori presso il punto di cura per varie malattie. Tuttavia, quando l'impronta dispositivo diminuisce il dominio di vari aumenti di fenomeni fisici. Questi fenomeni influenzano la precisione di fabbricazione e l'affidabilità di funzionamento del dispositivo. Pertanto, vi è una grande necessità di fabbricare accuratamente e farli funzionare in modo riproducibile al fine di migliorare le prestazioni complessive. Qui, descriviamo i protocolli ei metodi utilizzati per la fabbricazione e il funzionamento di un biochip elettrochimica microfluidica-based per l'analisi accurata di eventi di ibridazione DNA. Il biochip è composto di due parti: un chip microfluidica contre micro-canali paralleli fatti di polidimetilsilossano (PDMS), e un Arrayed microchip elettrochimica 3 x 3. Gli eventi di ibridazione DNA vengono rilevati mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) analisi. L'analisi EIS consente variazioni di monitoraggio delle proprietà del sistema elettrochimico che sono dominanti in queste scale di lunghezza. Con la possibilità di monitorare le variazioni sia di trasferimento di carica e la resistenza diffusionale con il biosensore, dimostriamo la selettività di obiettivi ssDNA complementari, un limite di rilevazione calcolato di 3,8 nM, ed una cross-reattività 13% con altri ssDNA non complementare dopo 20 min di incubazione. Questa metodologia può migliorare le prestazioni dei dispositivi miniaturizzati da chiarire sul comportamento di diffusione al regime micro-scala e consentendo lo studio di eventi di ibridazione DNA.

Introduction

Lab-on-a-chip microfluidica (LOC) dispositivi offrono numerosi vantaggi in diagnostica clinica, il monitoraggio ambientale e la ricerca biomedica. Questi dispositivi utilizzano canali microfluidici per controllare il flusso del fluido alle regioni del chip dove una varietà di procedure può avvenire compresa la miscelazione dei reagenti, affinità di base vincolante, trasduzione del segnale, e la cella coltura 1-4. Microfluidica offre molti vantaggi rispetto ai tradizionali strumenti diagnostici clinici, quali lettori di piastra Elisa o elettroforetica saggi di gel shift. Dispositivi microfluidici richiedono 2 o 3 ordini di grandezza (nanolitri al contrario di microlitri) minor numero di reagenti per eseguire test simili. Inoltre, questi dispositivi possono aumentare la velocità con cui alcuni eventi biologici si verificano a causa del confinamento più piccolo della specie all'interno dei canali 5,6. In terzo luogo, i sensori possono essere integrati all'interno di dispositivi microfluidici che utilizzano tecniche di litografia e incisione, che possono fornire detectio senza etichettan. Infine, questi dispositivi sono poco costosi da produrre e richiedono poco lavoro da parte del tecnico di operare 7-10.

Rilevamento libero-Label in genere viene eseguita utilizzando un trasduttore ottico o elettrico. Dispositivi ottici possono presentare migliori prestazioni di rilevamento a causa della minore interferenza con analiti nel campione. Tuttavia, le loro prestazioni è compromessa nel caso in cui lo sfondo del campione ha la stessa lunghezza d'onda di risonanza del sensore 11. Ci sono molti vantaggi di utilizzare segnali elettrici per eseguire il rilevamento biologico e chimico in sistemi microfluidici. La fabbricazione è intrinsecamente meno complicata dato che questi sensori in genere richiedono solo elettrodi fantasia per operare. Inoltre, i segnali elettrici possono essere interfacciati direttamente con la maggior parte delle apparecchiature di misura, mentre altre modalità di segnalazione possono richiedere un trasduttore per convertire il segnale 12-15. Sensori elettrici comunemente misurano variazioni di impedance 16,17, capacità 18, o redox di attività 19. Tuttavia, le nuove sfide che si presentano come tali sistemi sono miniaturizzati. Le sfide più importanti da superare comprendono: preparazione del campione e la miscelazione dei fluidi (a causa del basso volume del campione e il numero di Reynolds), effetti fisici e chimici (tra cui forze capillari, rugosità superficiale, le interazioni chimiche tra i materiali da costruzione e di analiti), basso rapporto segnale a-rumore (prodotto dalla zona ridotta superficie e di volume) 20-23, e il potenziale interferenza da analiti elettro-attivi in campioni biologici complessi (ad esempio, sangue e saliva). Ulteriori analisi di questi effetti si tradurrà in linee guida per una realizzazione accurata e il funzionamento di questi dispositivi in ​​modo riproducibile che potrebbero migliorare la loro performance complessiva.

Rilevazione ibridazione DNA è ampiamente utilizzato per diagnosticare malattie genetiche 24,25 e varie forme di cancer 26. Ogni anno, più ceppi di influenza sono identificati nei pazienti che utilizzano i risultati di tecniche di ibridazione del DNA 27. Il virus dell'influenza da solo incide per 36.000 morti ogni anno negli Stati Uniti 28. Tali esempi potrebbero beneficiare di un dispositivo da banco microfluidica in grado di eseguire le stesse tecniche di analisi come un lettore di piastre o gel shift assay con basso volume del campione e ad una frazione del costo senza sacrificare la sensibilità o la specificità. A causa dei numerosi vantaggi del libero-label rilevamento elettrochimico, è stato ampiamente utilizzato per il rilevamento di eventi di ibridazione DNA 29,30. Una configurazione in cui gli elettrodi macro-scala (nella gamma millimetro) sono immersi in bicchieri con la soluzione di interesse può essere utilizzato per fornire dati molto sensibili riguardanti la cinetica di legame delle singole sequenze di DNA non recuperabili alle loro sequenze complementari corrispondenti. Recentemente, ci sono stati alcuni progressi nella incorporando rilevamento elettrochimico in microfluidics per ibridazione DNA. Gli studi sono stati condotti per quanto riguarda la cinetica di ibridazione 31 e l'integrazione di sensori per il rilevamento a 15 canali microfluidici. Tuttavia, esiste ancora la necessità di un rapido throughput elevato dispositivo di microfluidica in grado di analizzare gli eventi di ibridazione DNA in parallelo senza complicate fasi di preparazione del campione.

Il dispositivo presentato in questo lavoro fornisce una piattaforma che permette molteplici interazioni siano proiettati in parallelo e senza complicate fasi di preparazione del campione. Il nostro protocollo presenta come microfluidica basata biochip elettrochimici sono microfabbricati con sistemi micro-elettromeccanici (MEMS), la tecnologia 32,33. Descriviamo il processo di fabbricazione sia del chip microfluidico, fatta di polidimetilsilossano (PDMS), e il chip elettrochimica, costituito da una matrice di elettrodi. La funzionalizzazione chimica del biochip con sonde ssDNA si rivolge anche. Infine, il Abillità del biosensore per rilevare in modo specifico e analizzare obiettivi ssDNA è dimostrata. Nel complesso, il biochip elettrochimica basata microfluidica-è una tecnica rapida e di analisi high-throughput. Può essere usato per studiare le interazioni tra le molecole biologiche e trasduttori di conduzione, e può essere utilizzata in una varietà di applicazioni lab-on-a-chip.

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Protocol

1 Microfabbricazione del Microfluidic Chip

  1. Preparare elettrochimica Chip
    1. Modello Oro Elettrodi
      1. Risciacquare un vuoto 4 '' wafer di silicio (qualità di prima qualità) con acetone, metanolo e isopropanolo ("AMI" clean). Sciacquare il isopropanolo dal wafer con acqua deionizzata (DI), seguita da asciugatura con N 2 pistola.
      2. Crescere uno spesso strato di SiO 2 1 micron con passivazione chimica da fase vapore deposizione al plasma (PECVD) strumento. Depositare uno strato spesso 200 di cromo seguito da uno strato spesso un 2000 d'oro con uno strumento di sputtering DC.
      3. Spin "PR1" photoresist positivo (parametri di filatura: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) per creare pellicola uniforme ~ 1.6 micron di spessore. Pre-cuocere il wafer per 1 min a 100 ° C su una piastra calda.
      4. Esporre la cialda con 190 mJ / cm 2 a 405 nm di lunghezza d'onda attraverso un fotomaschera. Sviluppare il wafer per 30 sec a 352 developer e sciacquare la cialda con DI e asciugare con N 2 pistola.
      5. Etch l'oro con oro mordenzante per 1,5 min. Etch cromo cromo mordenzante per ~ 30 sec. Sciacquare il wafer con DI e asciugare con N 2 pistola.
      6. Striscia il photoresist con "AMI" procedura di pulizia.
        NOTA: OSSIDANTE FORTE E POTENZIALMENTE ESPLOSIVA.
      7. Pulire la cialda con 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 miscela ("Piranha" clean) per 1 min. Sciacquare il wafer con DI e asciugare con N 2 pistola.
    2. Modello Platinum Elettrodi
      1. Spin "Pr2" photoresist positivo (parametri di filatura: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) per creare pellicola uniforme ~ 1.4 micron di spessore. Pre-cuocere il wafer per 1 min a 100 ° C su una piastra calda.
      2. Esporre la cialda con il 30 mJ / cm 2 a 405 nm di lunghezza d'onda attraverso un fotomaschera. Cuocere il wafer per 45 sec a 125 ° C su una piastra calda. Flood esporreil wafer con 1.000 mJ / cm 2 a 405 nm senza fotomaschera. Sviluppare il wafer per 2 min a 6: 1 sviluppatore AZ400K e sciacquare la cialda con DI e asciugare con N 2 pistola.
      3. Depositare uno strato dello spessore di 400 Å di titanio seguito da uno strato di spessore 1,600 Å di platino mediante un sistema di evaporazione e-beam.
      4. Sollevare fotoresist in un bagno di acetone ultrasonicated per 5 minuti seguita da risciacquo con acetone e isopropanolo. Sciacquare il wafer con DI e asciugare con N 2 pistola.
  2. Preparare Canali Assay
    1. Preparare Stampo per canali Assay
      1. Risciacquare un vuoto 4 '' wafer di silicio (grade qualità test) con "AMI" procedura di pulizia. Sciacquare il isopropanolo dal wafer con DI seguita da asciugatura con N 2 pistola.
      2. Spin "PR3" photoresist negativo (parametri di filatura 2-step:. Passo uno - 600 rpm, 120 rpm / sec, 10 sec Fase due - 1.150 rpm, 383 rpm / sec,27 sec) per creare pellicola uniforme ~ 100 micron di spessore. Pre-cuocere la cialda su una piastra calda (parametri di cottura 2-step:. Passo uno - rampa da temperatura ambiente a 65 ° C a 300 ° C / ora e mantenere la temperatura per 10 min Fase 2 - rampa fino a 95 ° C a 300 ° C / ora e la temperatura attesa per 30 min).
      3. Esporre la cialda con 2.500 mJ / cm 2 a 405 nm di lunghezza d'onda attraverso un fotomaschera. Post-cuocere il wafer da rampa fino a 95 ° C a 300 ° C / ora e mantenere la temperatura per 10 minuti su un piatto caldo. Sviluppare il wafer per 10 min in glicole propilenico MONOMETILETERE Acetato (PGMEA) sviluppatore. Sciacquare il wafer con isopropanolo e asciugare con N 2 pistola.
    2. Realizzare Canali Assay
      1. Preparare 10: 1 polidimetilsilossano (PDMS) miscela (20 g di elastomero, 2 g di induritore) e completamente degassamento in una camera a vuoto per 20 min.
      2. Definire un recinto attorno alla cialda stampo con un foglio di alluminio e versare lentamente la polimerizzato PDMSsopra lo stampo.
      3. Cuocere lo stampo con il PDMS in un forno scatola (parametri di cottura 2-step:. Passo uno - 5 min rampa da temperatura ambiente a 80 ° C Fase 2 - tenere a 80 ° C per 17 min).
      4. Togliete la PDMS dallo stampo e posto su un foglio di alluminio. Tagliare i chip di analisi con un coltello chirurgo, definire fori con uno strumento di biopsia di punzonatura.

2 Montare il dispositivo

  1. Allineare manualmente i canali test PDMS con gli elettrodi di lavoro sul chip elettrochimica. PDMS aderire bene al chip elettrochimica, sigillando i canali e prevenire perdite.
  2. Collegare un tubo flessibile (OD 0,087 '' e ID 0,015 '') per un gomito di plastica o connettore diritto con un breve tubo flessibile come un adattatore (OD 0,1875 '' e ID 0,0625 ''). Collegare i connettori a ciascuna delle bocche-forati nel dispositivo.
  3. Collegare una siringa all'altra estremità delil tubo e posizionare la siringa in una pompa a siringa. In alternativa modificare il set di una siringa, un tubo, e un connettore in base alla fase di procedura necessaria nella sezione 3 e la sua soluzione corrispondente.

3 Analizzare Ibridazione DNA

NOTA: Introdurre ciascuna soluzione lentamente nel canale ad una portata di 200 l / h fino a quando l'intero canale è riempito.

  1. Funzionalizzare ogni microcanali verticale con una differente sequenza di sonda ssDNA (eseguire in parallelo ai 3 microcanali verticali separate):
    1. Riempire ogni microcanali con una diversa soluzione della sonda di incubazione ssDNA (tampone fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, 10 mM tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP), e 1 mM sonda ssDNA), e incubare per 1 ora, seguito da risciacquo del microcanali con PBS.
    2. Riempire i microcanali con una soluzione contenente 1 mM di 6-mercapto-1-esanolo (MCH) in tampone di PBS 10 mM, NaCl 100 mM e 1.395 TCEP mM, e incubate per 1 ora seguita dal risciacquo del microcanali con PBS.
  2. Sollevare il PDMS, ruotare di 90 ° a un orientamento orizzontale, e mettere giù per esporre righe separate di camere di reazione con ciascuna riga contenente un contatore unico ed elettrodo di riferimento (Figura S1).
  3. Compila i microcanali con una soluzione di misurazione di controllo di 4x concentrati citrato salina-sodio (SSC) del buffer e incubare per 20 min.
  4. Misurazione del fondo: Compilare i microcanali con 5 mM ferricianuro / 5 mM ferrocianuro in soluzione PBS e registrare i valori di impedenza del sistema elettrochimico per diverse frequenze (spettroscopia di impedenza elettrochimica; EIS) con un potenziostato collegato al lavoro, bancone, e gli elettrodi di riferimento ( EIS parametri: gamma di frequenza da 1 MHz a 0.1 Hz, 10 punti dati di frequenza per ogni decennio, 25 mV di ampiezza, 5 mV polarizzazione contro l'elettrodo di riferimento). Ripetere questa misura per ogni elettrodo lavoro nei microcanali. Misurare ibridazione DNA (eseguire per ogni target ssDNA non-complementari e complementare).
    1. Riempire i microcanali con destinazione soluzione di misura ssDNA di 4x concentrato tampone SSC contenente 1 mM del target ssDNA, e incubare per 20 min. Misurare il DNA secondo al punto 3.4.

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Representative Results

Un controllabile e accurato processo di fabbricazione per il dispositivo sperimentale è essenziale nella ricerca. Esso consente ai ricercatori di ottenere esperimenti riproducibili e di throughput elevati. Qui abbiamo dimostrato un rendimento elevato, processo microfabbricazione alta riproducibilità di un biochip elettrochimica microfluidica-based (Figura 1). Con un tasso di fallimento basso, pochi dispositivi hanno mostrato problemi di incollaggio che portano a perdite di soluzione. Al fine di validare l'attività elettrochimica del biochip, misure di voltammetria ciclica sono fatte in microcanali riempiti di una coppia redox ferricianuro / ferrocianuro di elettro-attivi. Figura 2 mostra la risposta elettrochimica riproducibile di nove diversi dell'elettrodo di lavoro sul chip. Questi risultati dimostrano che l'attività elettrochimica è la stessa in tutte le nove camere del biochip consentendo misurazioni high-throughput.

La maggior parte dei sensori di ibridazione DNA immobilizzano ssDNAsonde su una superficie del sensore. Come l'oro è usato per modello gli elettrodi di rilevamento dei dispositivi microfluidici, tioli sono buoni candidati per formare forti legami covalenti con il sensore superfici 34. Una tecnica comune coniugazione comportato l'aggiunta di un gruppo tiolico funzionale (SH) ad una estremità del ssDNA. Il legame disolfuro SS protegge il gruppo tiolico libero da ossidazione fino a quando è pronto per essere utilizzato. Una volta che il disolfuro è ridotto di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) Inoltre, il tiolo libero (SH) diventa disponibile per legare il DNA di una superficie d'oro. Senza TCEP, i legami disolfuro del ssDNA anche montare sull'elettrodo, ma il legame è molto più debole del legame tiolo-oro e non rimarrà stabile per tutto l'esperimento. In questo lavoro, un monostrato ssDNA stabile per il rilevamento di ibridazione è stato raggiunto con tempi di incubazione tra una e due ore. Una volta che le sonde ssDNA sono stati montati sull'elettrodo, 6-mercapto-1-esanolo (MCH) è utilizzato per passivare unregioni esposte y sulla superficie per ridurre non specifici effetti vincolanti 35. Gruppo tiolico del MCH consente di autoassemblaggio sul oro e il gruppo ossidrile riduce adsorbimento non specifico del ssDNA in soluzione. La concentrazione elevata TCEP viene utilizzato per ridurre i gruppi tiolici che possono essere ossidati a formare legami disolfuro. Senza l'alto contenuto TCEP nel buffer, il MCH formerebbe monostrati instabili ed i dati di impedenza varierebbe di conseguenza a causa delle variazioni con la carica superficiale. Il MCH ha un'altra funzione importante quando lo si usa come passivazione con molecole di ssDNA. Il processo di adsorbimento ossidativa del MCH inietta elettroni nella elettrodo e riduce il potenziale superficiale. Questo provoca un effetto elettrostatico con la sonda ssDNA anionico già immobilizzato e il ssDNA sta in piedi distanza dall'elettrodo 36. Sonde verticali aumentano notevolmente l'efficienza di ibridazione in quanto l'obiettivo fili ssDNA hanno molto più facile accesso alla postantire lunghezza della sequenza di sonda. Questo passaggio passivazione è cruciale per stabilire una misura di base impedenza stabile del sensore, riducendo segnali falsi positivi e rimuovendo eventuali molecole debolmente legate dalla superficie.

Il meccanismo di biosensori di DNA eventi di ibridazione si basa sulle forze di repulsione tra il DNA carico negativamente e di altre molecole elettro-attivi. Quando si verifica un evento di ibridazione, più forti le forze di repulsione tra il DNA ibridato e le molecole elettro-attivi rendono più difficile per le specie elettro-attive per diffondere verso l'elettrodo 37. Qui usiamo un ferricianuro / coppia ferrocianuro come indicatore redox specie di queste forze di repulsione, che sono valutate con spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS). Utilizziamo questo meccanismo biosensori nel biochip elettrochimica microfluidica-based, e dimostrare la sua capacità di rilevare eventi di ibridazione del DNA 33. Figura 3 mostra ilselettività del biosensore illustrando variazioni di impedenza a seguito di eventi di ibridazione tra tre sonde ssDNA e il loro bersaglio complementare ssDNA. Un cross-reattività 13% con altre ssDNA non complementari seguenti 20 min di incubazione è stata dimostrata. Questi risultati dimostrano la fattibilità del dispositivo microfabbricazione per misurare DNA eventi di ibridazione in modo riproducibile e ad alta produttività. Abbiamo anche dimostrato la sensibilità del biosensore introducendo diverse concentrazioni di ssDNA complementare bersaglio alla sonda di rilevamento. Figura 4 mostra la funzionalità del biosensore con una tendenza all'aumento valori di impedenza per maggiori concentrazioni target ssDNA. Seguendo i calcoli della resistenza diffusionale ristretta 33 per diverse concentrazioni di complementare bersaglio ssDNA, un'analisi di regressione lineare determinato un limite teorico di rilevazione di 3,8 nM dal calcolo del corrispondente ssDNA concentrazione di riferimento per il segnale di fondo. Nel complesso, il biochip mostra la capacità di percepire rapidamente la presenza di eventi di ibridazione DNA.

Figura 1
Figura 1 Fotografia di dispositivo confezionato in prova (dimensioni di chip: 3,5 centimetri x 3,5 centimetri, altezza microcanali è 100 micron e 500 micron di larghezza).

Figura 2
Figura 2 convalida elettrochimico. Voltammograms ciclici di 9 (3 x 3 grid) elettrodi di lavoro in presenza di ferrocianuro / ferricianuro coppia redox. La riproducibilità tra gli elettrodi fantasia è indicato dalla forma simile, altezze dei picchi, e la separazione di picco per tutti gli elettrodi.Obiettivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" = "_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 Specificità del biosensore. L'impatto di eventi di ibridazione tra i diversi target ssDNA e tre diverse sonde ssDNA sulla resistenza di trasferimento di carica. Su DNA evento ibridazione, la forza di repulsione forte tra la carica negativa del DNA a doppia elica e la carica negativa molecole ferrocianuro / ferricianuro risultati in una maggiore resistenza al trasferimento di carica.

Figura 4
Figura 4 Funzionalità del biosensore. Diagramma di Nyquistdi misure elettrochimiche in seguito all'introduzione di 0,01, 0,1, 1, e 1 mM di destinazione ssDNA spettroscopia di impedenza (freccia indica concentrazioni crescenti di destinazione ssDNA). I valori di impedenza aumentati a frequenze basse (~ 15 Hz) per una maggiore destinazione concentrazioni ssDNA sono dovute alle forze di repulsione più forti tra il dsDNA e le molecole ferrocianuro / ferricianuro.

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Discussion

Le nostre procedure dimostrano la fabbricazione di un biochip elettrochimica basata microfluidica e il suo utilizzo per l'analisi di eventi di ibridazione del DNA. Attraverso un processo di microfabbricazione alta resa controllata sviluppiamo un dispositivo costituito da canali microscala, integrato con un insieme di trasduttori elettrochimici. Abbiamo ideato parametri di elaborazione controllate per la procedura di fotolitografia del chip elettrochimica e lo stampo canale microfluidica attraverso un approccio iterativo. Questi passaggi forniscono linee guida per la futura creazione di altri dispositivi analitici miniaturizzati. È importante sottolineare che, essi forniscono un metodo per ottimizzare i vari parametri biosensori, come segnale-rumore, la stabilità, e la sensibilità. A seguito di fabbricazione del dispositivo, abbiamo funzionalizzare i trasduttori elettrochimici con sonda ssDNA come bioreceptor, fornendo un unico scopo analitico. Sebbene queste procedure dimostrano basso tasso di guasto del dispositivo, perdite soluzione dimostra di essere un major seguente problema montaggio del dispositivo e durante l'esecuzione del saggio di ibridazione del DNA. Ulteriori indagini di errore di contatto in tali dispositivi potrebbe migliorare la resa del processo e lo rendono ideale per lo studio di micro-bio-sistemi.

Nei nostri studi, mostriamo la capacità del biochip per rilevare accuratamente e specificatamente eventi di ibridazione del DNA. Nell'ambito di parametri di progetto di un nuovo analitica micro-dispositivo, si deve prendere in considerazione la fabbricazione del dispositivo, che richiede un approccio iterativo per ottimizzare i parametri di fabbricazione (ad esempio, parametri di fotolitografia, dimensioni microcanali, tipo di metallo depositato). Per rilevare efficacemente eventi di ibridazione del DNA, gruppo sonda ssDNA e condizioni di ibridazione devono essere ottimizzati pure (ad es., Tempo di incubazione, concentrazione del tampone, la concentrazione della sonda, la prevenzione di adsorbimento non specifico).

La capacità di vagliare rapidamente for particolari sequenze di DNA è molto utile nel campo della ricerca sul cancro, l'individuazione dell'influenza e l'ingegneria genetica. Metodi di rilevamento più disposti utilizzano un'etichetta per produrre il segnale e utilizzare più fasi di lavaggio e di incubazione. Utilizzando i dispositivi microfluidici proposti, ibridazione DNA verrà effettuata con elevato numero di sequenze di DNA nello stesso dispositivo senza la necessità di etichette di qualsiasi tipo. Prevediamo applicazioni a breve termine che integrano le funzionalità più sofisticate per il biochip per migliorarne le prestazioni e modularità. Ad esempio, microfluidica basata valvola-ha il potenziale per fornire il biochip con capacità di analisi automatici e controllati. Un altro esempio è funzionalizzare il dispositivo con altri biorecettori, fornendo proprietà di rilevamento unici che possono essere utilizzati in una vasta gamma di applicazioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono il Robert W. Deutsch Fondazione, la Defense Threat Reduction Agency (DTRA), e la National Science Foundation Emerging frontiere della ricerca e innovazione (EFRI) per il sostegno finanziario. Gli autori ringraziano anche il Maryland Nanocenter e il suo Fablab per il supporto impianto di camera bianca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'' Silicon wafer Ultrasil 4-5664 Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1") Microchem positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2") Hoechst Celanse positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3") Microchem negative photoresist
Gold etchant Transene TFA No dilution
Chromium etchant Transene 1020AC No dilution
PDMS elastomer Dow Corning 3097366 1004
PDMS curing agent Dow Corning 3097358 1004
Biopsy punching tool Healthlink BP20
Tygon flexible tubing Cole Parmer  R 3603 0.015"
Tygon flexible adapter Cole Parmer  06417-41 0.0625"
1 ml syringe Beckton-Dickenson 301025
Monobasic potassium phosphate Fluka 1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous Sigma RES20765-A7
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine Aldrich C4706
6-mercapto-1-hexanol Aldrich 451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer Sigma 93017
Potassium hexacyanoferrate(III) Aldrich 455946
Complementary ssDNA #1 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) Oxford Instruments PlasmaLab System 100 Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit AJA International ATC 1800-V For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system Denton Custom-built For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat CH Instruments 660D
Syringe pump KD Scientific KDS230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Gordonov, T., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51797, doi:10.3791/51797 (2014).

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