Summary
우리는 DNA 혼성화 검출을위한 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 제시한다. ssDNA를 프로브 작용에 따라, 특이도, 민감도 및 검출 한계 보완 및 비 보완 ssDNA를 목표로 공부하고 있습니다. 결과는 3.8 nm의 검출 한계와 함께, 전기 화학적 시스템의 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 예시한다.
Abstract
마이크로 규모로 분석 벤치 탑 절차의 소형화는, 반응 시간, 비용, 및 사전 처리 단계의 통합에 관해서 상당한 이점을 제공한다. 그것은 치료 시점에서 각종 질병에 대한 바이오 마커의 실시간 평가를위한 기술을 제공하기 때문에 DNA 혼성화 사건의 분석으로 이들 장치를 이용하는 것이 중요하다. 그러나, 디바이스 풋 프린트는 다양한 물리적 현상 증가의 지배력을 감소시킨다. 이러한 현상은 가공 정밀도 및 장치의 작동 안정성에 영향을 미친다. 따라서, 정확하게 전반적인 성능을 개선하기 위해 재생 가능한 방식으로 이러한 장치를 제작하고 운영하는 중대한 필요성이 존재한다. 여기서, 우리는 프로토콜과 제조 및 DNA 혼성화 사건의 정확한 분석 용 미세 유체 기반 전기 화학적 바이오 칩의 동작에 사용되는 방법을 설명한다. 바이오 칩은 두 부분으로 구성되어있다 : 미세 유체 칩세 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 병렬 마이크로 채널, 3 × 3 배열 된 전기 마이크로 칩. DNA 혼성화 이벤트는 전기 화학 임피던스 분광법 (EIS) 분석을 이용하여 검출된다. EIS 분석이 길이 규모에서 지배적 인 전기 시스템의 특성의 모니터링 변화를 가능하게한다. 바이오 센서와 양 전하 전송 및 diffusional 저항의 변화를 모니터링 할 수있는 능력으로, 우리는 20 분 다음 상보 ssDNA를 대상으로 선택성, 3.8 ㎚의 계산 된 검출 한계, 및 다른 비 - 상보 ssDNA를 가진 13 % 교차 반응성을 보여 배양. 이 방법론은 마이크로 스케일 레짐에서 확산 동작에 의해 해명 및 DNA 혼성화 사건의 조사를 가능하게하여 소형화 된 장치의 성능을 향상시킬 수있다.
Introduction
미세 유체 랩 온어 칩 (LOC) 장치는 임상 진단, 환경 모니터링과 생물 의학 연구에 많은 장점을 제공한다. 이러한 장치는 다양한 절차 1-4 배양 시약 혼합, 결합 친화도 기반, 신호 전달, 세포를 포함하여 이루어질 수있는 칩의 영역에 유체 유동을 제어하기 위해 마이크로 유체 채널을 이용한다. 마이크로 유체는 마이크로 웰 플레이트 판독기 또는 전기 영동 겔 쉬프트 분석 같은 종래의 임상 진단 도구에 비해 많은 장점을 제공한다. 유사한 분석을 수행하기 위해 더 적은 시약 (㎕의 반대로 나노 리터) 미세 유동 장치는 크기가 2 ~ 3 명령을 필요로한다. 또한, 이러한 장치는 어떤 이벤트가 생물학적 5,6 채널 내의 종의 작은 한정으로 인해 발생할 수있는 속도를 증가시킬 수있다. 셋째, 센서는 라벨없는 detectio를 제공 할 수 리소그래피 및 에칭 기술을 이용하여 미세 유동 장치 내에 통합 될 수있다명. 마지막으로, 이러한 장치는 생산 및 7-10를 작동 할 수있는 기술자의 입장에서 약간의 작업을 필요로 저렴하다.
라벨없는 검출은 일반적으로 광학 또는 전기 변환기를 사용하여 수행됩니다. 광학 장치에 의한 샘플 분석 물과 저급 간섭 나은 감지 성능을 제공 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 그 성능은 샘플의 배경 센서 (11)와 동일한 공진 파장을 갖는 경우에 노출된다. 마이크로 유체 시스템에서 생물학적 및 화학적 검출을 수행하는 전기적인 신호를 이용하여 여러 가지 장점이있다. 이러한 센서는 일반적으로 만 작동 전극 패턴을 필요로하기 때문에 제조는 본질적으로 덜 복잡하다. 다른 양상 신호가 신호 12-15 변환 변환기를 동시에 요구할 수있다 또한, 전기 신호는 대부분 직접 측정 장비와 인터페이스 될 수있다. 전기 센서는 일반적으로 impedanc 변화를 측정전자 (16, 17), 용량 (18), 또는 산화 환원 활동 19. 이러한 시스템의 소형화 아르 그러나 새로운 도전이되게됩니다. 극복하는 가장 중요한 과제는 포함한다 : 샘플 준비 및 (인해 낮은 샘플 볼륨과 레이놀즈 수에) 유체의 혼합, 물리적 및 화학적 효과 (모세관 력을 포함하여, 표면 거칠기, 건축 자재 및 분석 간의 화학적 상호 작용), 낮은 신호 대를 복잡한 생물학적 시료 (예, 혈액 및 타액)에서 전기 활성 분석에서 20-23, 및 잠재적 인 간섭 (감소 된 표면적과 체적에 의해 제조) 잡음비. 이러한 효과의 추가 조사는 전반적인 성능을 개선 할 재현 방식으로이 장치의 정확한 제조 및 운영 가이드 라인에서 발생합니다.
DNA 혼성화 검출 유전 질환과 24,25 canc 다양한 형태를 진단하기 위해 광범위하게 사용된다어 26. 매년 독감의 여러 균주 DNA 하이브리드 기술 (27)의 결과를 사용하는 환자에서 식별됩니다. 인플루엔자 바이러스는 미국에서만 28에서 36,000 사망자 매년를 차지한다. 이러한 예는 민감도 나 특이도를 희생하지 않고 낮은 샘플 볼륨 플레이트 리더 또는 젤 시프트 분석으로하고 적은 비용으로 동일한 분석 기법을 수행 할 수있는 벤치 탑 미세 유체 장치에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 인해 라벨없는 전기 화학 센싱 많은 장점으로이를 DNA 혼성화 29,30 이벤트의 검출을 위해 광범위하게 사용되고있다. (mm 범위에서) 매크로 스케일 전극 관심 커 용액에 침지되어 설치 그들의 상보 서열과 일치하는 단일 가닥 DNA 서열의 결합 동력학에 대하여 매우 중요한 데이터를 제공하는데 사용될 수있다. 최근 MICR에서 전기 화학적 감지 기능을 통합의 몇 가지 발전이 있었다DNA 혼성화 용 ofluidics. 연구는 혼성화 반응 속도 (31)과 미세 유체 채널에서 검출 (15)에 대한 센서의 통합에 대해 수행되었다. 그러나, 여전히 복잡한 샘플 준비 단계없이 병렬 DNA 혼성화 이벤트를 분석 할 수있는 빠른 처리량 미세 유체 소자에 대한 요구가 존재한다.
본 연구에 제시된 장치는 다수의 상호 작용이 평행 복잡한 샘플 준비 단계없이 상영 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 우리 프로토콜은 전기 화학적 바이오 칩은 미세 전자 기계 시스템 (MEMS) 기술 (32, 33)와 마이크로 제조되는 방법 마이크로 유체 기반 나타낸다. 우리는 전극 어레이로 구성 (PDMS), 폴리 디메틸 실록산으로 만들어진 마이크로 유체 칩, 및 전기 화학 칩 모두의 제조 공정을 설명한다. ssDNA의 프로브와 바이오 칩의 화학 작용도 해결됩니다. 마지막으로, ABIL구체적 ssDNA를 타겟을 검출하고 분석하는 바이오 센서의 성만이 설명된다. 전반적으로, 마이크로 유체 기반 전기 화학적 바이오 칩은 신속하고 높은 처리량 분석 기술이다. 이는 생물학적 분자와 전도성 센서 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용될 수 있고, 랩 온어 칩 다양한 애플리케이션에 이용 될 수있다.
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Protocol
미세 유체 칩의 1 미세
- 전기 칩을 준비
- 패턴 골드 전극
- 아세톤, 메탄올, 이소프로판올 ( "AMI"청소)와 빈 사 ''실리콘 웨이퍼 (프라임 등급의 품질을) 씻어. N이 총을 건조하여 탈 이온수 (DI)과 웨이퍼의 이소프로판올을 씻어.
- 플라즈마 강화 화학 기상 증착 (PECVD) 도구 1 μm의 두께의 SiO2 보호 층을 성장한다. DC 스퍼터링 도구로 금 2,000 두꺼운 층 다음에 크롬 200 두꺼운 층을 증착.
- 스핀 "PR1"긍정적 인 포토 레지스트 (회전 매개 변수 : 3,000 rpm으로, 1000 RPM / 초, 30 초) 1.6 μm의 두께 균일 한 막 ~을 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트에 100 ° C에서 1 분 동안 웨이퍼.
- 190 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. DEV (352)에서 30 초 동안 웨이퍼를 개발eloper는 N이 총 DI와 웨이퍼 건조를 씻어.
- 1.5 분 동안 골드 에칭액 금을 에칭. ~ 30 초 동안 크롬에 천트와 크롬 에칭. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
- "AMI"청소 절차에 포토 레지스트를 벗겨.
참고 : 강산 화제 및 폭발 위험. - 한 H 2 SO 4 : 4 : 4로 웨이퍼를 청소 H 2 O 2 혼합물 ( "피라"클린)을 1 분 동안. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
- 패턴 백금 전극
- 스핀 "PR2"긍정적 인 포토 레지스트 (회전 매개 변수 : 3,000 rpm으로, 1000 RPM / 초, 30 초) 1.4 μm의 두께 균일 한 막 ~을 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트에 100 ° C에서 1 분 동안 웨이퍼.
- 30 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. 핫 플레이트에서 125 ° C에서 45 초 동안 웨이퍼를 굽는다. 홍수에 노출1000 엠제이 / 포토 마스크없이 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼. 6에서 2 분 동안 웨이퍼를 개발 : 1 AZ400K 개발자 및 DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
- E-빔 증착 시스템을 이용하여 백금의 1600 두꺼운 층이어서 티탄의 (400)의 두꺼운 층을 증착.
- 아세톤 및 이소프로판올로 세척 한 다음 5 분간 초음파 아세톤 욕조에 포토 레지스트를 들어 올립니다. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
- 패턴 골드 전극
- 분석 채널을 준비
- 분석 채널에 대한 금형을 준비
- "AMI"청소 절차에 빈 사 ''실리콘 웨이퍼 (테스트 수준의 품질을) 씻어. DI와 웨이퍼의 이소프로판올을 씻어 것은 N이 총을 건조 하였다.
- 스핀 "PR3"네가티브 포토 레지스트 (2 단계 회전 매개 변수 :. 단계 일 - 600 회전, 120 회전 / 초, 10 초 두 단계 - 1,150 rpm으로, 383 회전 / 초,27 초) 균일 한 막 ~ 100 μm의 두께를 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트 (2 단계 베이킹 매개 변수에 대한 웨이퍼 :. 단계 일 - 300 ° C / 시간에서 65 ° C로 실온에서 진입로와 10 분 동안 온도를 유지 2 단계 - 95 ° C까지 상승 300 ° C에서 / 시간 30 분 동안 대기 온도).
- 2500 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. 포스트 - 빵을 300 ° C / 시간에서 95 ° C까지 올렸와에 의해 웨이퍼 핫 플레이트에서 10 분 동안 온도를 유지. 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA) 개발자에서 10 분 동안 웨이퍼를 개발한다. N이 총을 이소프로판올 건조와 웨이퍼를 씻어.
- 분석 채널을 제작합니다
- 20 분 동안 진공 챔버에서 1 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 혼합물 (엘라스토머 20g, 경화제 2g)과 완전히 탈기 : 10을 준비한다.
- 알루미늄 호일로 몰드 웨이퍼 주위 인클로저를 정의하고 천천히 부어 PDMS 비경금형 이상.
- 상자로에서 PDMS 몰드와 구우 (2 단계 베이킹 매개 변수 :. 한 단계 - 5 분 80 °로 실온에서 진입로 C 2 단계 - 17 분 동안 80 ° C에서 개최).
- 알루미늄 호일에 금형과 장소에서 껍질 멀리 PDMS. 생검 펀치 도구로 구멍을 정의하고, 외과 의사의 칼을 분석 칩을 잘라.
- 분석 채널에 대한 금형을 준비
2 장치를 조립
- 수동으로 전기 칩에 작업 전극 PDMS 분석 채널을 맞 춥니 다. PDMS는 채널을 밀봉하고 누설을 방지, 전기 화학적 칩에 잘 스틱.
- 플라스틱 또는 직쇄 엘보 커넥터 어댑터 (0.1875 OD '및 ID 0.0625')로 짧은가요 성 관을 사용하여가요 성 호스 (0.087 OD '및 ID 0.015')에 연결. 장치의 구멍을 천공 입구 각 커넥터를 연결합니다.
- 의 타단에 주사기를 연결튜브 및 주사기 펌프에 주사기를 배치합니다. 교대 부 (3)에서 요구되는 절차 단계 및 해당 용액에 의한 주사기의 세트, 튜브와 커넥터를 변경.
3 DNA 하이브리드 분석
NOTE : 전체 채널이 채워질 때까지 200 μL / hr의 유속으로 각 채널에 천천히 용액을 소개.
- 다른 ssDNA를 프로브 서열과 각각 수직 마이크로 채널을 기능화 (3 별도 수직 마이크로 평행 수행)
- 각각 다른 ssDNA를 프로브 배양 용액 마이크로 채우기 (10 mM의 인산 완충액을 100 mM의 염화나트륨, 10 μM 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP), 및 1 μM 프로브 ssDNA를), 및 마이크로 세정 뒤에 1 시간 동안 배양 PBS와 함께.
- 10 mM의 PBS, 100 mM의 염화나트륨 및 1.395 mM의 TCEP의 버퍼에 6 - 머 캅토 -1 - 헥산 올 (MCH)의 1 ㎜를 포함하는 용액과 함께 인큐 마이크로 채우기1 시간 동안 BATE는 PBS와 마이크로 채널을 세정 하였다.
- , PDMS를 들어 올려 수평 방향으로 90 ° 회전하고, 고유의 카운터 및 기준 전극 (그림 S1)를 포함하는 각 행과 반응 챔버의 별도의 행을 노출 아래로 배치합니다.
- 4 배의 제어 계측 솔루션 마이크로는 생리 식염수 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼를 집중 입력하고 20 분 동안 배양한다.
- 배경 측정 : (작업, 카운터에 접속 텐쇼을 사용하여, 참조 전극 5 밀리미터가 PBS 용액 / 5 mM의 페로을 시안화하여 마이크로 채우고 (EIS 전기 화학 임피던스 분광법) 다른 주파수에 대한 전기 시스템의 임피던스 값을 기록 EIS 파라미터 : 1 MHz의 0.1 Hz에서, 10 년대 당 주파수 데이터 포인트 25 MV 진폭, 기준 전극에 비해 5 MV 편광) 주파수 범위. 마이크로 채널의 각 작동 전극이 측정을 반복합니다. (각 비 보완 및 보완 ssDNA의 목표를 위해 수행) DNA 혼성화를 측정한다.
- 4X의 대상 ssDNA를 측정 용액 마이크로 채우기 대상 ssDNA를 1 μM을 포함하는 SSC 완충액을 농축시키고, 20 분 동안 배양한다. 단계 3.4에 기재된 DNA를 측정한다.
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Representative Results
실험 장치의 제어 및 정확한 제조 공정이 연구에서 중요하다. 이 연구원은 재현성 및 높은 처리량 실험을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 마이크로 유체 기반의 전기 화학적 바이오 칩 (그림 1)의 높은 수율, 높은 재현성의 미세 공정을 증명하고있다. 낮은 실패율로, 몇몇 디바이스는 액 유출로 이어질 접합 문제를 보였다. 바이오칩의 전기 화학적 활성을 검증하기 위해, 순환 전압 전류 법 측정은 전기 활성 산화 환원 커플 페리 시안화 / 페로로 채워진 마이크로 채널에서 수행된다. 2 칩상의 구 다른 작용 극의 재생 가능한 전기 화학 반응을 보여준다. 이러한 결과는 전기 화학적 활성이 높은 처리량 측정을 허용하는 바이오칩의 모든 구 챔버에서 동일한 것을 나타낸다.
대부분의 DNA 혼성화 센서 ssDNA를 고정화센서 표면에 프로브. 금 패턴에 마이크로 유체 장치를위한 감지 전극을 사용함에 따라, 티올은 센서 (34) 표면과의 강력한 공유 결합을 형성하는 좋은 후보들이다. 한 가지 일반적인 접합 기술의 ssDNA를 일단 기능적 티올 (-SH) 그룹을 추가 참여. 이 사용될 준비가 될 때까지 SS 이황화 결합은 산화로부터 자유 티올기를 보호한다. 디설파이드는 트리스 감소되면 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)는 또한, 자유 티올 (-SH)를 금 표면에 DNA를 접합 가능해진다. TCEP 않고, ssDNA를의 이황화 결합은 또한 전극에 조립되지만, 결합은 티올 - 금 결합보다 약한 상기 실험에 걸쳐 안정적으로 유지하지 않을 것이다. 본 연구에서는 하이브리드 검출을위한 안정적인 ssDNA를 단일 층은 한 두 시간 정도 배양 시간을 달성하고있다. 프로브 ssDNA를 전극 상에 조립 된 후에, 6 - 머 캅토 -1 - 헥산 올 (MCH)의 패시베이션을 위해 사용된다표면에 노출되는 영역 Y는 비특이적 결합 효과 (35)을 감소시킨다. MCH의 티올 그룹은 금에 자기 조립이 가능하며 수산기는 ssDNA를 용액의 비특이적 흡착을 감소시킨다. TCEP 높은 농도는 이황화 결합을 형성하기 위해 산화 수도 티올 그룹을 줄이기 위해 사용된다. 버퍼 TCEP 높은 함량없이 MCH 불안정한 단층을 형성하는 것 및 임피던스 데이터 인해 표면 전하와 변형에 따라 달라질 것이다. ssDNA를 분자와 패시베이션로 사용시 MCH는 또 다른 중요한 기능을 갖는다. MCH의 산화 흡착 방법은 전극에 전자를 주입 및 표면 전위를 감소시킨다. 이 음이온 프로브 ssDNA를 가진 정전기 효과는 이미 고정 된 원인과 ssDNA를 똑바로 멀리 전극 (36)에서 의미합니다. 업라이트 프로브 ssDNA를 크게 가닥 전자에 더 쉽게 액세스 할 타겟 이후 혼성화 효율을 증대프로브 서열의 길이 ntire. 이 패시베이션 공정은, 센서의 안정한 임피던스의 측정 기준을 설정하는 거짓 양성 신호를 감소시키고 표면으로부터 임의의 약하게 바인딩 분자를 제거하는데 중요하다.
DNA 혼성화 사건 바이오 센싱기구는 음으로 하전 된 DNA 및 다른 전기 활성 분자 사이의 반발력에 기초한다. 혼성화 이벤트가 발생하면, DNA 혼성화 및 전기 활성 분자 사이의 강한 반발력은 더 힘들어 전기 활성 종은 전극 (37)으로 확산 할 수 있도록. 여기에서 우리는 전기 화학적 임피던스 분광법 (EIS)를 사용하여 측정이 반발력에 대한 산화 환원 종 지표로 페리 시안화 / 페로 커플을 사용합니다. 우리는 마이크로 유체 기반 전기 바이오칩이 바이오 센싱기구를 이용하고, DNA 혼성화 이벤트 (33)를 검출하는 능력을 증명한다. 3을 보여준다세 프로브 ssDNA를 그들의 상보 ssDNA를 대상 간의 혼성화 사건의 결과로서 임피던스 변화를 도시함으로써 바이오 센서의 선택성. 인큐베이션 20 분 다음 다른 비 상보 ssDNA를 가진 13 % 교차 - 반응성이 증명되었다. 이러한 결과는 재현성 및 높은 처리량 방법으로 DNA 혼성화 이벤트를 측정하는 미세 가공 된 디바이스의 타당성을 나타낸다. 우리는 또한 검출 프로브에 상보 ssDNA를 타겟의 상이한 농도를 도입하여, 바이오 센서의 감도를 입증했다. 4 높은 ssDNA를 목표 농도에 대한 임피던스 값의 증가 경향과 함께 바이오 센서의 기능을 보여준다. 상보 ssDNA를 타겟의 상이한 농도에 대한 제한 diffusional 저항 (33)의 계산에 따라, 선형 회귀 분석은 대응 ssDNA를 계산하여 3.8 nM의 검출의 이론적 한계 귀착 배경 신호에 대한 목표 농도. 전반적으로, 바이오칩 급속 DNA 혼성화 이벤트의 존재를 감지 할 수있는 능력을 나타낸다.
시험 포장 장치의 그림 1과 사진 (칩 크기 : 3.5 cm X 3.5 cm, 마이크로 높이가 100 μm의 폭이 500 μm의)입니다.
그림 2 전기 검증. 9 (3 × 3 격자)의 순환 전압 전류 페리 시안화 / 페로 산화 환원 쌍의 존재 작업 전극. 패턴 전극 사이의 재현성은 모든 전극 유사한 모양, 피크 높이 및 피크 분리에 의해 표시됩니다."https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3의 바이오 센서 특이성. 다른 ssDNA를 타겟과 전하 전송에 3 개의 다른 저항 ssDNA를 프로브 간의 혼성화 사건의 영향. DNA 혼성화 이벤트시에, 음으로 하전 된 이중 가닥 DNA와 높은 전하 이동 저항 음전하 페로 / 페리 시안화 분자 결과 사이의 강한 반발력.
바이오 센서의 그림 4 기능. Nyquist 선도0.01, 0.1, 1, 1 μM 표적 ssDNA를 도입 다음의 전기 화학 임피던스 분광법 측정 (화살표는 ssDNA를 목표 농도를 증가 나타냄). 표적 ssDNA를 높은 농도 대 저주파 (~ 15 Hz에서)에서의 증가 된 임피던스 값은 dsDNA 및 페로 시안 / 페리 시안화 분자 간의 강한 반발력에 기인한다.
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Discussion
우리의 절차는 마이크로 유체 기반의 전기 화학적 바이오 칩의 제조 및 DNA 혼성화 이벤트 분석에 대한 활용도를 보여줍니다. 고 수율 제어 미세 공정을 통해 우리는 전기 화학 센서의 배열과 통합 마이크로 채널로 구성된 장치를 개발한다. 우리는 반복적 인 접근을 통해 전기 화학 칩 및 마이크로 유체 몰드의 포토 리소그래피 절차를위한 제어 처리 파라미터를 고안 하였다. 이 단계는 다른 소형화 분석 장치의 미래 창조에 대한 지침을 제공합니다. 중요한 것은 이러한 신호 대 잡음비, 안정성 및 감도 바이오 센서 등의 각종 파라미터를 최적화하는 방법을 제공한다. 장치의 제조에 이어, 우리 고유 분석 목적을 제공 bioreceptor로 프로브 ssDNA를 가진 전기 화학 센서를 기능화. 이 절차는 낮은 장치 실패율을 입증하지만, 액 누설 majo 것으로 도시장치 및 DNA 혼성화 분석의 성능 동안 조립 다음과 같은 연구에 문제가있을 수 있습니다. 이러한 장치의 결합 실패의 추가 조사는 공정의 수율을 개선하고 마이크로 바이오 시스템 연구에 이상적 것이다.
우리의 연구에서, 우리는 정확하고 상세하게 DNA 혼성화 이벤트를 감지하는 바이오칩의 능력을 나타낸다. 새로운 분석 마이크로 디바이스의 설계 파라미터의 일부로서, 하나의 고려 제조 매개 변수를 최적화하기 위해 반복적 인 접근을 요구하는 장치의 제조를 수행한다 (예를 들면, 포토 리소그래피 파라미터, 마이크로 크기, 증착 된 금속의 종류). 효율적으로 DNA 혼성화 이벤트를 검출하기 위해, ssDNA를 프로브 조립체 및 혼성화 조건도 최적화 될 필요 (예., 배양 시간, 완충액 농도 프로브 농도, 비특이적 흡착의 방지).
빨리 fo를 선별 할 수있는 능력R 특정 DNA 서열은 암 연구, 인플루엔자 검출 및 유전 공학 분야에서 매우 유익하다. 대부분 배열 검출 방법은 신호를 생성 복수 세척 및 배양 단계를 사용하는 라벨을 이용한다. 제안 된 마이크로 유체 장치 살린, DNA 혼성화는 어떤 종류의 라벨 없이도 동일한 장치에서 DNA 서열의 높은 번호로 수행 될 것이다. 우리는 성능과 모듈을 개선하기 위해 바이오 칩에보다 정교한 기능을 통합 단기적 응용 프로그램을 구상. 예를 들어, 밸브 기반 마이크로 유체 자동 제어 및 분석 능력을 가진 바이오 칩을 제공하는 잠재력을 가지고있다. 또 다른 예는, 다른 리셉터와 장치 기능화 응용의 넓은 범위에서 사용할 수있는 유일한 감지 특성을 제공한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 금융 지원을위한 로버트 W. 독일어 재단, 국방 위협 감소 기관 (DTRA), 연구의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 신흥 프론티어와 혁신 (EFRI)을 인정합니다. 저자는 또한 클린 룸 시설 지원을 위해 메릴랜드 Nanocenter과 Fablab 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | 0.0625" |
| 1 ml syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 | |
References
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