Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En microfluidic basert Elektrokjemisk biochip for Label-free DNA Hybridisering Analyse

Published: September 10, 2014 doi: 10.3791/51797
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

Vi presenterer en mikrofluidbasert elektro biochip for DNA hybridisering deteksjon. Etter ssDNA probe funksjon, er spesifisiteten, følsomhet, og deteksjonsgrense studert med komplementære og ikke-komplementære ssDNA mål. Resultatene illustrerer påvirkning av DNA-hybridise-hendelsene på elektrokjemisk system, med en deteksjonsgrense på 3,8 nM.

Abstract

Miniatyrisering av analytiske prosedyrer stasjonære inn i mikro-skala gir betydelige fordeler med hensyn til reaksjonstid, kostnad, og integrering av pre-behandlingstrinn. Utnytte disse enhetene mot analyse av DNA-hybridisering hendelser er viktig fordi det gir en teknologi for sanntids vurdering av biomarkører ved point-of-care for ulike sykdommer. Men når enheten fotavtrykk reduseres dominans av ulike fysiske fenomener øker. Disse fenomener påvirker fabrikasjon presisjon og pålitelighet drift av anordningen. Derfor, er det et stort behov for å fremstille nøyaktig og drive disse enhetene i en reproduserbar måte for å forbedre den samlede ytelsen. Her beskriver vi protokoller og de metoder som brukes for fabrikasjon og drift av et mikrofluidbasert elektrokjemisk biochip for nøyaktig analyse av DNA-hybridise-arrangementer. Den biochip er sammensatt av to deler: en microfluidic chip medtre parallelle mikrokanaler laget av polydimetylsiloksan (PDMS), og en 3 x 3 Arrayed elektrokjemisk mikro-brikken. De DNA hybridisering hendelser oppdages ved hjelp av elektro impedansspektroskopi (EIS) analyse. EIS analysen muliggjør overvåking av variasjoner av egenskapene til det elektrokjemisk system som er dominerende på disse lengdeskala. Med muligheten for å overvåke endringer i både kostnad overføring og diffusjon motstand med biosensor demonstrerer vi selektiviteten til komplementære ssDNA mål, en beregnet deteksjonsgrense på 3,8 nM, og en 13% kryssreaktivitet med andre ikke-komplementære ssDNA etter 20 min inkubasjon. Denne metodikken kan forbedre ytelsen av miniatyriserte enheter ved å belyse på oppførselen til diffusjon på mikro-skala regimet og ved å muliggjøre studier av DNA hybridisering hendelser.

Introduction

Microfluidic lab-on-a-chip (LOC) enheter gir mange fordeler i klinisk diagnostikk, miljøovervåking og biomedisinsk forskning. Disse anordninger anvender microfluidic kanaler for å kontrollere fluidstrøm til regioner av brikken, hvor en rekke forskjellige fremgangsmåter kan skje blant annet reagens blanding, basert bindende affinitet, signaltransduksjon, og celledyrkning 1-4. Microfluidics gir mange fordeler fremfor konvensjonelle kliniske diagnostiske verktøy som mikroplate lesere eller elektro gel shift-analyser. Microfluidic enheter krever 2 til 3 størrelsesordener (nanoliter i motsetning til mikroliter) færre reagenser for å utføre lignende analyser. Dessuten kan disse enhetene øke hastigheten ved hvilken noen biologiske hendelser oppstå på grunn av den mindre innesperring av artene innenfor kanalene 5,6. For det tredje kan sensorene bli integrert i microfluidic enheter ved hjelp av litografi og etsning teknikker, som kan gi label-free deteksjon. Til slutt, disse enhetene er billig å produsere og krever lite arbeide på en del av teknikeren for å operere 7-10.

Etikett-fri deteksjon vanligvis utføres ved hjelp av en optisk eller elektrisk transducer. Optiske enheter kan presentere bedre sensorytelse på grunn av lavere interferens med analytter i prøven. Likevel er resultatene deres kompromittert i tilfeller der prøven bakgrunn gjør det samme resonerende bølgelengde som sensor 11. Det er mange fordeler med å bruke elektriske signaler til å utføre biologiske og kjemiske gjenkjenning i microfluidic systemer. Fabrikasjonen er iboende mindre komplisert, siden disse sensorene vanligvis bare kreve mønstrede elektroder til å operere. I tillegg, kan elektriske signaler være direkte integrert med de fleste måleapparat, mens andre signalformer kan kreve en transduser for å konvertere signalet 12-15. Elektriske sensorer ofte måle endringer i impedance 16,17, kapasitans 18, eller redoks aktivitet 19. Men nye utfordringer presentert som disse systemene er miniatyrisert. De viktigste utfordringene for å overvinne inkluderer: sample (kjemiske interaksjoner mellom byggevarer og analytter inkludert kapillære krefter, overflateruhet,) lav signal-forberedelse og blanding av væsker (på grunn av lavt prøvevolum og Reynolds tall), fysiske og kjemiske påvirkninger, til-støy-forholdet (som produseres av det reduserte overflateareal og volum) 20 til 23, og potensiell forstyrrelse fra elektro-aktive analytter i komplekse biologiske prøver (f.eks, blod og spytt). Videre undersøkelser av disse effektene vil resultere i retningslinjer for en nøyaktig fabrikasjon og drift av disse enhetene i en reproduserbar måte som ville forbedre deres generelle ytelsen.

DNA hybridisering deteksjon brukes mye til å diagnostisere genetiske lidelser 24,25 og ulike former for CANCER 26. Hvert år blir flere stammer av influensa identifisert hos pasienter som bruker resultatene fra DNA diseringsteknikker 27. Influensavirus alene står for 36.000 dødsfall hvert år i USA 28.. Slike eksempler kan ha nytte av en benk-top microfluidic enhet som kan utføre de samme analyseteknikker som en plateleser eller gel shift analysen med lavt prøvevolum og til en brøkdel av kostnadene uten å ofre følsomhet eller spesifisitet. På grunn av de mange fordelene med etiketten-free elektro sensing, har det vært brukt mye for påvisning av DNA hybridisering hendelser 29,30. Et oppsett der makro-skala elektroder (i millimeterområdet) blir dyppet i begerglass med en oppløsning av interesse kan bli brukt til å gi svært sensitive data vedrørende bindingskinetikken av enkelt-trådede DNA-sekvensene til de samsvarende komplementære sekvenser. Nylig har det vært noen fremskritt i å innlemme elektro sensing i microfluidics for DNA-hybridisering. Utført studier om hybridisering kinetikk 31 og integrasjon av sensorer for deteksjon 15 i microfluidic kanaler. Imidlertid er det fortsatt eksisterer et behov for en hurtig høy gjennomstrømning mikrofluidenhet som kan analysere DNA-hybridi-hendelser i parallell uten kompliserte prøveprepareringstrinn.

Anordningen presenteres i dette arbeidet gir en plattform som gjør det mulig for flere interaksjoner som skal skjermes parallelt og uten kompliserte prøveprepareringstrinn. Vår protokoll presenterer hvordan microfluidic basert elektro biochips er microfabricated med mikroelektromekaniske systemer (MEMS) teknologi 32,33. Vi beskriver fremstillingsprosessen av både mikrofluid brikken, som består av polydimetylsiloksan (PDMS), og den elektrokjemiske brikken, som består av en oppstilling av elektroder. Den kjemiske funksjonalisering av den biochip med ssDNA sonder er også adressert. Endelig ABILligheten av biosensor for spesifikt å påvise og analysere ssDNA mål er demonstrert. Totalt sett er microfluidic basert elektro biochip en rask og høy gjennomstrømming analyseteknikken. Den kan brukes for å undersøke interaksjonen mellom biologiske molekyler, og som driver transdusere, og kan utnyttes i en rekke lab-på-en-chip-applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. microfabrication av mikrofluid Chip

  1. Forbered Elektrokjemisk Chip
    1. Mønster Gold Elektroder
      1. Skyll en blank 4 '' silisiumskive (prime grade kvalitet) med aceton, metanol og isopropanol ("AMI" ren). Skyll isopropanolen fra wafer med deionisert vann (DI), etterfulgt av tørking med N 2 pistol.
      2. Dyrk en 1 mikrometer tykt SiO 2 passivisering lag med plasma-forbedret kjemisk damp nedfall (PECVD) verktøyet. Gjør et innskudd på 200 et tykt lag med krom etterfulgt av en 2000 et tykt lag av gull med en DC sputtering verktøy.
      3. Spin "PR1" positiv fotoresistmaterialer (spinning parametere: 3000 rpm, 1000 rpm / sek, 30 sek) for å skape enhetlig film ~ 1,6 mikrometer tykt. Pre-bake skiven i 1 min ved 100 ° C på en varm plate.
      4. Eksponer wafer med 190 mJ / cm 2 ved 405 nm bølgelengde gjennom en fotomaske. Utvikle wafer 30 sek i 352 developer og skyll wafer med DI og tørr med N 2 pistol.
      5. Etse gull med gull etsemiddel for 1,5 min. Etse krom med krom etsemiddel for ~ 30 sek. Skyll wafer med DI og tørr med N 2 pistol.
      6. Stripe fotoresist med "AMI" ren prosedyre.
        MERK: STERK oksidering og potensielt eksplosive.
      7. Rengjør wafer med 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 blanding ("Piranha" rent) i 1 min. Skyll wafer med DI og tørr med N 2 pistol.
    2. Mønster platina elektroder
      1. Spin "PR2" positiv fotoresistmaterialer (spinning parametere: 3000 rpm, 1000 rpm / sek, 30 sek) for å skape enhetlig film ~ 1,4 mikrometer tykt. Pre-bake skiven i 1 min ved 100 ° C på en varm plate.
      2. Eksponer wafer med 30 mJ / cm 2 ved 405 nm bølgelengde gjennom en fotomaske. Bake skiven for 45 s ved 125 ° C på en varm plate. Flood utsettskiven med 1000 mJ / cm 2 ved 405 nm bølgelengde uten fotomaske. Utvikle wafer i 2 min i 6: 1 AZ400K utvikler og skyll wafer med DI og tørr med N 2 pistol.
      3. Gjør et innskudd på 400 et tykt lag av titan etterfulgt av en 1600 et tykt lag av platina ved hjelp av en E-beam fordampning system.
      4. Løft av fotoresist i en ultrasonicated acetonbad i 5 min etterfulgt av skylling med aceton og isopropanol. Skyll wafer med DI og tørr med N 2 pistol.
  2. Forbered Analyse Kanaler
    1. Forbered Mold for analyse Kanaler
      1. Skyll en blank 4 '' silisiumskive (test klasse kvalitet) med "AMI" ren prosedyre. Skyll isopropanolen fra wafer med DI etterfulgt av tørking med N 2 pistol.
      2. Spin "PR3" negative fotoresistmaterialer (to-trinns spinne parametere:. Step One - 600 rpm, 120 rpm / sek, 10 sek Trinn to - 1150 rpm, 383 rpm / sek,27 sek) for å skape jevn film ~ 100 mikrometer tykk. Pre-bake skiven på en varm plate (2-step baker parametere:. Trinnet en - rampe opp fra romtemperatur til 65 ° C ved 300 ° C / time og hold temperaturen i 10 min Trinn 2 - rampe opp til 95 ° C ved 300 ° C / time og hold temperaturen i 30 min).
      3. Eksponer wafer med 2500 mJ / cm 2 ved 405 nm bølgelengde gjennom en fotomaske. Post-bake skiven ved gradvis opp til 95 ° C ved 300 ° C / time og hold temperaturen i 10 minutter på en varm plate. Utvikle wafer i 10 min i propylenglykol monometyleter Acetate (PGMEA) utvikler. Skyll wafer med isopropanol og tørr med N 2 pistol.
    2. Dikte Analyse Kanaler
      1. Forbered 10: 1 polydimetylsiloksan (PDMS)-blanding (20 g elastomer, 2 g av herdemiddel) og fullstendig avgasse i et vakuum-kammer i 20 min.
      2. Definer en innhegning rundt mold wafer med aluminiumsfolie og sakte hell uherdet PDMSover støpeformen.
      3. Bake formen med de PDMS i en boks ovn (2-trinns bake parametere:. Vise en - 5 min rampe opp fra romtemperatur til 80 ° C Trinn 2 - hold ved 80 ° C i 17 min).
      4. Skrelle bort PDMS fra formen og legg på aluminiumsfolie. Skjær analyse chips med en kirurg kniv, definere hull med en biopsi punching verktøy.

2. Fest Device

  1. Manuelt justere PDMS analyse kanaler med arbeids elektroder på elektro chip. PDMS stikker godt til den elektro chip, tetting kanalene og hindre lekkasje.
  2. Koble en fleksibel slange (OD 0,087 '' og ID 0.015 "') til en plast albue eller rett kobling ved hjelp av et kort fleksibelt rør som en adapter (OD 0,1875' 'og ID 0,0625' '). Fest kontaktene til hver av de Hullet viker i enheten.
  3. Koble en sprøyte på den andre enden avslangen og plassere sprøyten i en sprøytepumpe. Alternativt endre settet med en sprøyte, et rør, og en konnektor i henhold til den nødvendige prosedyren trinnet i seksjonen 3 og den tilsvarende løsning.

3. Analyser DNA Hybridisering

MERK: Introduser hver løsning langsomt inn i kanalen ved en strømningshastighet på 200 mL / time inntil hele kanalen blir fylt.

  1. Functionalize hver vertikale microchannel med en annen ssDNA-probe-sekvens (utføre i parallell med de tre separate vertikale mikro):
    1. Fyll hver microchannel med en annen ssDNA-probe inkubering løsning (10 mM fosfatbuffer, 100 mM NaCl, 10 mM tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP), og 1 mM probe ssDNA), og inkuberes i 1 time, etterfulgt av skylling microchannel med PBS.
    2. Fyll microchannel med en løsning inneholdende 1 mM 6-mercapto-1-heksanol (MCH) i en buffer av 10 mM PBS, 100 mM NaCl og 1,395 mM TCEP, og INCUbate i 1 time etterfulgt av rensing microchannel med PBS.
  2. Løft av PDMS, roterer 90 ° til en horisontal orientering, og plassere ned for å frilegge separate rader av reaksjonskammere med hver rad inneholdende en unik telleren og referanseelektrode (figur S1).
  3. Fyll mikrokanaler med kontrollmåling 4x konsentrert løsning av saltvann-natriumcitrat (SSC) buffer, og inkuberes i 20 min.
  4. Bakgrunn måling: Fyll mikrokanaler med 5 mM ferricyanide / 5 mM ferrocyanid i PBS-løsning og registrere de impedansverdier for den elektrokjemiske system for forskjellige frekvenser (elektrokjemiske impedans-spektroskopi; EIS) ved hjelp av en potensiostat som er koblet til arbeids, telleren og referanseelektroder ( EIS parametre: frekvensområdet fra 1 MHz til 0,1 Hz, 10 frekvens datapunkter per tiår, 25 mV amplitude, 5 mV polarisering versus referanseelektrode). Gjenta denne målingen for hver arbeidsdag elektrode i mikro. Mål-DNA-hybridisering (utføre for hver ikke-komplementære og komplementære target ssDNA).
    1. Fyll mikrokanaler med target ssDNA måling 4x konsentrert oppløsning av SSC-buffer inneholdende 1 pM av target-ssDNA, og inkuber i 20 min. Mål DNA som angitt i trinn 3.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En styrbar og nøyaktig produksjonsprosess for det eksperimentelle enheten er vesentlig forskning. Den tillater forskere å få reproduserbare og høy gjennomstrømning eksperimenter. Her har vi vist en høy avkastning, høy reproduserbarhet microfabrication prosessen med en microfluidic basert elektro biochip (figur 1). Med en lav strykprosent, er det få enheter vist bonding problemer som fører til løsning lekkasje. For å validere den elektrokjemiske aktivitet av biochip, er cykliske voltammetri målinger gjort i mikrokanalene er fylt med en elektro-aktivt redoks-par ferricyanide / ferrocyanid. Figur 2 viser det elektrokjemiske reproduserbar respons på ni forskjellige arbeidselektrode på brikken. Disse resultatene viser at den elektrokjemiske aktivitet er den samme i alle ni kamrene biochip slik high-throughput-målinger.

De fleste DNA hybridisering sensorer immobilisere ssDNAprober mot en sensor overflate. Som gull brukes til mønsteret sense elektroder for de microfluidic enheter, tioler er gode kandidater for å danne sterke bindinger med sensoren flater 34.. En vanlig teknikk for konjugering involvert tilsette en funksjonell tiol (-SH) gruppe ved den ene enden av ssDNA. SS disulfidbinding beskytter den frie tiolgruppe mot oksydasjon inntil den er klar til å bli brukt. Når disulfidet reduseres med tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) Dessuten blir den frie tiol (-SH) som er tilgjengelig for å binde DNA til en gulloverflate. Uten TCEP, vil de disulfidbindinger av ssDNA også montere på elektroden, men bindingen er mye svakere enn den tiol-gullbinding og vil ikke være stabil gjennom hele forsøket. I dette arbeidet har en stabil ssDNA monoskikt for hybridisering deteksjon er oppnådd med inkubasjonstid mellom én og to timer. Når ssDNA probene er montert på elektroden, er 6-merkapto-1-heksanol (MCH) som brukes til å passivere eny eksponerte områder på overflaten for å redusere ikke-spesifikke bindingseffekter 35. MCH sin tiolgruppe muliggjør selv-sammenstillingen mot gull og hydroksylgruppen reduserer ikke-spesifikk adsorpsjon av ssDNA i løsning. Den høye konsentrasjonen TCEP brukes for å redusere de tiol-grupper som kan være oksidert for å danne disulfidbindinger. Uten den høye TCEP innholdet i bufferen, vil den MCH danne ustabile monolagene og de impedans-data vil variere tilsvarende på grunn av variasjoner med overflateladning. MCH har en annen viktig funksjon når du bruker den som passivisering med ssDNA molekyler. Den oksidative adsorpsjonsprosess av MCH injiserer elektroner inn i elektroden og reduserer overflatepotensial. Dette forårsaker en elektrostatisk effekt med den anioniske probe ssDNA som allerede er immobilisert og ssDNA står loddrett bort fra elektroden 36. Stående prober i stor grad øke hybridiserings-effektiviteten siden målet ssDNA tråder har mye lettere tilgang til entire lengden av sondesekvens. Denne passivisering trinn er viktig for å etablere en stabil impedans referansemåling av sensoren, å redusere falske positive signaler, og å fjerne svakt bundne molekyler fra overflaten.

Den biosensing mekanisme for DNA-hybridise-arrangementer er basert på frastøting krefter mellom negativt ladet DNA og andre elektroaktive molekyler. Når en hendelse inntreffer hybridisering, sterkere frastøting krefter mellom den hybridiserte DNA og de ​​elektroaktive molekyler gjøre det vanskeligere for de elektroaktive arter å diffundere mot elektroden 37.. Her bruker vi en ferricyanide / ferro par som redoks arter indikator for disse frastøting krefter, som måles elektro impedansspektroskopi (EIS). Vi utnytte denne biosensing mekanisme i mikrofluidbasert elektrokjemisk biochip, og viser evne til å detektere DNA-hybridise-hendelser 33. Figur 3 viserselektiviteten av biosensor ved å illustrere impedans variasjoner som følge av hybridiserings-hendelser mellom tre ssDNA prober og deres komplementære target ssDNA. En 13% kryssreaktivitet med andre ikke-komplementære ssDNA følgende 20 min med inkubasjon har blitt demonstrert. Disse resultatene viser gjennomførbarheten av microfabricated enhet for å måle DNA-hybridise-hendelser i en reproduserbar og high-throughput måte. Vi har også vist at sensitiviteten til biosensor ved å innføre forskjellige konsentrasjoner av komplementære target ssDNA til sonde. Figur 4 viser funksjonaliteten til biosensor med en trend med økende impedansverdier for høyere ssDNA ønskede konsentrasjonen. Etter beregning av begrenset diffusjon motstand 33 for forskjellige konsentrasjoner av komplementære target ssDNA, resulterte en lineær regresjonsanalyse på en teoretisk deteksjonsgrense på 3,8 nM ved beregning av den tilsvarende ssDNA målkonsentrasjon for bakgrunnssignalet. Samlet viser biochip evnen til raskt å avføle tilstedeværelsen av DNA-hybridise-arrangementer.

Figur 1
Figur 1. Fotografi av pakket enhet under test (chip dimensjoner: 3,5 cm x 3,5 cm, microchannel høyden er 100 mikrometer og 500 mikrometer i bredde).

Figur 2
Figur 2. Elektrokjemisk validering. Cykliske voltammograms av 9 (3 x 3 grid) virke elektroder i nærvær av ferro / ferricyanide redoks-par. Reproduserbarheten av de mønstrede elektroder er vist ved den tilsvarende form, topphøyder, og maksimal separasjon for alle elektroder."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Spesifisitet av biosensor. Virkningen av hybridiserings-hendelser mellom forskjellige ssDNA mål og tre forskjellige ssDNA prober på overføring lademotstand. Ved DNA-hybridisering hendelsen, sterkere frastøting kraften mellom den negativt ladede dobbelt-trådet DNA og de negativt ladede ferrocyanid / ferricyanide molekyler resulterer i høyere omkostninger overgangsmotstanden.

Figur 4
Figur 4. Funksjonen til biosensor. Nyquist tomtenav elektrokjemiske impedans spektroskopi målinger som følge av innføring av 0,01, 0,1, 1 og 1 pM target ssDNA (pil indikerer økende ssDNA målkonsentrasjoner). De økte impedansverdier til lave frekvenser (~ 15 Hz) for høyere mål ssDNA konsentrasjonene er på grunn av sterkere frastøting krefter mellom dsDNA og ferrocyanid / ferricyanide molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Våre fremgangsmåte demonstrerer fremstilling av en mikrofluidbasert elektrokjemisk biochip og dens utnyttelse for DNA hybridi hendelser analyse. Gjennom en høy avkastning kontrollert microfabrication prosessen utvikler vi en enhet som består av mikrokanaler integrert med en rekke elektrokjemiske transdusere. Vi har utviklet kontrollerte prosessparametere for fotolitografisk fremgangsmåte for den elektrokjemiske chip og mikrofluidkanal formen gjennom en iterativ tilnærming. Disse trinnene gi retningslinjer for fremtidig etablering av andre miniatyriserte analytiske enheter. Viktigere, de gir en fremgangsmåte for å optimalisere ulike biosensing parametre som signal-til-støy-forhold, stabilitet og følsomhet. Etter enheten fabrikasjon, functionalize vi de elektrokjemiske transdusere med ssDNA sonde som bioreceptor, og gir en unik analytisk formål. Selv om disse prosedyrene demonstrere lav enhet strykprosent, viser løsning lekkasjer for å være en major problemet etter montering av anordningen, og i løpet av utførelsen av DNA-hybridiserings-assay. Videre undersøkelser av liming svikt i slike enheter ville forbedre utbyttet av prosessen og gjør det ideelt for mikro-bio-systemer studien.

I våre undersøkelser har vi vise muligheten av biochip å nøyaktig og spesifikt sense DNA hybridise-arrangementer. Som en del av konstruksjonsparametere for en ny analytisk mikro-enhet, bør man ta hensyn til produksjonen av anordningen, noe som krever en iterativ tilnærming for å optimalisere fremstillingsparametre (f.eks, fotolitografi parametere, microchannel dimensjoner, type av det avsatte metall). For effektivt å detektere DNA-hybridi-hendelser, ssDNA sondesammenstilling og hybridiseringsbetingelser måtte bli optimalisert i tillegg (f.eks., Inkubasjonstid, bufferkonsentrasjon, konsentrasjon probe, forhindring av ikke-spesifikk adsorpsjon).

Evnen til raskt skjermen for bestemte DNA-sekvenser er svært gunstig innen kreftforskning, influensa deteksjon og genteknologi. Mest kledd påvisningsmetoder utnytte en etikett for å produsere signalet og bruke flere vasking og ruge trinn. Ved hjelp av den foreslåtte microfluidic enheter, vil DNA-hybridisering utføres med høyt antall av DNA-sekvenser i den samme enhet, uten behov for etiketter av noe slag. Vi ser for oss på kort sikt applikasjoner som integrerer mer avanserte mulighetene til biochip for å forbedre ytelsen og modularitet. For eksempel har ventilbasert MicroFluidics potensial til å gi biochip med automatisk og kontrollert analyse egenskaper. Et annet eksempel er funksjon enheten med andre bioreceptors, gir unike sensor egenskaper som kan brukes i et bredere spekter av applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner Robert W. Deutsch Foundation, Defense Threat Reduction Agency (DTRA), og National Science Foundation Emerging Frontiers in Research and Innovation (Efri) for økonomisk støtte. Forfatterne også takke Maryland Nanocenter og dens Fablab for renrom anlegget støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'' Silicon wafer Ultrasil 4-5664 Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1") Microchem positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2") Hoechst Celanse positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3") Microchem negative photoresist
Gold etchant Transene TFA No dilution
Chromium etchant Transene 1020AC No dilution
PDMS elastomer Dow Corning 3097366 1004
PDMS curing agent Dow Corning 3097358 1004
Biopsy punching tool Healthlink BP20
Tygon flexible tubing Cole Parmer  R 3603 0.015"
Tygon flexible adapter Cole Parmer  06417-41 0.0625"
1 ml syringe Beckton-Dickenson 301025
Monobasic potassium phosphate Fluka 1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous Sigma RES20765-A7
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine Aldrich C4706
6-mercapto-1-hexanol Aldrich 451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer Sigma 93017
Potassium hexacyanoferrate(III) Aldrich 455946
Complementary ssDNA #1 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) Oxford Instruments PlasmaLab System 100 Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit AJA International ATC 1800-V For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system Denton Custom-built For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat CH Instruments 660D
Syringe pump KD Scientific KDS230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
  2. Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
  3. Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
  4. Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
  5. Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
  6. Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
  7. Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
  8. Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
  9. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
  10. Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
  11. Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
  12. Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
  13. Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
  14. Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
  15. Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
  16. Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
  17. Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
  18. Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
  19. Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
  20. Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
  21. Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
  22. Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
  23. Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
  24. Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
  25. Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
  26. Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
  27. Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
  28. Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
  29. Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
  30. Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
  31. Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
  32. Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
  33. Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
  34. Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
  35. McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
  36. Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
  37. Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).

Tags

Bioteknologi elektro impedansspektroskopi DNA hybridisering biosensor biochip MicroFluidics etikett-free deteksjon begrenset diffusjon microfabrication
En microfluidic basert Elektrokjemisk biochip for Label-free DNA Hybridisering Analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H.,… More

Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Gordonov, T., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51797, doi:10.3791/51797 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter