Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Микрожидкостных основе Электрохимический Биочип для этикеток без анализа ДНК-гибридизации

Published: September 10, 2014 doi: 10.3791/51797

Summary

Мы представляем микрофлюидных основе электрохимического биочип для выявления ДНК гибридизации. После оцДНК зонда функционализации, специфичность, чувствительность и предел обнаружения изучаются с дополнительными и некомплементарными целей оцДНК. Результаты иллюстрируют влияние гибридизации ДНК событий на электрохимической системы, с пределом обнаружения 3,8 нМ.

Abstract

Миниатюризация аналитических процедур настольных в микро-масштабе обеспечивает значительные преимущества в отношении времени реакции, стоимости и интеграции шагов предварительной обработки. Использование этих устройств к анализу гибридизации событий ДНК важна, поскольку она предлагает технологию для реальной оценки времени биомаркеров в точке оказания медицинской помощи для различных заболеваний. Однако, когда след устройство снижает доминирование различных физических увеличивается явлений. Эти явления влияют на точность изготовления и надежность работы устройства. Таким образом, существует большая потребность, чтобы точно изготовить и работать эти устройства в воспроизводимым образом, чтобы улучшить общую производительность. Здесь мы описываем протоколы и методы, используемые для изготовления и эксплуатации микрофлюидном основе электрохимического биочипа для точного анализа гибридизации ДНК событий. Биочип состоит из двух частей: Микрожидкостных чип стри параллельных микроканалы из полидиметилсилоксана (ПДМС), и 3 х 3 упорядоченной электрохимической микро-чип. Гибридизации ДНК события определяются с использованием электрохимического импеданса спектроскопия (EIS) анализ. Анализ EIS позволяет вариации мониторингу свойств электрохимической системы, преобладающих в этих масштабах длины. С возможностью отслеживать изменения как переноса заряда и диффузионного сопротивления с биосенсора, мы демонстрируем селективность к дополнительным целям оцДНК, вычисляемый предел обнаружения 3,8 нМ и 13% перекрестной реактивности с другими некомплементарной одноцепочечной ДНК следующий 20 мин инкубации. Эта методика может повысить производительность миниаппаратуры по выяснению от поведения диффузии в микро-масштабе режима и позволяя изучение гибридизации ДНК событий.

Introduction

Микрожидкостных лаборатория-на-чипе (LOC) устройства обеспечивают многочисленные преимущества в клинической диагностике, экологический мониторинг и медико-биологических исследований. Эти устройства используют микроканалов для управления потоком жидкости в регионах чипа, где целый ряд процедур может иметь место в том числе смешивания реагентов, близости, основанная связывания, передачи сигнала, и культивирования клеток 1-4. Microfluidics обеспечивает множество преимуществ по сравнению с обычными клинических диагностических инструментов, таких как планшете читателей или электрофоретических анализов гель сдвига. Микрожидкостных устройства требуют от 2 до 3 порядка (нанолитров в отличие от мкл) меньше реагентов для выполнения аналогичных анализов. Кроме того, эти устройства могут увеличить скорость, с которой некоторые биологические события происходят за счет меньшего удержания вида в каналах 5,6. В-третьих, датчики могут быть интегрированы в микрофлюидных устройств, использующих литографии и травления методы, которые могут обеспечить без наклеек detectioн. Наконец, эти устройства недороги в производстве и не требуют много работы по части техник для работы 7-10.

Этикетка без обнаружения обычно выполняется с помощью оптического или электрического преобразователя. Оптические приборы могут представить лучше зондирования производительность за счет снижения помех анализируемых веществ в образце. Тем не менее, их эффективность находится под угрозой в тех случаях, когда фон образца имеет ту же длину волны резонирующий в качестве датчика 11. Есть много преимуществ в использовании электрические сигналы для выполнения биологической и химической обнаружения в микрофлюидных систем. Изготовление изначально менее сложным, поскольку эти датчики обычно требуют только узорчатые электроды для работы. Кроме того, электрические сигналы могут быть непосредственно сопряжена с большей измерительного оборудования, тогда как другие формы сигналов может потребоваться преобразователь для преобразования сигнала 12-15. Электрические датчики обычно измерить изменения в impedancэ 16,17, емкость 18, или окислительно-восстановительный деятельность 19. Тем не менее, новые вызовы представлены как эти системы имеют очень маленькие размеры. Наиболее важные проблемы преодоления включают: подготовку образцов и смешивание жидкостей (за счет низкого объема выборки и числа Рейнольдса), физические и химические эффекты (включая капиллярных сил, шероховатость поверхности, химические взаимодействия между строительными материалами и анализируемых), низкий SIGNAL- к шуму (производства уменьшенной площади поверхности и объема) 20-23, и потенциальных помех от электро-активные аналитов в сложных биологических образцах (например, крови и слюне). Дальнейшие исследования этих эффектов приведет принципов для точного изготовления и эксплуатации этих устройств в воспроизводимым образом, что бы улучшить их общую производительность.

Обнаружение ДНК гибридизации широко используется для диагностики генетических заболеваний 24,25 и различные формы Канкунеэ 26. Каждый год, множество штаммов гриппа выявлены у пациентов, использующих результаты методами гибридизации ДНК 27. Вирус гриппа в одиночку приходится 36000 случаев смерти в год в Соединенных Штатах 28. Такие примеры могут извлечь выгоду из настольного микрожидкостных устройств, которые могут выполнять те же методы анализа, как планшет-ридера или гель сдвига анализа с низким объемом образца и на долю от стоимости без ущерба чувствительности или специфичности. В связи с многих преимуществ этикетки без электрохимической зондирования, это широко используется для обнаружения гибридизации ДНК событий 29,30. Установки, где макромасштабе электроды (в миллиметровом диапазоне) погружают в стаканы с раствором интерес, могут быть использованы для обеспечения очень чувствительные данные, касающиеся связывания кинетики одноцепочечных ДНК-последовательностей в их соответствующих комплементарных последовательностей. В последнее время было несколько достижений в включения электрохимического зондирования в MICRofluidics для гибридизации ДНК. Исследования проводились в отношении гибридизации кинетики 31 и интеграции датчиков для обнаружения 15 в микроканалов. Тем не менее, все еще существует потребность в быстром высокой пропускной микрофлюидного устройства, которое может анализировать ДНК-гибридизации события параллельно без необходимости выполнения сложных операций подготовки образца.

Устройство представлено в этой работе предоставляет платформу, которая позволяет несколько взаимодействия пройти обследование параллельно и без сложных процедуры подготовки пробы. Наш протокол представляет, как Микрожидкостных основе электрохимических биочипы микроизготовленном с микро-электромеханических систем (МЭМС) технологии 32,33. Опишем процесс изготовления как микрожидкостной чипа, изготовленного из полидиметилсилоксана (PDMS), и электрохимического чип, состоящий из массива электродов. Химический функционализацию биочипа с оцДНК зондов также рассматривается. И, наконец, Абилность биосенсора специально обнаружить и проанализировать оцДНК цели демонстрируется. В целом, Микрожидкостных на основе электрохимического биочип представляет собой быстрый и анализ высокой пропускной техники. Он может быть использован для исследования взаимодействия между биологическими молекулами и проводящих преобразователей, и может быть использовано в различных лаборатория-на-чипе приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 микротехнологий из Микрожидкостных Chip

  1. Подготовьте Электрохимический Chip
    1. Шаблон Золото Электроды
      1. Промыть пустой 4 '' кремниевой пластины (качество высшего сорта) с ацетоном, метанолом и изопропанола ("AMI" чистый). Промыть изопропанол от пластины с деионизированной водой (DI) с последующей сушкой с Н 2 пистолета.
      2. Вырастить толстый SiO 2 пассивирующий слой с плазменно-химического осаждения паров (PECVD) инструмента 1 мкм. Внесите 200 толстым слоем хрома с последующим 2000 толстым слоем золота с напылением инструмента постоянного тока.
      3. Спин "PR1" позитивного фоторезиста (параметры прядения: 3000 оборотов в минуту, 1000 об / сек, 30 сек), чтобы создать однородную пленку ~ 1,6 мкм. Предварительно испеките пластины в течение 1 мин при 100 ° С на горячей плите.
      4. Expose пластину с 190 мДж / см 2 при 405 нм длины волны через фотошаблон. Разработка пластину на 30 сек в 352 разработчикаeloper и промойте пластину с DI и сухой с N 2 пистолета.
      5. Etch золото с золотом травителя в течение 1,5 мин. Протравите хром с хрома травителя для ~ 30 сек. Промыть пластины с DI и насухо N 2 пистолета.
      6. Снимите фоторезиста с "AMI" чистой процедуры.
        ПРИМЕЧАНИЕ: сильный окислитель И взрывоопасных.
      7. Очистите пластины с 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 смеси ("Piranha" чистый) в течение 1 мин. Промыть пластины с DI и насухо N 2 пистолета.
    2. Pattern платиновые электроды
      1. Спин "PR2" позитивного фоторезиста (параметры прядения: 3000 оборотов в минуту, 1000 об / сек, 30 сек), чтобы создать однородную пленку ~ 1,4 мкм. Предварительно испеките пластины в течение 1 мин при 100 ° С на горячей плите.
      2. Expose пластину с 30 мДж / см 2 при 405 нм длины волны через фотошаблон. Выпекать пластины в течение 45 сек при 125 ° С на горячей плите. Наводнение подвергайтевафельные с 1000 мДж / см 2 при длине волны 405 нм без фотошаблон. Разработка пластину в течение 2 мин в 6: 1 AZ400K разработчика и промойте пластину с DI и насухо N 2 пистолета.
      3. Внесите 400 толстым слоем титана с последующим 1600 толстым слоем платины, используя систему испарения E-луча.
      4. Лифт с фоторезиста в ацетон ультразвуком в течение 5 мин с последующим промыванием ацетоном и изопропанол. Промыть пластины с DI и насухо N 2 пистолета.
  2. Подготовьте Assay Каналы
    1. Подготовьте Mold для анализа каналов
      1. Промыть пустой 4 '' кремниевой пластины (класс качества тест) с "AMI" чистой процедуры. Промыть изопропанол от пластины с ди последующей сушкой с Н 2 пистолета.
      2. Спин "PR3" негативного фоторезиста (2-ступенчатые параметры прядения:. Шаг один - 600 оборотов в минуту, 120 об / сек, 10 сек Шаг второй - 1150 оборотов в минуту, 383 оборотов в минуту / сек,27 секунд), чтобы создать равномерную пленку толщиной ~ 100 мкм. Предварительно испеките пластины на горячей плите (2-ступенчатых параметров выпечки:. Шаге - нарастить от комнатной температуры до 65 ° С при 300 ° С / ч и удерживайте температуру в течение 10 мин Шаг 2 - нарастить до 95 ° С при 300 ° С / ч и температура удержания в течение 30 мин).
      3. Expose пластину с 2500 мДж / см 2 при 405 нм длины волны через фотошаблон. Сообщение-печь пластины расти до 95 ° С при 300 ° С / ч и удерживайте температуру в течение 10 мин на горячей плите. Разработка пластину в течение 10 мин в пропиленгликольмонометиловый Эфир ацетат (PGMEA) разработчика. Промыть пластины с изопропанола и сухой с N 2 пистолета.
    2. Изготовление Assay Каналы
      1. Подготовка 10: 1 полидиметилсилоксан (PDMS) смесь (20 г эластомера, 2 г отвердителя) и полностью дегазировать в вакуумной камере в течение 20 мин.
      2. Определить корпуса вокруг пресс-формы пластины с алюминиевой фольгой и медленно залить неотвержденная PDMSна пресс-форме.
      3. Печь пресс-формы с PDMS в камерной печи (2-параметров стадии обжига:. Шаг первый - 5 мин Повышение от комнатной температуры до 80 ° С Шаг 2 - выдержка при 80 ° С в течение 17 мин).
      4. Удаляйте PDMS от формы и места на алюминиевую фольгу. Вырезать анализа чипы с хирурга ножом, определить отверстия инструмента биопсия штамповки.

2 Соберите устройство

  1. Вручную выровнять каналы PDMS Проба с рабочих электродов на электрохимической чипа. ПДМС прилипает и к электрохимическому чипа, герметизации каналов и предотвращении утечки.
  2. Подключите гибкий шланг (OD 0,087 '' и ID 0,015 '') для пластиковых локоть или прямой разъем, используя короткий гибкую трубку в качестве адаптера (OD 0,1875 '' и ID 0,0625 ''). Прикрепите разъемы для каждого из отверстий перфорированная вводов в устройстве.
  3. Подключите шприц на другом концетрубки и поместить шприц в шприцевой насос. Поочередно изменить набор шприц, тюбик, и разъем в соответствии с требуемой шаге процедуры в разделе 3, и ее соответствующего решения.

3 Анализ ДНК гибридизации

Примечание: Ввести каждый раствор медленно в канал со скоростью потока 200 мкл / ч до тех пор, пока весь канал заполнен.

  1. Функционализации каждый вертикальный микроканал с другой последовательности оцДНК зонда (выполнить параллельно с 3 отдельных вертикальных микроканалов):
    1. Заполните каждый микроканал с другом оцДНК-зонд инкубации раствора (10 мМ фосфатный буфер, 100 мМ NaCl, 10 мкМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР), и 1 мкМ зонда оцДНК), и инкубируют в течение 1 ч с последующей промывкой микроканала с PBS.
    2. Заполните микроканала с раствором, содержащим 1 мМ 6-меркапто-1-гексанола (MCH) в буфере 10 мМ PBS, 100 мМ NaCl и 1,395 мМ TCEP, и INCUБАТЭ в течение 1 ч с последующей промывкой микроканала с PBS.
  2. Снимите PDMS, поворачивается на 90 ° в горизонтальной ориентации, и поместите вниз, чтобы выставить отдельные ряды реакционных камер с каждой строкой, содержащей уникальный счетчик и электрод сравнения (Рисунок S1).
  3. Заполните микроканалы с измерительной контроль решения 4x сосредоточены цитрат солевой натрия (SSC) буфер, и выдержать в течение 20 мин.
  4. Измерение фона: Заполните микроканалов с 5 мМ феррицианид / 5 мМ ферроцианида в растворе PBS и запишите значения импеданса электрохимической системы для разных частот (электрохимический спектроскопии импеданса; EIS), используя потенциостате подключенный к рабочей, счетчик, и электроды ( EIS параметры: диапазон частот от 1 МГц до 0,1 Гц, 10 баллов частота данных на одно десятилетие, 25 мВ амплитуды, 5 мВ поляризационные сравнению с электродом сравнения). Повторите это измерение для каждого рабочего электрода в микроканалов. Измерьте гибридизации ДНК (выполнить для каждого некомплементарной и комплементарной мишени оцДНК).
    1. Заполните микроканалы с целевой измерения раствора оцДНК 4х концентрируют SSC буфера, содержащего 1 мкМ оцДНК-мишени, и инкубируют в течение 20 мин. Измерьте ДНК согласно шагу 3.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Управляемым и точный производственный процесс для экспериментального устройства имеет важное значение в исследовании. Это позволяет исследователям получить воспроизводимые и высокие эксперименты пропускной. Вот мы продемонстрировали высокую доходность, процесс микротехнологий высокая воспроизводимость микрофлюидном основе электрохимического биочипа (рис 1). С низким отказов, несколько устройств показали проблемы склеивания, которые приводят к утечке раствора. Чтобы подтвердить электрохимическую активность биочипа, измерения циклической вольтамперометрии сделаны в микроканалов, заполненных электро-активных окислительно-восстановительной пары феррицианид / ферроцианидом. Рисунок 2 показывает воспроизводимую электрохимическую реакцию девяти различных рабочего электрода на чипе. Эти результаты показывают, что электрохимическую активность одно и то же во всех девяти камер биочипа, позволяющего измерения с высокой пропускной способностью.

Большинство датчиков гибридизации ДНК иммобилизации одноцепочечной ДНКзонды на поверхность датчика. Как золото используется для рисунка электродов зондирования для микрофлюидных устройств, тиолов являются хорошими кандидатами для формирования сильных ковалентных связей с датчик поверхности 34. Один общий метод сопряжения включает добавление функционального тиол (-SH) группу на одном конце оцДНК. SS дисульфидных связей защищает свободную тиоловую группу от окисления, пока он не будет готов к использованию. После того, как дисульфид уменьшается трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР) Кроме того, свободный тиол (-SH) становится доступной для связывания ДНК с поверхностью золота. Без ТСЕР, дисульфидные облигации одноцепочечной ДНК также собрать на электроде, но связь гораздо слабее, чем в тиол-золотой облигации, а не будут оставаться стабильными в течение всего эксперимента. В этой работе, стабильный монослой оцДНК для обнаружения гибридизации была достигнута с инкубационного периода от одного до двух часов. После того, как оцДНК зонда были собраны на электрод, 6-меркапто-1-гексанол (MCH) используется для пассивацииу облученные области на поверхности, чтобы уменьшить неспецифическое связывание эффекты 35. Тиольная группа МЧ позволяет для самостоятельной сборки на золото и гидроксил уменьшает неспецифическую адсорбцию одноцепочечной ДНК в растворе. Высокая концентрация ТСЕР используется для уменьшения тиольные группы, которые могут быть окислены с образованием дисульфидных связей. Без высоким содержанием TCEP в буфере, МЧ будет формировать монослои и нестабильные данные импеданса будет меняться, соответственно, за счет вариаций с поверхностным зарядом. МЧ имеет еще одну важную функцию при использовании его в качестве пассивации с молекулами оцДНК. Окислительный процесс адсорбции МЧ вводит электронов в электрод и уменьшает поверхностный потенциал. Это вызывает электростатический эффект с анионным оцДНК зонда уже иммобилизованного и оцДНК стоит вертикально от электрода 36. Вертикальные зонды значительно повысить эффективность гибридизации с целью оцДНК пряди имеют гораздо более легкий доступ к электроннойntire длина последовательности зонда. Этот шаг пассивации имеет решающее значение для установления стабильного сопротивление базового измерения датчика, уменьшая ложные положительные сигналы и удаление любых слабо связанные молекулы с поверхности.

Биодатчиков механизм гибридизации ДНК событий на основе сил отталкивания между отрицательно заряженной ДНК и других электро-активных молекул. Когда происходит событие гибридизации, сильные силы отталкивания между гибридизированной ДНК и электро-активных молекул сделать его более трудным для электро-активных видов диффундировать к электроду 37. Здесь мы используем феррицианида / ферроцианид пару в качестве индикатора окислительно-восстановительный видов для этих сил отталкивания, которые были проведены с помощью электрохимической импедансной спектроскопии (EIS). Мы используем эту биодат- механизм в микрофлюидного основе электрохимического биочипа, и продемонстрировать свою способность обнаруживать гибридизации ДНК события 33. Рисунок 3 показываетСелективность биосенсора с иллюстрирующая изменения импеданса в результате гибридизации событий между тремя зондами оцДНК и их комплементарной оцДНК цели. 13% перекрестной реактивности с другими некомплементарными одноцепочечной ДНК следующих 20 мин инкубации была продемонстрирована. Эти результаты показывают осуществимость микроизготовленном устройства для измерения гибридизации ДНК события воспроизводимым и высокой пропускной образом. Мы также показали, чувствительность биосенсора путем введения различных концентраций комплементарной оцДНК цели до чувствительного датчика. На рисунке 4 показаны функциональные биосенсора с тенденцией увеличения значения импеданса для более высоких концентраций целевых оцДНК. После вычисления ограниченного диффузионного сопротивления 33 для различных концентраций комплементарной оцДНК цели, линейный регрессионный анализ привело к теоретическому пределу обнаружения 3,8 нМ в расчете соответствующего оцДНК Концентрация мишенью для фонового сигнала. В целом, биочип показывает способность быстро обнаруживать присутствие гибридизации ДНК событий.

Рисунок 1
Рис.1 Фотография упакованного тестируемого устройства (размеры чипа: 3,5 см х 3,5 см; высота микроканале 100 мкм и 500 мкм в ширину).

Рисунок 2
Рисунок 2 Электрохимический проверки. Циклические вольтамперограммы из 9 (3 х 3 сетки) рабочих электродов в присутствии ферроцианида / феррицианида окислительно-восстановительной пары. Воспроизводимость среди узорчатых электродов показана на подобной формы, высот пиков, и пик разделения для всех электродов."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 Специфика биосенсора. Влияние гибридизации событий между различными целями оцДНК и трех различных оцДНК зондов на сопротивление переноса заряда. По ДНК гибридизации события, тем сильнее сила отталкивания между отрицательно заряженной двухцепочечной ДНК и отрицательно заряженных молекул ферроцианид / феррицианида приводит к увеличению сопротивления переноса заряда.

Рисунок 4
Рисунок 4 Функциональность биосенсора. Найквиста участокэлектрохимических измерений импеданс-спектроскопии после введения 0,01, 0,1, 1, и 1 цели мкМ оцДНК (стрелка указывает увеличение целевых концентраций оцДНК). Возросшие значения полного сопротивления на низких частотах (~ 15 Гц) в течение концентрациях выше целевых оцДНК обусловлены сильными сил отталкивания между двухцепочечной ДНК и молекул ферроцианид / феррицианида.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наши процедуры демонстрируют изготовление микрофлюидном основе электрохимического биочипа и его использование для анализа гибридизации ДНК событий. Через высоким выходом контролируется процесс микроструктур мы разработать устройство, состоящий из микромасштабных каналов интегрированных с массивом электрохимических преобразователей. Мы разработали контролируемых параметров обработки для процедуры фотолитографии электрохимического чипа и микрожидкостной форму канала с помощью интерактивного подхода. Эти шаги обеспечивают руководящие принципы для будущего создания других миниатюрных аналитических приборов. Важно отметить, что они обеспечивают метод для оптимизации различных параметров биодат- такие как сигнал к шуму, стабильности и чувствительности. После изготовления приборов, мы функционализировать электрохимические датчики с оцДНК зонда как bioreceptor, предоставляя уникальную аналитическую цель. Хотя эти процедуры демонстрируют низкий процент отказов устройств, утечки решение показывает, что Majoг вопрос следующий сборки устройства и во время исполнения гибридизации ДНК анализа. Дальнейшие исследования отказа сцепления в таких устройствах бы улучшить выход процесса и делают его идеальным для исследования микро-био-систем.

В наших исследованиях, мы показываем способность биочипа точно и конкретно ощутить гибридизации ДНК события. В рамках проектных параметров для нового аналитического микро-устройства, следует принять во внимание производство устройства, которое требует итеративного подхода для оптимизации параметров изготовления (например, параметры фотолитографии, размеры микроканальные, тип наплавленного металла). Для того чтобы эффективно обнаруживать ДНК-гибридизации событий, монтаж зонда оцДНК и условия гибридизации должны быть оптимизированы, а также (например., Время инкубации, концентрация буфера, концентрации зонда, профилактика неспецифической адсорбции).

Возможность быстрого обнаружения FOг конкретные последовательности ДНК очень полезно в области исследования рака, обнаружения гриппа и генной инженерии. Самые выстроенные методы обнаружения использовать этикетку для производства сигнал и использовать несколько стиральные и инкубации шаги. Использование предлагаемых микрофлюидальных устройств, гибридизации ДНК будет выполнена с большим числом последовательностей ДНК в одном устройстве без необходимости этикеток любого рода. Мы видим краткосрочных приложения, интегрирующие более сложные возможности для биочипа для повышения своей эффективности и модульность. Например, клапан на основе микрофлюидики имеет потенциал, чтобы обеспечить биочип с автоматическими и контролируемых способностей анализа. Еще один пример функциональной группы в устройство с другими биорецепторам, обеспечивая уникальные свойства зондирования, которые могут быть использованы в широком диапазоне применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают Robert W. Deutsch Foundation, обороны от угроз Агентство редукции (DTRA) и Национальный научный фонд Emerging Frontiers в исследования и инновации (Efri) за финансовую поддержку. Авторы также благодарят Мэриленд наноцентра и его Fablab для поддержки чистых помещений объекта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'' Silicon wafer Ultrasil 4-5664 Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1") Microchem positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2") Hoechst Celanse positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3") Microchem negative photoresist
Gold etchant Transene TFA No dilution
Chromium etchant Transene 1020AC No dilution
PDMS elastomer Dow Corning 3097366 1004
PDMS curing agent Dow Corning 3097358 1004
Biopsy punching tool Healthlink BP20
Tygon flexible tubing Cole Parmer  R 3603 0.015"
Tygon flexible adapter Cole Parmer  06417-41 0.0625"
1 ml syringe Beckton-Dickenson 301025
Monobasic potassium phosphate Fluka 1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous Sigma RES20765-A7
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine Aldrich C4706
6-mercapto-1-hexanol Aldrich 451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer Sigma 93017
Potassium hexacyanoferrate(III) Aldrich 455946
Complementary ssDNA #1 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) Oxford Instruments PlasmaLab System 100 Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit AJA International ATC 1800-V For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system Denton Custom-built For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat CH Instruments 660D
Syringe pump KD Scientific KDS230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
  2. Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
  3. Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
  4. Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
  5. Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
  6. Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
  7. Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
  8. Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
  9. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
  10. Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
  11. Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
  12. Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
  13. Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
  14. Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
  15. Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
  16. Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
  17. Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
  18. Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
  19. Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
  20. Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
  21. Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
  22. Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
  23. Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
  24. Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
  25. Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
  26. Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
  27. Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
  28. Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
  29. Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
  30. Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
  31. Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
  32. Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
  33. Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
  34. Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
  35. McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
  36. Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
  37. Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).

Tags

Биоинженерия выпуск 91 электрохимический импеданс-спектроскопии ДНК гибридизации биосенсор биочип микрофлюидики этикетки без обнаружения ограничено диффузии микротехнологий
Микрожидкостных основе Электрохимический Биочип для этикеток без анализа ДНК-гибридизации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H.,More

Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Gordonov, T., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51797, doi:10.3791/51797 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter