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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Published: September 10, 2014 doi: 10.3791/51797
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

Se presenta un biochip electroquímico basado en microfluídico para la detección de la hibridación de ADN. Tras ssDNA sonda funcionalización, la especificidad, sensibilidad y límite de detección se estudian con objetivos ssDNA complementarias y no complementarias. Resultados ilustran la influencia de los eventos de hibridación de ADN en el sistema electroquímico, con un límite de detección de 3,8 nM.

Abstract

La miniaturización de los procedimientos analíticos de sobremesa en la escala micro proporciona ventajas significativas en cuanto a tiempo de reacción, el coste, y la integración de las etapas de pre-procesamiento. La utilización de estos dispositivos hacia el análisis de los eventos de hibridación de ADN es importante porque ofrece una tecnología para la evaluación en tiempo real de los biomarcadores en el punto de atención para diversas enfermedades. Sin embargo, cuando la huella dispositivo disminuye el dominio de diversas ampliaciones de los fenómenos físicos. Estos fenómenos influyen en la precisión de fabricación y fiabilidad de funcionamiento del dispositivo. Por lo tanto, hay una gran necesidad de fabricar con precisión y operar estos dispositivos en una manera reproducible con el fin de mejorar el rendimiento global. A continuación, describimos los protocolos y los métodos utilizados para la fabricación y el funcionamiento de un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis preciso de los eventos de hibridación de ADN. El biochip se compone de dos partes: un chip de microfluidos contres micro-canales paralelos hechos de polidimetilsiloxano (PDMS), y un Arrayed electroquímica micro-chip de 3 x 3. Los eventos de hibridación de ADN se detectan usando un análisis de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). El análisis EIS permite monitoreo de las variaciones de las propiedades del sistema electroquímico que son dominantes en estas escalas de longitud. Con la capacidad para monitorizar los cambios tanto de transferencia de carga y la resistencia difusional con el biosensor, se demuestra la selectividad a los objetivos de ADNss complementarios, un límite de detección calculado de 3,8 nM, y una reactividad cruzada del 13% con otros ssDNA no complementaria siguiente 20 min de incubación. Esta metodología puede mejorar el rendimiento de dispositivos miniaturizados por elucidar sobre el comportamiento de la difusión en el régimen de micro-escala y al permitir el estudio de los acontecimientos de hibridación de ADN.

Introduction

Lab-on-a-chip de microfluidos dispositivos (LOC) proporciona numerosas ventajas en el diagnóstico clínico, monitoreo ambiental y la investigación biomédica. Estos dispositivos utilizan canales de microfluidos para controlar el flujo de fluido a las regiones del chip donde una variedad de procedimientos puede tener lugar incluida la mezcla de reactivo, de afinidad basada en la unión, transducción de señales, y la célula de cultivo de 1-4. Microfluídica proporciona muchas ventajas sobre las herramientas de diagnóstico clínicos convencionales, tales como lectores de placas de micropocillos o ensayos de cambio de gel electroforético. Los dispositivos microfluídicos requieren de 2 a 3 órdenes de magnitud (nanolitros en oposición a microlitros) menos reactivos para llevar a cabo ensayos similares. Además, estos dispositivos pueden aumentar la velocidad por la cual algunos eventos biológicos se producen debido al confinamiento más pequeña de las especies dentro de los canales 5,6. En tercer lugar, los sensores pueden ser integrados dentro de los dispositivos de microfluidos que utilizan técnicas de litografía y aguafuerte, que pueden proporcionar Detectio sin etiquetasn. Por último, estos dispositivos son baratos de producir y requieren poco trabajo por parte del técnico para operar 7-10.

Detección libre de etiquetas típicamente se realiza usando un transductor óptico o eléctrico. Los dispositivos ópticos pueden presentar un mejor rendimiento de detección debido a la interferencia menor con analitos en la muestra. Sin embargo, su rendimiento se ve comprometida en los casos en que el fondo de la muestra tiene la misma longitud de onda de resonancia como el sensor 11. Hay muchas ventajas de utilizar las señales eléctricas para realizar la detección química y biológica en los sistemas de microfluidos. La fabricación es inherentemente menos complicado ya que estos sensores por lo general sólo requieren electrodos estampados para operar. Además, las señales eléctricas pueden conectarse directamente con la mayoría del equipo de medición, mientras que otras modalidades de señal pueden requerir un transductor para convertir la señal 12-15. Sensores eléctricos comúnmente medir los cambios en impedance 16,17, capacitancia 18, o redox actividad 19. Sin embargo, nuevos desafíos se presentan como estos sistemas son miniaturizados. Los retos más importantes para superar incluyen: preparación de la muestra y la mezcla de fluidos (debido a el volumen de muestra bajo y el número de Reynolds), efectos físicos y químicos (incluyendo las fuerzas capilares, rugosidad de la superficie, las interacciones químicas entre los materiales de construcción y analitos), bajo señalización relación a ruido (producido por el área reducida de la superficie y volumen) 20-23, y la interferencia potencial de analitos electro-activas en muestras biológicas complejas (por ejemplo, de sangre y de saliva). Investigaciones posteriores de estos efectos se traducirá en las directrices para una fabricación precisa y manejo de estos dispositivos de una manera reproducible que mejoren en su desempeño general.

Detección de la hibridación de ADN se utiliza ampliamente para diagnosticar trastornos genéticos 24,25 y diversas formas de Cancer 26. Cada año, varias cepas de la gripe se identifican en los pacientes que utilizan los resultados de las técnicas de hibridación de ADN 27. El virus de la gripe por sí sola representa 36.000 muertes cada año en los Estados Unidos 28. Tales ejemplos podrían beneficiarse de un dispositivo de sobremesa de microfluidos que puede realizar las mismas técnicas de ensayo como un ensayo de desplazamiento en gel de lector de placas o con bajo volumen de muestra y en una fracción del costo sin sacrificar la sensibilidad o especificidad. Debido a las muchas ventajas de detección electroquímica libre de etiquetas, se ha utilizado ampliamente para la detección de eventos de hibridación de ADN 29,30. Una configuración donde los electrodos escala macro (en el rango de milímetros) se sumergen en vasos de precipitados con la solución de interés puede ser utilizado para proporcionar datos muy sensibles con respecto a la cinética de unión de secuencias de ADN de cadena sencilla a sus emparejan secuencias complementarias. Recientemente, ha habido algunos avances en la incorporación de la detección electroquímica en microfluidics para la hibridación de ADN. Se han realizado estudios en relación con la cinética de hibridación 31 y la integración de sensores para la detección de 15 en los canales de microfluidos. Sin embargo, todavía existe una necesidad de un dispositivo de microfluidos rápida de alto rendimiento que puede analizar los eventos de hibridación de ADN en paralelo sin complicados pasos de preparación de muestras.

El dispositivo se presenta en este trabajo proporciona una plataforma que permite múltiples interacciones que se proyectarán en paralelo y sin complicados pasos de preparación de muestras. Nuestro protocolo presenta la forma de microfluidos basada en biochips electroquímicos se microfabricados con la tecnología de sistemas micro-electromecánicos (MEMS) 32,33. Se describe el proceso de fabricación tanto del chip de microfluidos, hecho de polidimetilsiloxano (PDMS), y el chip electroquímica, compuesto por una matriz de electrodos. La funcionalización química del biochip con ssDNA sondas también se aborda. Finalmente, el Abildad del biosensor para detectar específicamente y analizar los objetivos de ssDNA se demuestra. En general, el biochip electroquímico basado en microfluidos es una técnica rápida y el análisis de alto rendimiento. Se puede utilizar para investigar las interacciones entre moléculas biológicas y transductores de conductores, y se puede utilizar en una variedad de aplicaciones de laboratorio en un chip.

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Protocol

1. microfabricación del chip de microfluidos

  1. Preparar Electroquímica Viruta
    1. Patrón Oro Electrodos
      1. Enjuague un espacio en blanco 4 '' oblea de silicio (calidad de primer grado) con acetona, metanol, e isopropanol ("AMI" limpio). Enjuague el isopropanol de la oblea con agua desionizada (DI) seguido de secado con pistola de N 2.
      2. Crecer una gruesa capa de pasivación 1 m SiO2 con la deposición de vapor químico mejorada por plasma herramienta (PECVD). Depositar una capa de espesor de 200 Å de cromo seguido de una capa de espesor de 2.000 Å de oro con una herramienta de pulverización catódica DC.
      3. Spin "PR1" fotorresistente positivo (parámetros de giro: 3.000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) para crear película uniforme ~ 1,6 m de espesor. Pre-hornear la oblea durante 1 min a 100 ° C en una placa caliente.
      4. Exponer la oblea con 190 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Desarrollar la oblea durante 30 segundos en 352 developer y enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma.
      5. Grabe el oro con grabador de oro durante 1,5 min. Grabe el cromo con mordiente de cromo para el ~ 30 seg. Enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma.
      6. Pele el fotoprotector con "AMI" procedimiento de limpieza.
        NOTA: OXIDANTE FUERTE Y POTENCIALMENTE EXPLOSIVA.
      7. Limpie la oblea con 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 mezcla ("Piranha" limpia) durante 1 min. Enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma.
    2. Patrón Platino Electrodos
      1. Spin "PR2" fotorresistente positivo (parámetros de giro: 3.000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) para crear película uniforme ~ 1.4 m de espesor. Pre-hornear la oblea durante 1 min a 100 ° C en una placa caliente.
      2. Exponer la oblea con 30 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Hornee la oblea durante 45 segundos a 125 ° C en una placa caliente. Flood exponerla oblea con 1.000 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda sin una fotomáscara. Desarrollar la oblea durante 2 minutos en 6: 1 desarrollador AZ400K y enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma.
      3. Deposita una capa gruesa 400 de titanio seguido de una capa gruesa de 1.600 Å de platino usando un sistema de evaporación por haz de electrones.
      4. Levante fotorresistente en un baño de acetona a ultrasonidos durante 5 min, seguido de enjuague con acetona e isopropanol. Enjuague la oblea con DI y secar con N2 arma.
  2. Preparar Canales ensayo
    1. Preparar Molde para Canales de ensayo
      1. Enjuague un espacio en blanco 4 '' oblea de silicio (grado de calidad de prueba) con "AMI" procedimiento de limpieza. Enjuague el isopropanol de la oblea con DI seguido de secado con pistola de N 2.
      2. Spin "PR3" fotorresistente negativo (parámetros de hilatura de 2 pasos:. Paso uno - 600 rpm, 120 rpm / s, 10 s Paso dos - 1.150 rpm, 383 rpm / seg,27 seg) para crear película uniforme ~ 100 m de espesor. Pre-hornear la oblea en una placa caliente (parámetros de cocción de 2 pasos:. Paso uno - la rampa encima de la temperatura ambiente a 65 ° C a 300 ° C / hr y mantenga la temperatura durante 10 minutos Paso 2 - rampa de hasta 95 ° C a 300 ° C / hr y temperatura de mantenimiento durante 30 min).
      3. Exponer la oblea con 2.500 mJ / cm 2 a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Post-hornear la oblea a acelerar hasta 95 ° C a 300 ° C / hr y mantenga la temperatura durante 10 minutos en un plato caliente. Desarrollar la oblea durante 10 min en propilenglicol monometil éter acetato (PGMEA) desarrollador. Enjuague la oblea con isopropanol y se seca con N 2 arma.
    2. Fabrique Canales ensayo
      1. Preparar 10: 1 polidimetilsiloxano (PDMS) mezcla (20 g de elastómero, 2 g de agente de curado) y desgasificar completamente en una cámara de vacío durante 20 min.
      2. Definir un recinto alrededor de la oblea molde con papel de aluminio y verter lentamente el curado PDMSsobre el molde.
      3. Hornear el molde con el PDMS en un horno de caja (parámetros de cocción de 2 pasos:. Paso uno - 5 min rampa encima de la temperatura ambiente a 80 ° C Paso 2 - mantenga a 80 ° C durante 17 min).
      4. Despegue la PDMS del molde y colocar en papel de aluminio. Cortar los chips de ensayo con un cuchillo cirujano, definir agujeros con una herramienta de troquelado de la biopsia.

2. Montar el dispositivo

  1. Alinear manualmente los canales de ensayo PDMS con los electrodos de trabajo en el chip electroquímica. PDMS pega bien al chip electroquímica, el sellado de los canales y la prevención de fugas.
  2. Conecte un tubo flexible (OD 0.087 '' y el ID de 0,015 '') a un codo de plástico o conector recto mediante un tubo flexible corto como un adaptador (OD 0.1875 '' y el ID de 0.0625 ''). Fije los conectores a cada una de las entradas perforados en el dispositivo.
  3. Conectar una jeringa en el otro extremo deel tubo y coloque la jeringa en una bomba de jeringa. Alternativamente cambiar el conjunto de una jeringa, un tubo, y un conector de acuerdo con el procedimiento paso requerido en la sección 3 y su solución correspondiente.

3. Analizar ADN Hibridación

NOTA: Introducir cada solución lentamente en el canal a una velocidad de flujo de 200 l / h hasta que se llena todo el canal.

  1. Funcionalizar cada microcanal vertical con una secuencia de sonda de ADN monocatenario diferente (realizar en paralelo a los 3 microcanales verticales separadas):
    1. Llenar cada microcanal con una solución diferente de incubación sonda de ADN monocatenario (tampón de fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, 10 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), y 1 sonda de ssDNA M), y se incuba durante 1 hora seguido de lavado del microcanal con PBS.
    2. Llenar los microcanal con una solución que contiene 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) en un tampón de PBS 10 mM, NaCl 100 mM y 1,395 mM TCEP, y incubate durante 1 hora seguido de lavado de la microcanal con PBS.
  2. Levante el PDMS, girar 90 ° a una orientación horizontal, y colocar hacia abajo para mostrar filas separadas de cámaras de reacción con cada fila que contiene un contador único y electrodo de referencia (Figura S1).
  3. Rellena los microcanales con solución de medición de control de 4x concentran citrato sódico salino tampón (SSC), y se incuba durante 20 min.
  4. Medición de fondo: Completa los microcanales con 5 mM de ferricianuro de ferrocianuro / 5 mM en solución de PBS y registrar los valores de impedancia del sistema electroquímico para diferentes frecuencias (espectroscopia de impedancia electroquímica; EIS) usando un potenciostato conectado a la de trabajo, contador, y electrodos de referencia ( EIS parámetros: intervalo de frecuencia de 1 MHz a 0,1 Hz, 10 puntos de datos de frecuencia por década, 25 mV de amplitud, 5 mV de polarización frente al electrodo de referencia). Repetir esta medición para cada electrodo de trabajo en los microcanales. Mida la hibridación de ADN (realizar para cada objetivo ssDNA no complementario y complementaria).
    1. Rellena los microcanales con destino solución de medición ssDNA de 4x concentrado tampón SSC que contiene 1 M de la meta de ssDNA, y se incuba durante 20 min. Mida el ADN según la etapa 3.4.

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Representative Results

Un proceso de fabricación controlable y precisa para el dispositivo experimental es esencial en la investigación. Se permite a los investigadores obtener rendimiento experimentos reproducibles y altas. Aquí hemos demostrado un alto rendimiento, el proceso de microfabricación alta reproducibilidad de un biochip electroquímico basado en microfluídico (Figura 1). Con una baja tasa de fracaso, pocos dispositivos han mostrado problemas de unión que llevan a la solución de las fugas. Con el fin de validar la actividad electroquímica del biochip, las mediciones de voltametría cíclica se realizan en los microcanales llenos de un par redox ferricianuro / ferrocianuro electro-activa. Figura 2 muestra la respuesta electroquímica reproducible de nueve electrodo de trabajo diferente en el chip. Estos resultados muestran que la actividad electroquímica es el mismo en todas las nueve cámaras del biochip permitiendo mediciones de alto rendimiento.

La mayoría de los sensores de hibridación de ADN inmovilizan ssDNAsondas sobre una superficie del sensor. Como el oro se utiliza para patrón de los electrodos de detección de los dispositivos de microfluidos, tioles son buenos candidatos para formar enlaces covalentes fuertes con las superficies de sensor 34. Una técnica común Conjugación implicado la adición de un grupo tiol funcional (-SH) en un extremo de la ssDNA. El enlace disulfuro SS protege el grupo tiol libre de la oxidación hasta que esté listo para ser utilizado. Una vez que el disulfuro se reduce por tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) Además, el tiol libre (-SH) se convierte en disponible para unir el ADN a una superficie de oro. Sin TCEP, los enlaces disulfuro de la ssDNA también se reúnen en el electrodo, pero el vínculo es mucho más débil que el enlace tiol-oro y no se mantendrán estables durante todo el experimento. En este trabajo, una monocapa estable ssDNA para la detección de la hibridación se ha logrado con tiempos de incubación entre una y dos horas. Una vez que las sondas de ssDNA se han montado sobre el electrodo, 6-mercapto-1-hexanol (MCH) se utiliza para pasivar unaregiones expuestas Y en la superficie para reducir los efectos de unión no específica 35. El grupo tiol del MCH permite la auto-montaje en el oro y el grupo hidroxilo reduce la adsorción no específica de la ssDNA en solución. La alta concentración de TCEP se utiliza para reducir los grupos tiol que pueden haber oxidados para formar enlaces disulfuro. Sin el alto contenido de TCEP en la memoria intermedia, la MCH podría formar monocapas inestables y los datos de impedancia podría variar debido a las variaciones en consecuencia con la carga superficial. La MCH tiene otra función importante cuando se utiliza como pasivación con moléculas ssDNA. El proceso de adsorción oxidativa de la MCH inyecta electrones en el electrodo y reduce el potencial de superficie. Esto provoca un efecto electrostático con el ssDNA sonda aniónico ya inmovilizado y el ssDNA encuentra en posición vertical de distancia desde el electrodo 36. Sondas verticales aumentan en gran medida la eficiencia de hibridación ya que el objetivo hebras ssDNA tienen un acceso mucho más fácil a la direcciónntire longitud de la secuencia de sonda. Este paso de pasivación es crucial para establecer una línea de base de medición de impedancia estable del sensor, la reducción de falsas señales positivas y la eliminación de cualesquiera moléculas débilmente unidos de la superficie.

El mecanismo de biosensores de eventos de hibridación de ADN se basa en fuerzas de repulsión entre el ADN cargado negativamente y otras moléculas electro-activas. Cuando se produce un evento de hibridación, más fuertes fuerzas de repulsión entre el ADN hibridado y las moléculas electroactivos hacen más difícil para las especies electro-activas se difundan hacia el electrodo 37. Aquí se utiliza un ferricianuro / pareja ferrocianuro como el indicador especies redox de estas fuerzas de repulsión, que se midió utilizando espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). Utilizamos este mecanismo de biosensores en el biochip electroquímico basado en microfluídica, y demostrar su capacidad para detectar los eventos de hibridación de ADN 33. Figura 3 muestra elselectividad del biosensor mediante la ilustración de variaciones de impedancia como resultado de sucesos de hibridación entre tres sondas de ssDNA y su objetivo ssDNA complementaria. Una reactividad cruzada 13% con otros ssDNA no complementarias siguientes 20 min de incubación ha sido demostrada. Estos resultados demuestran la viabilidad del dispositivo microfabricado para medir eventos de hibridación de ADN de una manera reproducible y de alto rendimiento. También hemos demostrado la sensibilidad del biosensor mediante la introducción de diferentes concentraciones de ssDNA diana complementaria a la sonda de detección. Figura 4 muestra la funcionalidad del biosensor con una tendencia de aumento de los valores de impedancia para altas concentraciones objetivo ssDNA. Siguiendo los cálculos de la resistencia a la difusión restringida 33 para diferentes concentraciones de ssDNA diana complementaria, un análisis de regresión lineal dio como resultado un límite teórico de detección de 3,8 nM por el cálculo de la correspondiente ssDNA concentración objetivo para la señal de fondo. En general, el biochip muestra la capacidad de detectar rápidamente la presencia de eventos de hibridación de ADN.

Figura 1
Figura 1. Fotografía de dispositivo de envasado bajo prueba (dimensiones de chip: 3,5 cm x 3,5 cm, altura microcanal es 100 micras y 500 micras de ancho).

Figura 2
Figura 2. validación electroquímico. Voltamogramas cíclicos de 9 (3 x 3 rejilla) electrodos de trabajo en presencia de ferrocianuro / ferricianuro par redox. La reproducibilidad entre los electrodos estampados se muestra por la forma semejante, alturas de los picos, y la separación de pico para todos los electrodos.Objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3 Especificidad del biosensor. El impacto de los eventos de hibridación entre diferentes objetivos ssDNA y tres ssDNA sondas diferentes en la resistencia de transferencia de carga. Al producirse un evento de hibridación de ADN, la fuerza de repulsión fuerte entre el ADN de doble cadena con carga negativa y las moléculas de ferrocianuro / ferricianuro cargados negativamente los resultados en una mayor resistencia de transferencia de carga.

Figura 4
Figura 4. Funcionalidad del biosensor. Diagrama de Nyquistde las mediciones de espectroscopia de impedancia electroquímica después de la introducción de 0,01, 0,1, 1, y 1 mM de destino ssDNA (la flecha indica el aumento de las concentraciones diana de ssDNA). El aumento de los valores de impedancia a bajas frecuencias (~ 15 Hz) para las concentraciones de ssDNA mayor objetivo son debido a las fuerzas de repulsión fuertes entre el ADN de doble cadena y las moléculas de ferrocianuro / ferricianuro.

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Discussion

Nuestros procedimientos demuestran la fabricación de un biochip electroquímico basado en microfluidos y su utilización para el análisis de los eventos de hibridación de ADN. A través de un proceso de microfabricación de alto rendimiento controlada desarrollamos un dispositivo compuesto por canales microescala integrados con una serie de transductores electroquímicos. Hemos ideado parámetros de procesamiento controlados para el procedimiento de fotolitografía del chip electroquímica y el molde a través de un canal de microfluidos enfoque iterativo. Estos pasos proporcionan orientaciones para la futura creación de otros dispositivos analíticos miniaturizados. Es importante destacar, que proporcionan un método para optimizar varios parámetros, tales como biosensores relación señal-ruido, estabilidad y sensibilidad. Después de la fabricación del dispositivo, que funcionalizar los transductores electroquímicos con sonda de ADN monocatenario como una bioreceptor, proporcionando un fin analítico único. Aunque estos procedimientos demuestran la baja tasa de fallo del dispositivo, solución de fugas muestra ser un major cuestión después del montaje del dispositivo y durante la realización del ensayo de hibridación de ADN. La investigación adicional de error de contacto en estos dispositivos mejoraría el rendimiento del proceso y lo hacen ideal para el estudio de micro-bio-sistemas.

En nuestros estudios, se demuestra la capacidad del biochip para detectar con precisión y, específicamente, los eventos de hibridación de ADN. Como parte de los parámetros de diseño para un nuevo micro-dispositivo analítico, se debe tener en cuenta la fabricación del dispositivo, lo que exige un enfoque iterativo para optimizar los parámetros de fabricación (por ejemplo, parámetros de fotolitografía, dimensiones de microcanales, tipo de metal depositado). Con el fin de detectar de manera eficiente los eventos de hibridación de ADN, ensamblaje sonda de ADN monocatenario y condiciones de hibridación tienen que ser optimizado también (por ejemplo., Tiempo de incubación, concentración de tampón, concentración de la sonda, la prevención de la adsorción no específica).

La capacidad para detectar rápidamente for secuencias particulares de ADN es muy beneficioso en los campos de la investigación del cáncer, la detección de la influenza y la ingeniería genética. La mayoría de los métodos de detección dispuestos utilizan una etiqueta para producir la señal y el uso de múltiples pasos de lavado e incubación. Utilizando los dispositivos de microfluidos propuestas, la hibridación de ADN se puede realizar con alto número de secuencias de ADN en el mismo dispositivo sin la necesidad de etiquetas de cualquier tipo. Tenemos la visión de las aplicaciones a corto plazo la integración de las capacidades más sofisticadas para el biochip para mejorar su rendimiento y modularidad. Por ejemplo, la microfluídica a base de válvula tiene el potencial de proporcionar el biochip con habilidades de análisis automáticos y controlados. Otro ejemplo es el dispositivo de funcionalización con otros bioreceptores, que proporciona propiedades únicas de detección que se pueden utilizar en una gama más amplia de aplicaciones.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen la Fundación Robert W. Deutsch, la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA), y la Fundación Nacional de Ciencias Emergentes Fronteras en la Investigación y la Innovación (EFRI) para el apoyo financiero. Los autores también agradecen a la Maryland NanoCenter y su FabLab apoyo instalación de salas limpias.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'' Silicon wafer Ultrasil 4-5664 Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1") Microchem positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2") Hoechst Celanse positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3") Microchem negative photoresist
Gold etchant Transene TFA No dilution
Chromium etchant Transene 1020AC No dilution
PDMS elastomer Dow Corning 3097366 1004
PDMS curing agent Dow Corning 3097358 1004
Biopsy punching tool Healthlink BP20
Tygon flexible tubing Cole Parmer  R 3603 0.015"
Tygon flexible adapter Cole Parmer  06417-41 0.0625"
1 ml syringe Beckton-Dickenson 301025
Monobasic potassium phosphate Fluka 1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous Sigma RES20765-A7
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine Aldrich C4706
6-mercapto-1-hexanol Aldrich 451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer Sigma 93017
Potassium hexacyanoferrate(III) Aldrich 455946
Complementary ssDNA #1 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) Oxford Instruments PlasmaLab System 100 Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit AJA International ATC 1800-V For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system Denton Custom-built For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat CH Instruments 660D
Syringe pump KD Scientific KDS230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre
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