Summary
Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.
Abstract
Mikro ölçekli analitik olarak masa üstü prosedürler minyatür reaksiyon süresi, maliyet, ve ön-işlem basamağından entegrasyonu ile ilgili olarak önemli avantajlar sağlamaktadır. Bu noktadan-bakım çeşitli hastalıklar için en biyobelirteçlerinin gerçek zamanlı değerlendirilmesi için bir teknoloji sunuyor, çünkü DNA hibridizasyon olayların analizi doğru bu cihazları kullanan önemlidir. Bununla birlikte, söz konusu olduğunda cihaz izi çeşitli fiziksel olaylar artar hakimiyetini azaltır. Bu olgular fabrikasyon hassasiyet ve cihazın çalışma güvenilirliğini etkilemektedir. Bu nedenle, doğru bir genel performansını artırmak amacıyla tekrarlanabilir bir şekilde bu cihazların imal ve işletmek için büyük bir ihtiyaç vardır. Burada, protokoller ve imalat ve bunların DNA hibridizasyon etkinliği doğru analizi için bir mikro-akışkan-bazlı elektro kimyasal Biochip işlemi için kullanılan yöntemleri tarif eder. Biochipin iki bölümden oluşur: microfluidic çip ileÜç polydimetilsiloksan (PDMS) yapılan paralel mikro kanallar, ve 3 x 3 dizilmiş elektrokimyasal mikro-çip. DNA hibridizasyonu olaylarının elektrokimyasal empedans Spektroskopisi (EIS) analizi ile tespit edilir. ÇBS analizi, bu uzunluk ölçeklerinde baskın elektrokimyasal sistemin özelliklerinin izlenmesi varyasyonları sağlayan. Biosensörlü hem yük transferi ve difüzyon direnç değişiklikleri izlemek için yeteneği ile, 20 dakika aşağıdaki ssDNA hedeflerine seçiciliğini, 3.8 nM hesaplanmış saptama sınırı ve diğer tamamlayıcı olmayan ssDNA'ya ile% 13 çapraz reaktivite göstermiştir kuluçkadan. Bu metodoloji mikro ölçekli rejimi difüzyon davranışı üzerinde aydınlatılmasına ve DNA hibridizasyon olayların çalışmayı sağlayarak minyatür cihazların performansını artırabilirsiniz.
Introduction
Mikroakışkan lab-on-a-chip (KO) cihazları, klinik teşhis, çevresel izleme ve biyomedikal araştırmalarda sayısız avantajlar sağlamaktadır. Bu cihazlar, çok çeşitli prosedürler 1-4 kültürlenmesini reaktif karıştırma, bağlanma afinitesi göre, sinyal iletimi, ve hücre de dahil olmak üzere yer alabilir çipin bölgelerine sıvı akışını kontrol etmek için mikro-akışkan kanal kullanmaktadır. Mikroakiskan gibi mikro plaka okuyucuları veya elektroforetik jel kayma deneyleri gibi geleneksel klinik tanı araçları üzerinde birçok avantaj sağlar. Benzer deneyler gerçekleştirmek için daha az reaktifleri (mikrolitre karşıt olarak nanolitre) mikroakışkan cihazları büyüklüğünün 2-3 siparişler gerektirir. Ayrıca, bu cihazlar, bazı biyolojik olayları kanalların içindeki 5,6 türlerin daha küçük sınırlanmasından dolayı meydana hangi hızını artırabilir. Üçüncü olarak, sensörler etiketsiz detectio sağlayabilir litografi ve aşındırma teknikleri kullanılarak mikroakışkan cihazlar içinde de entegre edilebilirn. Son olarak, bu cihazlar üretmek ve 7-10 faaliyet teknisyen kısmında küçük çalışma gerektirir ucuzdur.
Etiket içermeyen algılama tipik olarak bir optik veya elektriksel transdüktör kullanılarak gerçekleştirilir. Optik aygıtları nedeniyle numunede analitlerle ile daha az müdahaleye daha iyi algılama performansı sunabilir. Bununla birlikte, bunların performansı numunesinin arka sensörü 11 ile aynı çınlayan dalga boyuna sahip olan durumlarda taviz verilmektedir. Akışkan sistemleri biyolojik ve kimyasal algılama gerçekleştirmek için elektrik sinyallerini kullanarak pek çok avantajı vardır. Bu sensörler genellikle sadece çalıştırmak için desenli elektrot gerektiren bu yana imalat doğası gereği daha az karmaşıktır. Diğer sinyal yöntemleri sinyali 12-15 dönüştürmek için bir transdüser gerekebilir ise ek olarak, elektrik sinyalleri doğrudan en ölçüm ekipmanları ile arabirim olabilir. Elektrik sensörleri yaygın impedanc değişiklikleri ölçmekE 16,17, kapasite 18 veya redoks aktivitesi 19. Bu sistemler minyatürize Ancak, yeni sorunlar sunulmaktadır. Üstesinden gelmek için en önemli zorluklar şunlardır: numune hazırlığı ve (nedeniyle düşük örnek hacmi ve Reynolds sayısına kadar) sıvı karıştırma, fiziksel ve kimyasal etkilere (kılcal kuvvetler dahil olmak üzere, yüzey pürüzlülüğü, inşaat malzemeleri ve Analitlerin arasındaki kimyasal etkileşimler), düşük sinyalizasyon karmaşık biyolojik örneklerin (örneğin, kan ve tükürük) elektro-aktif analitlerden 20-23, ve potansiyel girişim (azaltılmış yüzey alanı ve hacim tarafından üretilen) gürültü oranı. Bu etkilerin İleri araştırmalar genel performansını geliştirmek olan bir yeniden üretilebilir bir şekilde, bu cihazların doğru imalatı ve kullanımı için bir kılavuz ile sonuçlanacaktır.
DNA hibridizasyon tayini, genetik bozukluklar 24,25 ve Canc çeşitli biçimlerini teşhis etmek için yaygın olarak kullanılırer 26. Her yıl, grip suşları birden çok DNA hibridizasyon teknikleri 27 sonuçları kullanan hastalarda belirlenmiştir. Grip virüsü yalnız Amerika Birleşik Devletleri'nde 28 36.000 ölümlerin her yıl için hesapları. Bu gibi örnekler, duyarlılık veya spesifikliği ödün vermeden düşük bir örnek hacmi, bir plaka okuyucu ya da jel kayma deneyi olarak ve düşük bir maliyetle aynı deney teknikleri gerçekleştiren bir tezgah üstü mikro sıvısal tertibat yarar olabilir. Nedeniyle etiketsiz elektrokimyasal algılama pek çok avantajı nedeniyle, DNA hibridizasyonu olaylarının 29,30 saptanması için yaygın olarak kullanılmaktadır. (Milimetre aralığında) makro ölçekli elektrotlar ilgi çözeltisi beherler daldırılır bir kurulum doğrultusunda kendi tamamlayıcı dizileri tek şeritli DNA dizilerinin bağlanma kinetiği açısından çok hassas veri temin etmek üzere kullanılabilir. Son zamanlarda, MICR elektrokimyasal algılama içeren birkaç gelişmeler olmuşturDNA hibridizasyonu için ofluidics. Çalışmalar hibridizasyon kinetiği 31 ve mikroakışkan kanallarda tespiti için 15 sensörlerin entegrasyonu konusunda yapılmıştır. Bununla birlikte, hala karmaşık numune hazırlama adımları olmadan paralel DNA hibridizasyon olayları analiz edebilen hızlı bir yüksek verimli mikroakışkan cihaz için bir ihtiyaç vardır.
Bu çalışmada sunulan cihaz, çoklu etkileşimler paralel ve karmaşık numune hazırlama adımları olmadan ekranlı olması için izin veren bir platform sağlar. Bizim protokol elektrokimyasal biochip mikro-elektromekanik sistemler (MEMS) teknolojisi 32,33 ile mikrofabrike nasıl mikroakışkan tabanlı sunar. Bu elektrotlar, bir tertibinden oluşur (PDMS) polidimetilsiloksan mikroakışkan çip, çip ve hem de elektrokimyasal üretim süreci tarif eder. SsDNA probları ile biochipe kimyasal fonksiyonlandırılması da ele alınmaktadır. Son olarak, AbilÖzellikle ssDNA hedefleri tespit ve analiz etmek için biyosensör Sığ gösterilmiştir. Genel olarak, mikroakışkan-bazlı elektro kimyasal biyoçip hızlı ve yüksek hacimli bir analiz tekniğidir. Biyolojik moleküller ve iletken dönüştürücüler arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir, ve lab-on-a-chip çeşitli uygulamalar içinde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mikroakışkan Chip 1. Mikro ve
- Elektrokimyasal Chip hazırlayın
- Desen Altın Elektrotlar
- Aseton, metanol ve izopropanol ("AMI" temiz) ile boş bir 4 'silikon gofret (birinci sınıf kalite) durulayın. N2 tabancası ile kurutma ile, iyonu giderilmiş (Di) su ile gofret izopropanol durulayın.
- Plazma destekli kimyasal buhar biriktirme (PECVD) aracı ile 1 mikron kalınlığında SiO 2 pasivasyon tabakası büyür. Bir DC püskürtme aracı ile altın 2.000 Å kalın bir tabaka tarafından takip krom 200 Å kalın bir tabaka yatırın.
- Spin "PR1" olumlu fotorezist (iplik parametreleri: 3,000 rpm, 1000 rpm / sn, 30 sn) 1.6 mikron kalınlığında üniform bir film ~ oluşturun. Ön fırında sıcak bir plaka üzerinde 100 ° C'de 1 dakika için gofret.
- 190 mj / Bir photomask ile 405 nm dalga boyunda cm 2 ile gofret Açığa. 352 dev 30 saniye boyunca gofretin geliştirilmesiaşığı ile kaçan kimse N 2 tabanca ile DI ile gofret ve kuru yıkayıp durulayın.
- 1.5 dakika boyunca altın yanığı ile altın etch. ~ 30 saniye boyunca krom yanığı ile krom etch. DI ile gofret durulayın ve N 2 tabanca ile kuru.
- "AMI" temiz prosedürü ile photoresist'i soyun.
NOT: Güçlü oksitleyici ve PATLAMAYA. - 1 H 2 SO 4: 4 ile gofret temizleyin H 2 O 2 karışımı ("Piranha" temiz) 1 dakika boyunca. DI ile gofret durulayın ve N 2 tabanca ile kuru.
- Desen Platin elektrotlar
- Spin "PR2" olumlu fotorezist (iplik parametreleri: 3,000 rpm, 1000 rpm / sn, 30 sn) 1.4 mikron kalınlığında üniform bir film ~ oluşturun. Ön fırında sıcak bir plaka üzerinde 100 ° C'de 1 dakika için gofret.
- 30 mj / Bir photomask ile 405 nm dalga boyunda cm 2 ile gofret Açığa. Sıcak bir plaka üzerinde 125 ° C'de 45 saniye boyunca gofret pişirilir. Sel maruz1000 mJ / bir fotomaske olmadan 405 nm dalga boyunda cm 2 olan gofret. 6 2 dakika gofret geliştirin: 1 AZ400K geliştirici ve DI ile gofret durulayın ve N 2 tabanca ile kuru.
- E-demeti buharlaştırma sistemi kullanılarak platin 1.600 Å kalın bir tabaka tarafından takip titanyum 400 Å kalın bir tabaka yatırın.
- Aseton ve izopropanol ile çalkalama, ardından 5 dakika boyunca ultraviyole aseton banyosu içinde fotorezist kaldırın. DI ile gofret durulayın ve N 2 tabanca ile kuru.
- Desen Altın Elektrotlar
- Deneyi Kanallar hazırlayın
- Deneyi Kanalları için Kalıp Hazırlama
- "AMI" temiz prosedürü ile boş bir 4 'silikon gofret (test kalitesinde) durulayın. DI ile gofret izopropanol yıkayın N2 tabancası ile kurutuldu.
- Spin "PR3" negatif Fotorezist (2 adımlı iplik parametreleri:. Adım bir - 600 rpm, 120 rpm / saniye, 10 saniye, iki Adım - 1.150 rpm, 383 devir / sn,27 sn) tekdüze bir film ~ 100 mikron kalınlığında oluşturun. Ön fırında sıcak plaka (2 adımlı pişirme parametrelerine gofretin:. Birinci aşamada - 300 ° C / saatte 65 ° C oda sıcaklığı ile rampa ve 10 dakika boyunca sıcaklığı tutmak Adım 2 - 95 ° C 'ye kadar rampa 300 ° C / s ve 30 dakika boyunca beklemeye sıcaklığı).
- 2.500 mJ / Bir photomask ile 405 nm dalga boyunda cm 2 ile gofret Açığa. Post-Bake 300 ° C / saatte 95 ° C 'ye kadar ve rampa ile gofretin sıcak bir plaka üzerinde 10 dakika boyunca sıcaklık tutun. Propilen glikol monometil eter asetat (PGMEA) geliştirici içinde 10 dakika için gofret geliştirin. N 2 tabanca ile izopropanol ve kuru ile gofret durulayın.
- Deneyi Kanallar Üretiyor
- 20 dakika boyunca bir vakum odasına 1 polidimetilsiloksan (PDMS) karışımı (20 g, elastomer, sertleştirici 2 g) ve tamamen Degas: 10 hazırlayın.
- Alüminyum folyo ile kalıp gofret etrafında bir kapalı tanımlayın ve yavaş yavaş sertleşmemiş PDMS dökünkalıp üzerine.
- Bir kutu fırın içinde PDMS ile kalıbın fırında (2 adımlı pişirme parametreleri:. Bir adım - 5 dakika 80 ° oda sıcaklığı kadar rampa C Adım 2 - 17 dakika boyunca 80 ° C'de tutun).
- Alüminyum folyo üzerine kalıp ve yerden Peel uzak PDMS. Bir biyopsi delme aracı ile delik tanımlamak, bir cerrah bıçakla tahlil cips kesin.
- Deneyi Kanalları için Kalıp Hazırlama
2. Cihazı monte
- Manuel elektrokimyasal çip üzerinde çalışan elektrotlar ile PDMS tahlil kanalları hizalayın. PDMS kanalları sızdırmazlık ve sızıntının önlenmesi, elektrokimyasal çip iyi yapışır.
- Bir plastik dirsek veya düz konnektör adaptör (OD 0,1875 've Kimlik 0.0625') gibi kısa bir esnek tüp kullanılarak esnek bir boru (OD 0.087 've Kimlik 0.015') bağlayın. Cihazdaki delik açılmış girişlerinin her bağlayıcıları takın.
- Diğer ucunda bir enjektörütüp ve bir şırınga pompası şırınga. Alternatif olarak, bölüm 3'te gerekli işlem adımı ve buna karşılık gelen bir çözüme göre, bir şırınga kümesi, bir tüp, ve bir bağlayıcı değiştirin.
3. DNA Hibridizasyon Analiz
Not: tüm kanal dolana kadar 200 ul / saatlik bir akış oranında kanala az her solüsyonun verilmesini.
- Farklı bir ssDNA prob dizisinin her dikey mikrokanalı işlevselleştirmek (3 ayrı dikey mikrokanallardaki paralel gerçekleştirmek):
- Her biri farklı bir ssDNA Probu inkübasyon çözeltisi ile mikrokanal doldurun (10 mM fosfat tamponu, 100 mM NaCI, 10 uM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ve 1 uM prob ssDNA) ve mikrokanal durulanması ile 1 saat boyunca inkübe PBS ile.
- 10 mM PBS, 100 mM NaCI ve 1.395 mM TCEP içeren bir tampon içinde 6-merkapto-1-heksanol (MCH) 1 mM ihtiva eden çözelti ve incu ile doldurun mikrokanal1 saat boyunca PBS ile asitleme mikrokanal çalkalayın.
- , PDMS kaldırıp yatay yönde 90 ° döndürmek ve benzersiz bir sayacı ve referans elektrot (Şekil S1) içeren her satır ile reaksiyon odaları ayrı satırları göstermek için aşağı yerleştirin.
- 4x kontrol ölçümü çözeltisi ile mikrokanallar tuz sodyum sitrat (SSC), tampon konsantre edildi doldurulmakta ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Arka plan ölçümü: (çalışma, sayaç bağlı bir potansiyostatı ile ve referans elektrotlar 5 mM PBS çözüm / 5 mM ferrosiyanür ferricyanide ile mikrokanallara doldurun ve (ÇBS elektrokimyasal empedans spektroskopi), farklı frekanslar için elektrokimyasal sistemin empedans değerleri kayıt ÇBS parametreler: 1 MHz 0.1 Hz, on yılda 10 frekans veri noktaları, 25 mV genlik, referans elektrot karşı 5 mV polarizasyon) frekans aralığı. Mikrokanallardaki her çalışma elektrot için bu ölçümü tekrarlayın. (Her tamamlayıcı olmayan ve ssDNA hedef için gerçekleştirmek) DNA hibridizasyonu ölçün.
- 4x hedef ssDNA ölçüm çözeltisi ile mikro doldurun hedef ssDNA'nın 1 uM SSC tamponu ihtiva eden, konsantre edildi ve 20 dakika inkübe edilir. 3.4 aşamasına göre olan DNA ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney cihazı için bir kontrol ve hassas imalat işleminin araştırma için gereklidir. Bu araştırmacılar tekrarlanabilir ve yüksek verimlilik deneyleri elde etmesini sağlar. Burada bir mikroakışkan-bazlı elektro kimyasal Biochip (Şekil 1), yüksek verim, yüksek bir tekrarlanabilirliği mikroüretim işlemi göstermiştir. Bir düşük başarısızlık oranı ile, birkaç cihazlar çözüm sızıntıya neden bağlanma sorunları göstermiştir. Biochipe elektrokimyasal aktivitesini doğrulamak amacıyla, voltametri ölçümleri bir elektro-aktif redoks çift ferrisiyanür / Ferrosiyanat dolu mikrokanallardaki yapılır. 2 çip üzerinde dokuz farklı çalışma elektrot tekrarlanabilir elektrokimyasal tepkisini göstermektedir. Bu sonuçlar, elektrokimyasal aktivitesi yüksek verimlilik ölçümleri izin Biochip dokuz odaları aynı olduğunu göstermektedir.
En DNA hibridizasyon sensörleri ssDNA immobilizeBir algılayıcı yüzeyi üzerinde probları. Altın desene mikroakışkan cihazlar için algılama elektrodu kullanıldığı gibi, tioller sensör 34 yüzeyleri ile sıkı bağlar oluşturmak için iyi adaylardır. Yaygın bir konjugasyon tekniği ssDNA bir ucunda fonksiyonel tiyol (-SH) grubuna ekleme içeriyordu. Bu, kullanıma hazır olana kadar, SS disülfid bağı oksidasyondan serbest tiol grubunu koruduğu. Disülfid tris azaltıldıktan sonra (2-karboksietil) fosfin (TCEP); ek olarak, serbest tiyol (-SH), bir altın yüzeye DNA bağlanması için kullanılabilir hale gelir. TCEP olmadan, ssDNA'nın disülfid bağları da elektrot üzerinde monte edecek, ancak bağ tiol altın bağı daha zayıf olan ve deney boyunca sabit kalmaz. Bu çalışmada, hibridizasyon saptanması için bir kararlı, ssDNA tek tabakalı bir ile iki saat arasında inkübasyon süresi ile elde edilmiştir. SsDNA probları elektrot üzerine monte edildikten sonra, 6-merkapto-1-heksanol (MCH) bir pasifleştirilmesi için kullanılırYüzeyde Y maruz bırakılan bölümler, spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için 35. Mch ait tiol grubu altın üzerine kendi kendine bir şekilde monte edilebilir ve hidroksil grubu çözelti içinde ssDNA'nın spesifik olmayan emilmesini azaltır. TCEP yüksek konsantrasyonu, disülfid bağları kurması için oksitlenir olabilir tiol gruplarının düşürülmesi için kullanılır. Tamponunda yüksek TCEP içerik olmadan, AÇS kararsız monokatmanlar oluşturacak ve empedans verileri nedeniyle yüzey ücret ile varyasyonları buna göre değişir. SsDNA molekülleri ile pasivasyonu olarak kullanırken AÇS önemli bir işlevi vardır. MCH oksidatif tutma işlemi elektrotun, elektronları enjekte eder ve yüzey potansiyelini azaltır. Bu anyonik prob ssDNA ile elektrostatik bir etkinin hareketsiz neden olur ve ssDNA dik uzak elektrot 36 yer almaktadır. Dik sondalar büyük ssDNA ipliklerini e çok daha kolay erişimi hedef yana melezleme verimliliğini artırmakSonda sekansının uzunluğu ntire. Bu pasifleşme, adım sensörün sabit bir empedans Bazal ölçüm kurulması yanlış pozitif sinyaller azaltılması ve yüzeyinden herhangi bir zayıf bağlı moleküllerin ayrılması için çok önemlidir.
DNA hibridizasyonu olaylarının Biyo-algılama mekanizması negatif yüklü DNA ve diğer elektro-aktif molekül arasındaki itme kuvvetleri dayanmaktadır. Bir hibridizasyon olayı gerçekleştiğinde, hibritlenmiş DNA ve elektro-aktif moleküller arasında daha kuvvetli bir itme kuvvetlerinin daha zor elektro-aktif türler, elektrot 37 doğru yayınım yapma eğilimini ediyor. Burada elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) kullanılarak ölçülmüştür, bu itme kuvvetleri için redoks türleri göstergesi olarak ferrisiyanür / ferrosiyanür çift kullanın. Biz mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal biochipe bu biyoalgı mekanizmayı kullanmak ve DNA hibridizasyon olayları 33 tespit kabiliyetini göstermek. 3 göstermektedirüç, ssDNA probları ve ssDNA hedef arasında hibritleşme olaylarının bir sonucu olarak empedans varyasyonları gösteren ile biyosensör seçiciliği. Inkübasyon 20 dakika sonra diğer olmayan şekilde tamamlayıcı ssDNA ile% 13 çapraz reaktivitesi gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bir tekrar üretilebilir ve yüksek verimli bir şekilde DNA hibridizasyonu olaylarının ölçmek için mikrofabrike cihazın uygulanabilirliğini gösterir. Biz de algılama probu ssDNA hedef farklı konsantrasyonlarda getirerek biyosensör duyarlılığını göstermiştir. 4 yüksek ssDNA'ya hedef konsantrasyonları için empedans değerleri artan bir trend ile biyosensör işlevselliğini göstermektedir. SsDNA hedef farklı konsantrasyonları için sınırlı difüzyon direnci 33 hesaplamaların ardından, bir doğrusal regresyon analizi karşılık gelen ssDNA hesaplanması ile 3.8 nM tespit teorik limiti ile sonuçlanmıştır arka plan sinyali için hedef konsantrasyonu. Genel olarak, biochipin hızlı DNA hibridizasyonu olaylarının mevcudiyetini duymak üzere kapasitesini göstermektedir.
Test altındaki ambalajlı cihazın Şekil 1. Fotoğraf (yonga boyutları: 3,5 cm x 3,5 cm; mikrokanallı yüksekliği 100 mikron ve genişliği 500 mikron).
Şekil 2. Elektrokimyasal doğrulama. 9 (3 x 3 ızgara) Siklik voltamogramlan ferrisiyanür / ferrosiyanür redoks çift varlığında çalışan elektrotlar. Desenli elektrotlar arasında tekrarlanabilirlikleri elektrotlarla benzer şekildedir, zirve yüksekliklerinin ve tepe ayrılması gösterilmiştir."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" target = "_blank"> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil biyosensör 3. Özgünlük. Farklı ssDNA hedefleri ve yük transferi direnci üzerinde üç farklı ssDNA'ya problar arasındaki melezleme olayların etkisi. DNA hibridizasyon olayı üzerine, negatif yüklü, çift şeritli DNA ve daha yüksek yük aktarımı direncinin negatif yüklü ferrosiyanür / ferrisiyanür molekülleri sonuçlar arasındaki kuvvetli itme kuvveti.
Biyosensör Şekil 4. İşlevsellik. Nyquist arsa0.01, 0.1, 1 ve 1 mcM hedef ssDNA tanıtımı aşağıdaki elektrokimyasal empedans spektroskopi ölçümleri (Ok ssDNA hedef konsantrasyonlarını artırarak gösterir). Daha yüksek bir hedef, ssDNA konsantrasyonları düşük frekanslarda (~ 15 Hz) yüksek empedans değerleri dsDNA ve Ferrosiyanat / ferrisiyanür moleküller arasında daha kuvvetli itme güçlerine bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim prosedürleri microfluidic tabanlı elektrokimyasal biochipe üretim ve DNA hibridizasyon olaylar analizi için kullanımı göstermektedir. Yüksek verim kontrollü mikroimalat süreçle elektrokimyasal dönüştürücüler bir dizi ile entegre mikro kanallar oluşan bir cihaz geliştirmek. Biz yinelemeli bir yaklaşımla elektrokimyasal çip ve mikroakışkan kanal kalıp fotolitografya prosedürü için kontrollü işlem parametrelerini tasarladılar. Bu adımlar diğer minyatür analitik cihazların gelecekteki oluşturulması için yönergeler sağlamak. Önemlisi, bu tür sinyal-gürültü oranı, istikrar ve duyarlılık gibi çeşitli biyoalgı parametrelerini optimize etmek bir yöntem sağlar. Cihaz imalatı, ardından, eşsiz bir analitik amacı sağlayan, bioreceptor olarak ssDNA probu ile işlevselleştirilmesi elektrokimyasal dönüştürücüleri. Bu işlemler düşük aygıt başarısızlık oranı göstermesine karşın, çözüm kaçak bir majo olmak gösterir,ihtiva eden ve DNA hibridizasyon tahlilinin gerçekleştirilmesi sırasında montaj Aşağıdaki r sorunu. Bu tür cihazlarda bağlanma yetersizliği daha fazla araştırma işleminin verimini artırmak ve mikro biyo-sistem çalışma için ideal yapar.
Çalışmalarımızda, biz doğru ve özellikle DNA hibridizasyon olayları algılamak için biochipe yeteneğini göstermek. Yeni bir analitik mikro cihazın tasarım parametrelerinin bir parçası olarak, bir tanesi göz önüne üretim parametrelerini optimize etmek için yinelemeli bir yaklaşım gerektirmektedir, cihazın üretim almalıdır (örneğin, fotolitografi parametreleri, mikrokanal boyutları, metal kaplama tipi). Verimli DNA hibridizasyon olaylarını belirlemek için, ssDNA Probu montaj ve hibridizasyon koşulları da optimize edilmesi gerekir (örneğin,., Inkübasyon süresi, tampon konsantrasyonu, prob konsantrasyonu, spesifik olmayan bir adsorpsiyon önlenmesi).
Hızla fo ekrana yeteneğiR özellikle DNA dizileri, kanser araştırmaları, grip algılama ve genetik mühendislik alanlarında çok faydalıdır. En dizilmiş algılama yöntemleri sinyali üretmek ve birden fazla yıkama ve inkübasyon adımları kullanmak için bir etiket kullanmaktadır. Önerilen mikroakışkan cihazlar kullanarak, DNA hibridizasyonu herhangi bir etiket gerek olmadan aynı cihaz içinde DNA dizilerinin sayısı ile yapılacaktır. Biz onun performansını ve modülerliği artırmak için biochipe daha sofistike yetenekleri entegre yakın vadeli uygulamaları öngörülüyor. Örneğin, valf tabanlı ve arayüz otomatik ve kontrol analiz yetenekleri ile Bioçip sağlama potansiyeline sahiptir. Başka bir örnek, diğer bioreceptors cihazı işlevselleştirilmesi daha geniş bir uygulama aralığı içinde kullanılabilecek benzersiz algılama gerçekleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar mali destek için Robert W. Deutsch Vakfı, Savunma Tehdit Azaltma Ajansı (DTRA), ve Araştırma Ulusal Bilim Vakfı Yükselen Frontiers ve Yenilik (EFRI) kabul. Yazarlar ayrıca temiz oda tesisi destek için Maryland Nanocenter ve FabLab teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | 0.0625" |
| 1 ml syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 | |
References
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
