Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בלוטות הלימפה הן תאים מיוחדים שבו תגובה חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים עצמיים-זרים והם יזמו ותאמו. ההליך שהוצג כאן מתאר עיכול אנזימטי קצר בשילוב עם pipetting המכני האוטומטי לקבל השעיה תא בודד בלוטה לימפה ולקבל גישה לתאי סטרומה בלוטה לימפה קיימא השומרים על הבעת פני השטח של כמה מולקולות.

תא סטרומה בלוטה לימפה בצורת הפיגום של בלוטות לימפה ולמלא שלושה תפקידים מרכזיים: ראשון שהם לסנן נוזלי גוף לדגום אנטיגנים, פתוגנים והדפוס שלהם הפתוגן הקשורים המולקולרי (PAMPs), כמו גם ציטוקינים ודפוס מולקולרי הקשורים סכנה (damps) נוכחי בגוף. שנית, הם מושכים ולהורות תאי הצגת אנטיגן (APC) ולימפוציטים מסוג האינטראקציה וליזום תגובה חיסונית אדפטיבית; ושלישית, הם מספקים סביבה מבנית להומאוסטזיס וההתמיינות של לימפוציטים מסוג 1-3. במהלך תאי סטרומה הבלוטה לימפה לדלקת לייצר גורמי גדילה, ציטוקינים וכמוקינים, להסתגל לנפיחות ובכך ארגון האינטראקציה בין תאים דנדריטים (DCS), טריקו, וB- תאים. התזמור של תגובות חיסוניות אפשרי רק בשל הארכיטקטורה המבנית המורכבת שהוקמה על ידי אוכלוסיות תאי סטרומה שונות.

תאי סטרומה בלוטה לימפה הם תאים שליליים CD45 וניתן להבחין על ידי הביטוי של CD31 או gp38 בתאי fibroblastic ואנדותל 1 -6. Gp38 + CD31 - מגדיר תאי אזור T רשתי (TRC, הידוע גם בFRC: תאי רשתית fibroblastic), gp38 + CD31 + מגדיר תאי הלימפה אנדותל (LEC), gp38 - CD31 + מגדיר תאי האנדותל בדם (BEC). יתר על כן, אפיון של האוכלוסיות חשף את קיומם של תאי סטרומה בלוטה לימפה אחרים. ואכן, אוכלוסיית תאים כמו pericyte קטנה התאפיינה בתוךgp38 - CD31 - אוכלוסיית 7. לכן, עיבוד של הליך הבידוד הוא יתרון עבור זיהוי ואפיון של התכונות פונקציונליות של תאי סטרומה בלוטה לימפה שונים.

לפני הפיתוח של מערכת עיכול תאי סטרומה בלוטה לימפה פרוטוקולי המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה היה מוגבל בתצפיות באתר באמצעות סעיף ומיקרוסקופיה רקמה. עם זאת, מחקרים מבניים ותפקודיים הראו מאפיינים חשובים של תאי סטרומה בלוטה לימפה. תאי סטרומה בלוטה לימפה קשורים עם podoplanin, קולגן ומטריצת חוץ תאית חלבונים (ECM) כדי ליצור מבנה מורכב 3 ממדים הנקרא מערכת צינור, שמעביר חלבונים לימפה ומסה מולקולרית הקשורים נמוכה מסינוס subcapsular של הבלוטה לימפה לגבוהה אנדותל venules באזור תאי T 8. DCs נמצא בקשר הדוק עם תאי סטרומה ואפשר לראות בולט לקון צינורימבנה duit לדגום נוזל ולזהות אנטיגנים 8. האינטראקציה של תאי בלוטה לימפה סטרומה (TRCs וLECs) עם DCs מתווכת על ידי השחרור וההצגה של CCL21 כמוקינים וCCL19 9,10. CCL19 וCCL21 מוכרים על ידי קולטן CCR7 להקל DCs ותאי T לנדוד לאזור תא T הבלוטה לימפה 4,11. למרות שימוש בכמוקינים דומים, יש לי תאי DCs וT מסלולי נדידה שונים לבלוטות הלימפה 12. מאוחר יותר, באמצעות עיכול אנזימטי של בלוטות לימפה ובידוד של תאי סטרומה בלוטה לימפה טהורים, מחקרים פונקציונליים בוצעו על עצם את התפקיד של תאי סטרומה הבלוטה לימפה השונים והיכולת שלהם לתקשר עם DCs וT / תאי B 6,13. ראשית, crosstalk בין תאי IFN-γ ייצור מפעיל T ותאי סטרומה בלוטה לימפה גורם ייצור של תחמוצת חנקן המטבוליט מוצגת לצנן תגובות תא T ושגשוג באיברי הלימפה המשניים 14-16. שנית, לימפה nתאי סטרומה שיר הלל כבר דיווחו לתמיכה בבידול של תת DC רגולציה באמצעות הייצור של IL-10 17, ולווסת הומאוסטזיס תא T נאיבי באמצעות הייצור של IL-7 6,18. שלישית, ביטוי TLR בתאי סטרומה בלוטה לימפה מצביע על כך שתאי סטרומה רגישים לאותות הנגזרים מזיהום או מולקולות עצמית שפורסם במהלך פגיעה ברקמות. ואכן, הטיפול בתאים סטרומה בלוטה לימפה עם ליגנד של פולי TLR3 (אני: C) גורם גברת ביטוי צנועה של גדול אני כיתה המורכבת histocompatibility ביטוי וגברת ביטוי של מולקולת שיתוף מעכב PD-L1, אך לא של מולקולות costimulatory, וכתוצאה מכך שינויים דרמטיים ברקמות היקפי אנטיגנים ביטוי 19. כמה קבוצות הראו תאי סטרומה בלוטה לימפה לבטא אנטיגנים רקמות היקפיים ולגרום לסובלנות של תאי T עצמי תגובתי 19,21-27. לכן, הבנת יחסי הגומלין בין תאי סטרומה בלוטה לימפה ומחדש נודדים והאחרותתאי בלוטה לימפה sident יעזרו למצוא מולקולות יעד חדשות כדי לאפשר הפעלה או דיכוי של מערכת חיסונית בזמן דלקת. לכן, יש צורך ביישום ההפרדה האנזימטית שפורסמה של בלוטות לימפה.

פרוטוקולים שפורסמו בעבר להשתמש בשילובים שונים של עיכול אנזימטי מבוסס collagenase עם לחץ מכאני נמוך 6,19,20. עם זאת, incubations הארוך עם אנזימי עיכול או שילוב של אנזים עיכול שונה עלול לבזות מולקולות פני השטח שונות הנדרשות על מנת לנתח את מצב ההפעלה ולזהות תאי סטרומה בלוטה לימפה חדשים. בהתאם לסוג של ניתוח תא סטרומה, פרוטוקול הקישור או פלטשר הפרוטוקול עשוי להיות מתאים יותר. בהליך המתואר, עיכול אנזימטי מעט קצר יותר בשילוב עם פיצול של מכאני אוטומטי כדי למזער השפלה סמן פני השטח של תאי סטרומה הבלוטה לימפה קיימא. הליך זה מאפשר בידוד מאוד לשחזור והבחנה של אוכלוסיות תאי סטרומה בלוטה לימפה עם שונות נמוכות וכדאיות יותר מ 95%. תאי סטרומה הבלוטה לימפה המבודדים הטרי ניתן להשתמש ישירות לביטוי סמן משטח, ניתוח חלבון, ומחקרי תעתיק, כמו גם הקמתה של קווי תאי סטרומה לבצע מבחני תפקודיים במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בפרסום הסרטון הזה ופרוטוקול, את כל ההליכים בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי בעלי החיים קנטונלית הרשות באזל, שווייץ.

.1 בלוטות הלימפה הכנה ועיכול

  1. מים מראש בחום בכוס ל37 מעלות צלזיוס בבוחש מגנטי עם צלחת חימום.
  2. הכן בסיסי בינוני כדלקמן: DMEM בינוני (ללא פירובט) השלים עם FCS 2%, 1.2 מ"מ CaCl 2 ופן / סטרפטוקוקוס (פניצילין 100 יחידות, של סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם).
  3. לעקר את כל מכשירים לנתיחה לפני השימוש.
  4. להרדים עכברי תורם בלוטה לימפה לCO 2 מחנק וסביבה נקי מחיידקים לנתח את בלוטות הלימפה. אל לנתח את השומן שמסביב. הערה: פרוטוקול זה הוא מותאם לצומת היקפית-ניקוז עור לימפה (מפשעתי, זרוע, בית השחי).
  5. מניחים בלוטות לימפה בצלחת פטרי המכילה סטרילי בינוני בסיסית קר 2 מ"ל קרח.
  6. לשבש את ca הבלוטה לימפהpsule באמצעות שתי 25 מחטי G קבועות במזרק 1 מ"ל.
  7. העברת רקמת הבלוטה לימפה שיבש בצינור מסביב לתחתית 5 מ"ל פוליפרופילן המכיל 750 בינוני בסיסי μl בתוספת 1 מ"ג / י DNAse 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​מ"ל Collagenase IV ו
  8. להוסיף בוחש מגנטי סטרילי אחד בצינור אחד.
  9. צינור מקום בכוס עם 37 ° C שחומם מראש מים ומערבבים את הצינורות בקצב איטי (סיבוב 1 / sec) עבור 30 דקות.
  10. הסר את הצינור מהבוחש המגנטי עם צלחת חימום ולתת שברי בלוטה לימפה להתיישב.
  11. מוציא בזהירות את supernatant המועשר ב" תאים לא סטרומה ". הערה: אם הניתוח של T, B, תאים דנדריטיים וCD45 - gp38 - CD31 - הוא צפוי, לשמור את החלק "תאים שאינן סטרומה".
  12. לשטוף נותר רקמת בלוטה לימפה פעם אחת עם 750 בינוניים בסיסי μl. הערה: שלב זה הוא הכרחי רק אם עובד עם עכברי חיסון מוסמך.
  13. בואו ברי בלוטה לימפה להתיישב.
  14. הסר אתשבריר צף תאים שאינה סטרומה.
  15. הוסף לברי הבלוטה לימפה בינוניות בסיסי 750 μl בתוספת 3.5 מ"ג / מ"ל ​​Collagenase D ואני DNase 40 מיקרוגרם / מ"ל
  16. צינור מקום בחזרה בכוס המכילה 37 ° C שחומם מראש מים.
  17. לעכל רקמת בלוטה לימפה במשך 5 דקות תוך ערבוב לאט.
  18. שברי Disaggregate הלימפה רקמת צומת על ידי pipetting וערבוב 700 μl ל10 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית. הערה: זה משבש רקמת בלוטה לימפה כדי לשפר את העיכול.
  19. מניחים את הצינור בחזרה בכוס עם 37 מעלות מים שחומם מראש C.
  20. שברי רקמת הבלוטה לימפה Digest עוד 10 דקות תוך ערבוב לאט.
  21. Disaggregate ברי רקמת בלוטה לימפה על ידי pipetting וערבוב ל99 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית.
  22. הוספת 7.5 μl של 0.5 M EDTA כדי להבטיח תחזוקה של השעיה תא בודדת.
  23. שברי רקמת הבלוטה לימפה Disaggregate על ידי צינורtting וערבוב ל99 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית.
  24. הוסף בינוני בסיסית 750 μl ולהעביר תאים דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר.
  25. ההשעיה תא צנטריפוגה 5 דקות ב1,500 XG, 4 ° C.
  26. תאי סטרומה כעת ניתן להשתמש לצורך ניתוח נוסף.

.2 צביעת תאים לימפה צומת סטרומה

  1. השתמש בשילוב של אנטי CD45, אנטי podoplanin (gp38), נוגדנים נגד CD31 להכיר בהצלחה תאי TRC, LEC, BEC וDN.
  2. דגירה רקמת הבלוטה לימפה מתעכל עם גשש חי / מת, אנטי CD45-FITC (1: 200), אנטי gp38-PE (1: 200), אנטי CD31-APC (1: 200) ב100 μl HBSS המכיל 2 FCS% לפחות 20 דקות, 4 ° C, בחושך.
  3. שוטף את התאים והוסיפו 500 l של HBSS המכילים 2% FCS
  4. ההשעיה תא צנטריפוגה 3 דקות XG ב 1500, 4 ° C..
  5. להשעות Re בשל HBSS 100 μl המכיל 2% FCS.
  6. הפעל את התאים המוכתמים בזרימה cytometer equippעורך עם אופטיקה הבאה: מקור עירור עם עד שלושה לייזרים: כחול (488 ננומטר,, מצב מוצק 20 mW מקורר אוויר), אדום (633 ננומטר, 17 mW HeNe), וסגול (405 ננומטר, 30 mW מצב מוצק) .
  7. השער CD45 - תאים שלא לכלול תאי hematopoietic.
  8. singlets השער (FSC-W) ותאי חיים (LIVE / גשש DEAD) שלא לכלול כפילויות ותאים מתים.
  9. gp38 עלילה לעומת CD31 לדמיין TRC (gp38 + CD31 -), LEC, BEC (gp38 - CD31 +) (gp38 + CD31 +) וDN (gp38 - CD31 -) תאים (ראה איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול הנוכחי הוא פרוטוקול עיכול שונה פורסם על ידי קישור et al., 2007 6 עם זמן קצר יותר לעיכול (45 מרבי דקות) בשל פיצול של מכאני עם פיפטה רבה אוטומטית. בנוסף, ההליך הוא סטנדרטי יותר, ממזער פירוק של סמני משטח בתאי סטרומה בלוטה לימפה שונים ומאפשר את הטיפול במדגם אחד או יותר באותו הזמן.

Collagenase IV וCollagenase D בקישורי פרוטוקול 6 ופרוטוקול נוכחי או Collagenase P וDispase בפלצ'רים פרוטוקול 13 לשמור על כדאיות תאי סטרומה הבלוטה לימפה ולחוס על העיכול של כמה סמני משטח כולל CD45, gp38 וCD31. כדי לבדוק את בלוטות פרוטוקול, בבית השחי, הזרוע וימפה מפשעתי הנוכחיות הוסרו ומתעכלות לבודד תאי סטרומה. ניתוח של CD45, ביטוי gp38 וCD31 הפגין הנוכחות של תאי TRC, LEC, BEC וDN המבודדים מC57BL מ '/ 6קרח (איור 1, אסטרטגית gating).

לחץ מכאני עשוי להפחית את הכדאיות של תאי סטרומה הבלוטה לימפה במהלך עיכול. השוואת הכדאיות של אוכלוסיות מבודדות של תאי סטרומה באמצעות שלושה הפרוטוקולים שונים, נמצא כי הכדאיות גבוהה מ95% בפרוטוקול פלטשר, אך נמוכה עבור שני פרוטוקול נוכחי ופרוטוקול קישור (איור 2 א), אם כי תכנית פרוטוקול נוכחית טוב יותר הישרדות בתת אוכלוסיות BEC אז קישור פרוטוקול. תאי המספר כולל התאושש הודעה עיכול של תת תא סטרומה הבלוטה לימפה היה מעט גבוה יותר בפרוטוקול נוכחי בהשוואה לפרוטוקול קישור ופרוטוקול פלטשר (איור 2 א). תוצאות אלו מראות כי הפרוטוקול הנוכחי שומר על יכולת קיום של תאי סטרומה בלוטה לימפה דומים לפרוטוקולים שפורסמו. ההבדלים העיקריים בין שלושה הפרוטוקולים מפורטים בטבלה 1.

סמני משטח מחדש נדרש לאפיין תאי סטרומה הבלוטה לימפה על ידי cytometry זרימה ולבודד אותם על ידי מיון תאים. TRCs וLECs מבודד באמצעות נוכחי, פרוטוקולי הקישור ופלטשר הושוו לIA ב, CD140a, CD80, PD-L1 וביטוי CD40. לאחר בידוד תאי סטרומה על ידי כל שלושת הפרוטוקולים, מצאנו את הביטוי של IA ב, CD80, CD140a, PD-L1, וCD40 היה גבוה יותר על עיכול עם שיתוק מוחין וLP בשני TRCs וLECs (איור 2). תוצאות אלו מצביעות על כך שהשפלה של כמה מולקולות פני השטח עם Collagenase IV וD הן פחות חזקה מאשר עם Collagenase P וDispase.

יחדיו, הפרוטוקול הנוכחי כולל עיכול קצר בשילוב עם פיצול של מכאני אוטומטי כדי למזער השפלה סמן פני השטח של תאי סטרומה הבלוטה לימפה קיימא.

"/>
איור 1 צמתים TRC, תאי LEC, BEC, וDN מכתים, gating, וכימות. ימפה מעכברי C57BL / 6 היו מתעכלים הבאים הפרוטוקול הנוכחי ומוכתמים עם CD45, gp38 וCD31, המלח חי / להגדיר TRC, LEC, BEC, וDN תאים על ידי הזרימה cytometry. הנתונים מראים תוצאות נציג מכתים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2 ביטוי ליכולת הקיום ומשטח סמן של תאי סטרומה בלוטה לימפה. בלוטות הלימפה מעכברי C57BL / 6 היו מתעכלים הבא הנוכחי (CP), של הקישור (LP) והפרוטוקול של פלטשר (FP) ומוכתם עם CD45, gp38 וCD31 להגדיר תאי TRC, LEC, BEC וDN על ידי cytometry זרימה.) Viability ומספר תא כולל של כל אוכלוסיות תאי סטרומה הבלוטה לימפה לאחר צביעה חי / מת (n ≥ 5, נתונים משולבים של 2 ניסויים בלתי תלויים, ברים מייצגים SEM). B) ניתוח של ביטוי על פני השטח של IA ב (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) וCD40 (PE-Cy7) על TRCs וLECs (n = 6 לFP וn = 11 לLP וCP , נתונים משולבים של 2 ניסויים בלתי תלויים, ברים מייצגים SEM). ערכים גיאומטריים MFI אוטומטי הקרינה לLEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82.5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

נוכחי פרוטוקול-אנזימים נוכחי פרוטוקול קישור פרוטוקול-אנזימים Link-פרוטוקול Fפרוטוקול-אנזימי Letcher פלטשר פרוטוקול
Collagenase IV, אני DNase 30 דקות, 37 מעלות צלזיוס, ערבוב Collagenase IV, DNAse אני 30 דקות, 37 מעלות צלזיוס Collagenase P, Dispase, אני DNAse 20 דקות, 37 מעלות צלזיוס, להפוך כל 5 דקות
Collagenase D, אני DNase 5 דקות, 37 מעלות צלזיוס, ערבוב, resuspend Collagenase D, DNAse אני 20 דקות, 37 מעלות צלזיוס Collagenase P, Dispase, אני DNAse 10 דקות, 37 מעלות צלזיוס, resuspend 30 שניות
10 דקות, 37 מעלות צלזיוס, ערבוב Collagenase D, DNAse אני 37 מעלות צלזיוס, resuspend כל 10 דקות עד לעיכול מלא Collagenase P, Dispase, אני DNAse 37 מעלות צלזיוס, resuspend כל 5 דקות עד שמערכת עיכול מלאה
resuspension המכני האוטומטי

.1 סיכומים קצרים השולחן של CP, LP, אנזימי FP בשימוש ופרוטוקולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה לאחרונה הפך למוקד מחקר עקב התפתחותם של שני פרוטוקולי עיכול פורסם 6,13. שני הפרוטוקולים מספיקים כדי לקבל תאי סטרומה הבלוטה לימפה בודדת אך שונים בשימוש באנזימי עיכול ואת הזמן של עיכול. מאחר ותאי סטרומה וסמני פני השטח שלהם רגישים לעיכול אנזימטי ולחץ מכאני, נדרש פרוטוקול מותאם.

הבידוד של תאי סטרומה הבלוטה לימפה קיימא מהבלוטה לימפה טריות גזור הוא הצעד הראשון על מנת לבצע פנוטיפי וניתוח פונקציונלי. לכן, חשוב לעיכול בזהירות עם הריכוז המוגדר של אנזימים, בטמפרטורה יציבה ולזמן המצוין. שני פרוטוקולי עיכול תוארו 6,13, אולם בצעדי עיכול ארוכים למדי. כדי לצמצם את הזמן של עיכול, disaggregation המכני נכלל וטופל בעזרת פיפטה רבה. על דואר של היתרונות של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהיא מאפשרת בידוד של תאי סטרומה רק 45 דקות, ולכן צמצום זמן הדגירה שלהם עם אנזימי עיכול. בנוסף, ערבוב מתמיד במהלך העיכול מאפשר הגישה האופטימלית של אנזימי העיכול למבנה הבלוטה לימפה. יתר על כן, מערכת עיכול הנפח הופחת ל 750 μl להקטין את כמות האנזים המשמשת.

כוח מכאני מוגזם משבש צמתים הדוקים אך עלול לגרום למוות של תאים באותו הזמן. מסיבה זו בדקנו כמה שילובים של מחזורים מחדש השעיה והתקני ניתוק שונים. מצאנו כי השימוש בפיפטה רבה אוטומטית מאפשר הניתוק בתוך 2 יישומים של 99 מחזורים; להחיל לחץ קבוע לתאים וזה יגרום להשעית תא בודדת עם יכולת קיום אופטימלי. יכולות להיות מעורבות ארבעה עד שש דגימות וpipetted באותו הזמן להפחית את הזמן של בידוד תא סטרומה בלוטה לימפה.

ontent "> פרוטוקול העיכול יש לשמור על הביטוי על פני השטח של כמעט כל המולקולות;. רק בדרך זו מכתימה במקביל עם כמה סמנים יכולים לחשוף אם אוכלוסייה היא הומוגנית או הטרוגנית לדוגמא, השימוש בBP-3 וCD35 ב gp38 TRC + CD31 -. מאפשר ההדמיה והבידוד של TRC הלשדי (סנג'יב לותר, תקשורת אישית) יתר על כן, חלק DN גרוע המאופיין התאפיין נוסף כמכיל Aire תאים וpericyte + כמו תאים חיוביים לintegrin α7 (בדיקה ב 7, 13). לכן, הפרוטוקול הנוכחי בהשוואה לאלה שפורסמו. כפי שניתן לראות בתוצאות, תדרים ומספרים של תאי סטרומה בלוטה לימפה דומים התקבלו עם הפרוטוקול הנוכחי בהשוואה לאלה שפורסמו. מעניין, תדירות ומספר TRC המבודד היו באמצעות פרוטוקול פלטשר מציע ניתוק טוב יותר של מבני TRC מאשר בפרוטוקול הנוכחי הגבוהים ביותר ופרוטוקול קישור. יתר על כן, הביטוי של מולקולות פני השטח שונות היה משופר עם הפרוטוקול הנוכחי בהשוואה לפרוטוקול פלטשר. הבדלים אלה בשיטת העיכול עשויים להיות הסיבה לדפוסי ביטוי שונים מעט במחקרי תאי סטרומה הבלוטה לימפה 6,19,21. זה עשוי להיות שימושי כדי לבדוק את פרוטוקולי עיכול שונים בגלל היתרונות של כל פרוטוקול. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות טוב יותר עבור ניתוח ביטוי פני השטח, ואילו פרוטוקול פלטשר עשוי להיות שימושי עבור בידוד של מספרים גבוהים של תאי קיימא לניתוח שעתוק (כפי שפורסם בMalhotra et al. 7). לכן השוואת כל שלושת פרוטוקולי העיכול עשויה להיות חשובה להשגת תוצאות אופטימליות לאחר הבידוד של תאי סטרומה בלוטה לימפה ויש לראותו כמשלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29, (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10, (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200, (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8, (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13, (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192, (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198, (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12, (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12, (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6, (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6, (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21, (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210, (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207, (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32, (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207, (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120, (24), 4772-4782 (2012).
בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter