Introduction
Los ganglios linfáticos son compartimentos especializados donde se inician y coordinan la respuesta inmune adaptativa contra extranjeros y los antígenos propios. El procedimiento presentado aquí describe una digestión enzimática corto combinado con pipeteo automatizado mecánica para obtener los ganglios linfáticos suspensión de células individuales y obtener acceso a las células del estroma de ganglios linfáticos viables que mantienen la expresión en la superficie de varias moléculas.
Células estromales de los ganglios linfáticos forman el andamiaje de los ganglios linfáticos y cumple tres funciones principales: en primer lugar que filtran los fluidos corporales para degustar antígenos, patógenos y sus patógenos asociados patrón molecular (PAMP), así como las citocinas y peligros asociados patrón molecular (apaga) presente en el cuerpo. En segundo lugar, que atraen e instruyen a las células presentadoras de antígeno (APC) y linfocitos de interactuar e iniciar la respuesta inmune adaptativa; y tercero, que proporcionan un entorno estructural para la homeostasis y la diferenciación de los linfocitos 1-3. Durante la inflamación de los ganglios linfáticos células estromales producen factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas, adaptarse a la hinchazón por lo tanto la organización de la interacción entre las células dendríticas (DCs), y células T B-. La orquestación de las respuestas inmunes sólo es posible debido a la compleja arquitectura estructural formada por diferentes poblaciones de células del estroma.
Las células estromales son células de ganglios linfáticos negativos CD45 y se pueden distinguir por la expresión de CD31 o GP38 en las células endoteliales y fibroblásticas 1 -6. GP38 + CD31 - células de la zona T define reticulares (TRC, también conocidos como FRC: células reticulares fibroblásticas), GP38 + CD31 + define células linfáticas endoteliales (LEC), GP38 - CD31 + define las células endoteliales de sangre (BEC). Además, la caracterización de las subpoblaciones reveló la existencia de otras células del estroma de los ganglios linfáticos. De hecho, una pequeña población de células-pericitos se caracterizó como en elGP38 - CD31 - población 7. Por lo tanto, la adaptación del procedimiento de aislamiento es ventajoso para la identificación y caracterización de las propiedades funcionales de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos.
Antes del desarrollo de los ganglios linfáticos digestión células estromales de los protocolos de estudio de las células del estroma de ganglios linfáticos se limita a las observaciones in situ usando sección de tejido y la microscopía. Sin embargo, los estudios estructurales y funcionales mostraron características importantes de las células del estroma de los ganglios linfáticos. Células del estroma de ganglios linfáticos están asociados con podoplanin, colágeno y matriz extracelular (ECM), las proteínas para formar un complejo 3 estructura dimensional llamado sistema de conductos, que transporta las proteínas de los ganglios y de masas moleculares asociados de baja desde el seno subcapsular del ganglio linfático a la alta endotelial vénulas en la zona de las células T 8. Países en desarrollo están en estrecho contacto con las células del estroma y puede observarse que sobresale en el aire tubularestructura de conducto a la muestra de fluido y detectar antígenos 8. La interacción de las células del estroma de ganglios linfáticos (TRC y LEC) con DCS es mediada por la liberación y la presentación de quimiocinas CCL21 y CCL19 9,10. CCL19 y CCL21 son reconocidos por el receptor CCR7 facilitar países en desarrollo y las células T de migrar al ganglio linfático zona de células T 4,11. A pesar de utilizar quimiocinas similares, las células DCs y T tienen diferentes rutas de migración hacia los ganglios linfáticos 12. Más tarde, usando digestión enzimática de los ganglios linfáticos y el aislamiento de las células estromales de ganglios linfáticos puros, se realizaron estudios funcionales sobre el papel de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y de su capacidad para interactuar con los DC y células T / B 6,13. En primer lugar, la diafonía entre IFN-γ que producen células T efectoras y las células del estroma de ganglios linfáticos induce la producción del óxido nítrico metabolito se muestra para amortiguar las respuestas de células T y la proliferación en los órganos linfoides secundarios 14-16. En segundo lugar, la linfa ncélulas estromales ode se han reportado para apoyar la diferenciación de subconjuntos de regulación de corriente continua a través de la producción de IL-10 17, y para modular la homeostasis de las células T naïve a través de la producción de IL-7 6,18. En tercer lugar, la expresión de TLR en las células del estroma de ganglios linfáticos sugiere que las células estromales son susceptibles a la señal derivada de una infección o de auto-moléculas liberado durante la lesión de los tejidos. De hecho, el tratamiento de las células del estroma de los ganglios linfáticos con el ligando de TLR3 poli (I: C) induce un modesto regulación positiva de la expresión principal de histocompatibilidad de clase I y la regulación positiva de la molécula inhibidora de la co-PD-L1, pero no de moléculas coestimuladoras, que resulta en cambios dramáticos en el tejido periférico antígenos expresión 19. Varios grupos han demostrado las células del estroma de los ganglios linfáticos expresan antígenos de tejidos periféricos e inducen la tolerancia de las células T autorreactivas 19,21-27. Por lo tanto, la comprensión de las interacciones entre las células del estroma de los ganglios linfáticos y la otra re migratoria ycélulas de nódulos linfáticos Sident ayudarán a encontrar nuevas moléculas diana para permitir la activación o supresión de las respuestas inmunes durante la inflamación. Por lo tanto, se necesita la aplicación de la separación enzimática publicada del ganglio linfático.
Protocolos previamente publicados utilizan diferentes combinaciones de a base de colagenasa digestión enzimática con menores esfuerzos mecánicos 6,19,20. Sin embargo, las incubaciones largas con las enzimas de fermentación y de la diferente combinación de enzimas de digestión pueden degradar diversas moléculas de la superficie necesaria para analizar el estado de activación y la identificación de nuevas células del estroma de los ganglios linfáticos. Dependiendo del tipo del análisis de células del estroma, el Protocolo de Enlace o protocolo Fletcher podrían ser más adecuado. En el procedimiento descrito, una digestión enzimática ligeramente más corto se combina con desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación del marcador de superficie de los ganglios viable células estromales nodo. Este procedimiento permite el aislamiento y altamente reproducibledistinción de los ganglios linfáticos poblaciones de células del estroma con baja variabilidad y más de 95% de viabilidad. Las células del estroma de ganglios linfáticos recién aisladas se pueden utilizar directamente para la expresión de marcadores de superficie, el análisis de proteínas, y los estudios de la transcripción, así como el establecimiento de líneas de células estromales para llevar a cabo ensayos funcionales in vitro.
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Protocol
En esta publicación de vídeo y el protocolo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con el protocolo de los animales aprobado por la Autoridad Cantonal Basel-Stadt, Suiza.
1. linfa Preparación de nodos y digestión
- Agua Pre-calor en un vaso de precipitados a 37 ° C en un agitador magnético con placa de calentamiento.
- Preparar Básica Media de la siguiente manera: medio DMEM (sin piruvato) suplementado con FCS al 2%, 1,2 mM CaCl 2 y Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 mg de estreptomicina).
- Esterilice todos los instrumentos de disección antes de su uso.
- La eutanasia a los ratones donantes nodo linfático por asfixia con CO2 y asépticamente diseccionar los ganglios linfáticos. No diseccionar la grasa circundante. NOTA: Este protocolo está optimizado para el nodo periférico-el drenaje linfático de la piel (inguinal, braquial, axilar).
- Coloque los ganglios linfáticos en una placa de Petri estéril que contiene 2 ml de hielo frío medio básico.
- Interrumpir el ca ganglio linfáticopsule usando dos agujas 25 G fijos en 1 ml jeringa.
- Transferir el tejido del ganglio linfático alterado en un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 750 l medio básico suplementado con 1 mg / ml de colagenasa IV y 40 mg / ml de DNAsa I.
- Añadir un agitador magnético estéril en cada tubo.
- Colocar el tubo en el vaso de precipitados con 37 ° C precalienta el agua y agitar los tubos a una velocidad lenta (1 ronda / seg) durante 30 min.
- Retire el tubo del agitador magnético con placa calefactora y dejar fragmentos de ganglios linfáticos se asientan.
- Retire con cuidado el sobrenadante enriquecido en "células no estromal". NOTA: Si el análisis de T, B, células dendríticas y CD45 - GP38 - CD31 - se prevé, guarde el "no-células estromales" fracción.
- Lave restante tejido de los ganglios linfáticos una vez con 750 l medio básico. NOTA: Este paso sólo es necesario si se trabaja con ratones inmunocompetentes.
- Deje que los fragmentos de los ganglios linfáticos se asientan.
- Quite elfracción de células flotantes no estromal.
- Añadir a los fragmentos de los ganglios linfáticos medio básico suplementado con 750 l 3,5 mg / ml de colagenasa D y 40 mg / ml de DNasa I.
- Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados que contiene el 37 ° C precalentado agua.
- Digerir el tejido de los ganglios linfáticos durante 5 minutos mientras se agitaba lentamente.
- Ganglios fragmentos de tejido nodo desagregados por pipeteo y la mezcla de 700 l para 10 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado. NOTA: Esto altera el tejido del ganglio linfático para mejorar la digestión.
- Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados con 37 ° C el agua precalentado.
- Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos Digest durante otros 10 minutos, mientras que poco a poco revolviendo.
- Desglosar los fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos con la pipeta y mezclar durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizada.
- Añadir 7,5 l de 0,5 M EDTA para asegurar el mantenimiento de la suspensión de células individuales.
- Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos desagregados por tuberíatting y mezclando durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado.
- Añadir medio básico 750 l y pasar las células a través de una malla de nylon 70 micras.
- Se centrifuga la suspensión celular 5 min a 1500 × g, 4 ° C.
- Las células estromales se pueden utilizar ahora para su posterior análisis.
2. La tinción de células de ganglio linfático estromales
- Use una combinación de anti-CD45, anti-podoplanin (GP38), los anticuerpos anti-CD31 para reconocer con éxito las células TRC, LEC, BEC y DN.
- Incubar el tejido del ganglio linfático digerido con vivo rastreador / Dead, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-GP38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) en 100 l de HBSS que contiene 2 % de FCS durante al menos 20 min, 4 ° C, en la oscuridad.
- Lavar las células añadiendo 500 l de HBSS que contenía 2% de FCS
- Se centrifuga la suspensión celular 3 min a 1500 × g, 4 ° C.
- Vuelva a suspender en 100 l de HBSS que contenía 2% de FCS.
- Ejecute las células teñidas en un citómetro de flujo equipped con las siguientes óptica: fuente de excitación con hasta tres láseres: azul (488 nm, enfriado por aire, 20 mW de estado sólido), rojo (633 nm, 17 mW HeNe), y violeta (405 nm, 30 mW estado sólido) .
- Puerta de CD45 - células para excluir las células hematopoyéticas.
- Interiores de puertas (FSC-W) y células vivas (live / perseguidor DEAD) para excluir dobletes y células muertas.
- Terreno GP38 contra CD31 para visualizar TRC (GP38 + CD31 -), LEC (GP38 + CD31 +), BEC (GP38 - CD31 +) células (véase la figura 1) y DN (GP38 - - CD31).
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Representative Results
El presente protocolo es un protocolo de digestión modificado publicado por Link et al., 2007 6 con un tiempo de digestión más corto (45 min máximo) debido a la disgregación mecánica con una pipeta multicanal automatizada. Además, el procedimiento es más uniforme, minimiza la degradación de marcadores de superficie en diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y permite la manipulación de más de una muestra a la vez.
La colagenasa IV y colagenasa D en Enlaces de protocolo 6 y protocolo actual o colagenasa P y Dispasa en protocolo Fletchers 13 mantienen linfático estromal nodo viabilidad de las células y piezas de la digestión de varios marcadores de superficie incluyendo CD45, CD31 y GP38. Para probar se retiraron los nodos de protocolo, axilares, braquial y los ganglios inguinales actuales y digeridos para aislar sus células del estroma. Análisis de CD45, CD31 y GP38 expresión demostró la presencia de células TRC, LEC, BEC y DN aisladas de ratones C57BL / 6 mhielo (Figura 1, la estrategia de activación periódica).
La tensión mecánica puede reducir la viabilidad de las células del estroma de nodo de linfa durante la digestión. La comparación de la viabilidad de las subpoblaciones de aislados de las células del estroma utilizando los tres protocolos diferentes, se encontró que la viabilidad fue superior al 95% en el protocolo Fletcher, pero menor tanto para el protocolo actual y el protocolo de enlace (Figura 2A), aunque muestran protocolo actual mejor supervivencia en la subpoblación BEC entonces Enlace con protocolo. El número total de células se recuperó después de digestión de los ganglios linfáticos subconjuntos de células del estroma fue ligeramente superior en protocolo Actual y el protocolo de enlace y protocolo Fletcher (Figura 2A). Estos resultados demuestran que el protocolo actual mantiene la viabilidad de las células estromales de ganglios linfáticos similares a los protocolos publicados. Las principales diferencias entre los tres protocolos se enumeran en la Tabla 1.
Marcadores de la superficie de un re necesaria para caracterizar nódulos células estromales nodo por citometría de flujo y aislarlos mediante clasificación celular. TRC y los LEC aislados a través de actual, los protocolos de enlace y Fletcher se compararon para IA b, CD140a, CD80, PD-L1 y la expresión de CD40. Después de aislar las células del estroma de los tres protocolos, encontramos la expresión de IA b, CD80, CD140a, PD-L1, y CD40 fue mayor tras la digestión con CP y LP en ambos TRC y LEC (Figura 2B). Estos resultados sugieren que la degradación de algunas moléculas de la superficie con colagenasa IV y D son menos fuertes que con colagenasa P y dispasa.
Tomados en conjunto, el protocolo actual incluye una digestión corto combinado con desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación del marcador de superficie de los ganglios viable células estromales nodo.
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Fueron digeridos Figura 1. TRC, la tinción de células LEC, BEC, y DN, de compuerta y de cuantificación. Ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6 siguiendo el protocolo actual y teñidas con CD45, CD31 y GP38, Live / Dead definir TRC, LEC, BEC, y DN células por citometría de flujo. Los datos muestran resultados representativos de la tinción. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Fueron digeridos Figura 2. Viabilidad y la superficie marcador expresión de las células del estroma de los ganglios linfáticos. Los ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6 después de la actual (CP), de (LP) de protocolo de Fletcher (FP) y se tiñeron con CD45, GP38 y CD31 Link y para definir células TRC, LEC, BEC y DN por citometría de flujo. A) Viabildad y el número total de células de todas las subpoblaciones de células del estroma nodo linfático después de tinción Live / Dead (n ≥ 5, los datos combinados de 2 experimentos independientes, barras representan SEM). B) Análisis de la expresión superficial de IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) y CD40 (PE-Cy7) en los TRC y LEC (n = 6 para FP y n = 11 para LP y CP , los datos combinados de 2 experimentos independientes, barras representan SEM). Valores geométricos IMF auto-fluorescencia para LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82.5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
| Actual Protocolo-Enzimas | -Protocolo actual | Enlace de protocolo-enzimas | Link-protocolo | FProtocolo-enzimas Letcher | Fletcher-protocolo |
| La colagenasa IV, ADNasa I | 30 min, 37 ° C, agitación | La colagenasa IV, DNAsa I | 30 min, 37 ° C | La colagenasa P, dispasa, DNAsa I | 20 min, 37 ° C, invertir cada 5 min |
| La colagenasa D, ADNasa I | 5 min, 37 ° C, agitación, resuspender | La colagenasa D, DNAsa I | 20 min, 37 ° C | La colagenasa P, dispasa, DNAsa I | 10 min, 37 ° C, 30 seg resuspender |
| 10 min, 37 ° C, agitación | La colagenasa D, DNAsa I | 37 ° C, resuspender cada 10 min hasta que la digestión completa | La colagenasa P, dispasa, DNAsa I | 37 ° C, resuspender cada 5 min hasta que la digestión completa | |
| resuspensión mecánica automatizada |
Tabla 1. resúmenes cortos de CP, LP, enzimas FP utilizados y los protocolos.
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Discussion
El estudio de las células del estroma de los ganglios linfáticos se convirtió recientemente en un foco de investigación, debido al desarrollo de dos protocolos de digestión publicados 6,13. Ambos protocolos son adecuados para obtener las células del estroma sola ganglios nodo, pero difieren en el uso de enzimas de digestión y el tiempo de digestión. Dado que las células estromales y sus marcadores de superficie son sensibles a la digestión enzimática y la tensión mecánica, se requiere un protocolo optimizado.
El aislamiento de células del estroma de los ganglios linfáticos viables desde el nodo linfático recién diseccionado es el primer paso para realizar fenotípica y análisis funcional. Por lo tanto, es importante para digerir cuidadosamente con la concentración definida de las enzimas, a una temperatura estable y durante el tiempo indicado. Dos protocolos de digestión se han descrito 6,13, sin embargo con los pasos de digestión más largos. Para reducir el tiempo de la digestión, la desagregación mecánica estaba incluido y estandarizada utilizando una pipeta multicanal. En e de las ventajas del protocolo actual es que permite el aislamiento de las células estromales en sólo 45 min, por lo tanto minimizar su tiempo de incubación con las enzimas de digestión. Además, agitación constante durante la digestión permite el acceso óptimo de las enzimas de digestión a la estructura de los ganglios linfáticos. Además, el volumen se redujo a la digestión 750 l minimizando la cantidad de enzima utilizada.
Fuerza mecánica excesiva altera las uniones estrechas, pero podría causar la muerte celular al mismo tiempo. Por esta razón hemos probado varias combinaciones de ciclos de re-suspensión y diferentes dispositivos de disociación. Hemos encontrado que el uso de una pipeta multicanal automatizado permite la disociación dentro de 2 aplicaciones de 99 ciclos; aplicar una presión constante a las células y esto resultará en suspensión de células individuales con la viabilidad óptima. De cuatro a seis muestras se pueden mezclar y se pipetearon al mismo tiempo, reduciendo el tiempo de los ganglios linfáticos de aislamiento de células del estroma.
ontenido "> El protocolo de la digestión tiene que mantener la expresión en la superficie de casi todas las moléculas;. sólo de esta manera la tinción concomitante con varios marcadores puede revelar si una población es homogénea o heterogénea Por ejemplo, el uso de BP-3 y CD35 en el TRC GP38 + CD31 -. permite la visualización y el aislamiento de medular TRC (Sanjiv Luther, comunicación personal) Además, la fracción DN mal caracterizado fue caracterizado además como que contiene células Aire + y pericitos como células positivas para la integrina α7 (revisado en 7, 13). Por lo tanto, el presente protocolo se comparó con los publicados. Como se muestra en los resultados, las frecuencias y el número de células del estroma de ganglios linfáticos similares se obtuvieron con el protocolo actual en comparación con los publicados. Curiosamente, frecuencia y número de aislados TRC fueron más altos con el protocolo Fletcher sugiriendo una mejor disociación de las estructuras de la CVR que en el protocolo actual yProtocolo de enlace. Además, la expresión de varias moléculas de la superficie se ha mejorado con el protocolo actual en comparación con el protocolo Fletcher. Estas diferencias en el método de digestión podría ser la razón para ligeramente diferentes patrones de expresión en el ganglio linfático estudios de células del estroma 6,19,21. Podría ser útil para probar diferentes protocolos de digestión a causa de las ventajas de cada protocolo. El protocolo actual podría ser mejor para el análisis de expresión de la superficie, mientras que el protocolo Fletcher podría ser útil para el aislamiento de un gran número de células viables para el análisis de la transcripción (como se publicó en Malhotra et al. 7). Por lo tanto, la comparación de los tres protocolos de digestión puede ser importante para obtener resultados óptimos después del aislamiento de las células del estroma de los ganglios linfáticos y debe ser visto como complementario.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| Stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyrene round bottom tubes 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petri dishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25 G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
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