Introduction
الغدد الليمفاوية هي مقصورات المتخصصة حيث بدأت الاستجابات المناعية التكيفية ضد المستضدات الذاتية والخارجية ومنسقة. الإجراء المقدمة هنا يصف الهضم الأنزيمي قصيرة جنبا إلى جنب مع pipetting لالميكانيكي الآلي للحصول على العقدة اللمفاوية وحيدة الخلية تعليق والوصول إلى خلايا انسجة العقدة الليمفاوية قابلة للحياة التي تحافظ على التعبير السطح العديد من الجزيئات.
الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية تشكل سقالة من العقدة الليمفاوية والوفاء ثلاث وظائف رئيسية: أولا أنها تصفية سوائل الجسم لأخذ عينات المستضدات، ومسببات الأمراض والعوامل المسببة للأمراض المرتبطة نمط الجزيئية الخاصة بهم (PAMPs)، وكذلك السيتوكينات والخطر المرتبطة نمط الجزيئية (DAMPs) الحاضر في الجسم. ثانيا، جذب وإرشاد مستضد تقديم الخلايا (APC) والخلايا الليمفاوية للتفاعل والشروع في الاستجابات المناعية التكيفية. وثالثا، لأنها توفر بيئة الهيكلية للتوازن وتمايز الخلايا الليمفاوية 1-3. أثناء التهاب خلايا العقدة الليمفاوية انسجة تنتج عوامل النمو، السيتوكينات وكيموكينات، والتكيف مع تورم وبالتالي تنظيم التفاعل بين الخلايا الجذعية (DCS)، تي وخلايا ب. تزامن الاستجابات المناعية ممكن فقط بسبب بنية الهيكلية المعقدة التي شكلتها مختلف السكان الخلية اللحمية.
خلايا انسجة العقدة الليمفاوية هي خلايا CD45 السلبية ويمكن تمييزها عن طريق التعبير عن CD31 أو gp38 في خلايا ليفية والبطانية 1 -6. Gp38 + CD31 - يحدد خلايا T منطقة شبكي (TRC، والتي تعرف أيضا باسم FRC: خلايا الشبكية ليفية)، gp38 + CD31 + الخلايا الليمفاوية يعرف البطانية (كرا)، gp38 - CD31 + يحدد الخلايا البطانية في الدم (BEC). علاوة على ذلك، توصيف المجموعات السكانية الفرعية وكشف وجود خلايا انسجة العقدة الليمفاوية الأخرى. في الواقع، واتسم عدد صغير من السكان خلية تشبه خلية حوطية داخلgp38 - CD31 - السكان 7. لذا، والتكيف من إجراء العزل هو مفيد لتحديد وتوصيف خصائص وظيفية مختلفة من خلايا انسجة العقدة الليمفاوية.
قبل وضع العقدة الليمفاوية خلايا انسجة الهضم البروتوكولات دراسة خلايا انسجة العقدة الليمفاوية اقتصر على الرصدات في الموقع باستخدام قسم الأنسجة والفحص المجهري. ومع ذلك، أظهرت الدراسات البنيوية والوظيفية الخصائص المهمة للخلايا انسجة العقدة الليمفاوية. وترتبط خلايا انسجة العقدة الليمفاوية مع podoplanin، والكولاجين والمصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات لتشكيل بنية معقدة 3 الأبعاد يسمى نظام القناة الذي ينقل الليمفاوية وما يرتبط بها منخفضة الكتلة الجزيئية البروتينات من الجيوب تحت المحفظة من العقدة الليمفاوية إلى البطانية عالية الأوردة في منطقة خلايا T 8. البلدان النامية على اتصال وثيق مع خلايا سدى ويمكن ملاحظة جاحظ في يخدع أنبوبيهيكل duit لأخذ عينات السوائل وكشف المستضدات 8. وبوساطة تفاعل خلايا انسجة العقدة الليمفاوية (TRCS وموظفين المدنيين المحليين) مع البلدان النامية من خلال الإفراج وعرض كيموكينات CCL21 و CCL19 9،10. يتم الاعتراف CCL19 وCCL21 بواسطة مستقبلات CCR7 تسهيل البلدان النامية والخلايا T للهجرة إلى منطقة العقدة الليمفاوية الخلية T 4،11. على الرغم من استخدام كيموكينات مماثلة، وخلايا T البلدان النامية ولها طرق الهجرة المختلفة في الغدد الليمفاوية 12. في وقت لاحق، وذلك باستخدام الهضم الأنزيمي من العقدة الليمفاوية وعزل الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية نقية، وأجريت دراسات وظيفية على دور مختلف خلايا العقدة الليمفاوية اللحمية وقدرتها على التفاعل مع البلدان النامية وخلايا T / B 6،13. أولا، الحديث المتبادل بين IFN-γ إنتاج خلايا T المستجيب والخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية الحث على إنتاج أكسيد النيتريك المستقلب تبين أن يثبط استجابات الخلايا T والانتشار في أجهزة اللمفاوية الثانوية 14-16. ثانيا، الليمفاوية نوقد تم الإبلاغ عن خلايا انسجة صدى لدعم التفريق بين مجموعات فرعية DC التنظيمية عبر إنتاج IL-10 17، والسذاجة لتعديل توازن الخلايا التائية عبر إنتاج IL-7 6،18. ثالثا، TLR التعبير في خلايا انسجة العقدة الليمفاوية تشير إلى أن خلايا انسجة عرضة للإشارة مشتقة من عدوى أو الجزيئات الذاتية صدر خلال إصابة الأنسجة. والواقع أن علاج الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية مع يجند من TLR3 بولي (I: C) يؤدي الى upregulation متواضع من التوافق النسيجي الرئيسي التعبير الدرجة الأولى ومعقدة upregulation المشترك المثبطة جزيء PD-L1، ولكن ليس من الجزيئات costimulatory، مما أدى إلى تغييرات جذرية في الأنسجة الطرفية مستضدات التعبير 19. وقد أظهرت عدة مجموعات خلايا انسجة العقدة الليمفاوية التعبير عن مستضدات الأنسجة الطرفية وتحفز التسامح من ذاتية التفاعل خلايا T 19،21-27. لذا، فهم التفاعلات بين الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية وغيرها من إعادة المهاجرة وسوف المنشقة خلايا العقدة اللمفاوية يساعد على إيجاد الجزيئات المستهدفة الجديدة للسماح تفعيل أو قمع الاستجابات المناعية أثناء الالتهاب. ولذلك، هناك حاجة إلى تنفيذ الفصل الأنزيمية نشرت من العقدة الليمفاوية.
البروتوكولات نشرت سابقا استخدام تركيبات مختلفة من القائم كولاجيناز الأنزيمية الهضم مع انخفاض الضغط الميكانيكي 6،19،20. ومع ذلك، حضانات طويلة مع إنزيمات الهضم أو مزيج مختلف من انزيم الهضم قد تتحلل مختلف الجزيئات السطحية اللازمة لتحليل حالة التنشيط وتحديد خلايا انسجة العقدة الليمفاوية جديدة. اعتمادا على نوع من التحليل الخلايا اللحمية، وبروتوكول وصلة أو بروتوكول فليتشر قد يكون أكثر ملاءمة. في الإجراء وصفها، يتم الجمع بين الهضم الأنزيمي أقصر قليلا مع تصنيف الميكانيكي الآلي للحد من تدهور سطح علامة قابلة للحياة الخلايا الليمفاوية من عقدة اللحمية. يتيح هذا الإجراء العزلة استنساخه للغاية وتمييز من العقدة الليمفاوية السكان الخلية اللحمية مع تقلب منخفض وأكثر من 95٪ جدوى. الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية المعزولة حديثا يمكن استخدامها مباشرة للتعبير عن علامة السطح، وتحليل البروتين، والدراسات النسخي، وكذلك إنشاء خطوط خلايا انسجة لإجراء المقايسات الفنية في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذا المنشور الفيديو والبروتوكول، وأجريت كافة الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول الحيوانية التي وافقت عليها السلطة كانتون بازل شتات، سويسرا.
1. إعداد العقد الليمفاوية والهضم
- الماء قبل الحرارة في كوب إلى 37 درجة مئوية على النمام المغناطيسي مع لوحة التدفئة.
- إعداد المتوسطة الأساسية على النحو التالي: DMEM المتوسطة (دون البيروفات) تستكمل مع FCS 2٪، 1.2 مم CaCl 2 و القلم / بكتيريا (100 وحدة من البنسلين، 100 ميكروغرام من الستربتومايسين).
- تعقيم جميع الأدوات تشريح قبل الاستخدام.
- الموت ببطء الفئران العقدة الليمفاوية المانحة في CO 2 الخنق وجو معقم و مطهر تشريح الغدد الليمفاوية. لا تشريح الدهون المحيطة بها. ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للالطرفية عقدة تجفيف الجلد الليمفاوية (الاربية، العضدية، الإبطين).
- وضع الغدد الليمفاوية في طبق بتري معقمة تحتوي على 2 مل الجليد المتوسطة الأساسي البارد.
- تعطيل كاليفورنيا العقدة الليمفاويةpsule باستخدام اثنين من الإبر 25 G ثابتة على 1 مل حقنة.
- نقل الأنسجة العقدة الليمفاوية تعطلت في 5 مل البولي بروبلين أنبوب الجولة القاع تحتوي على 750 ميكرولتر المتوسطة الأساسي تستكمل مع 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع و 40 ميكروغرام / مل الدناز I.
- إضافة واحد النمام المغناطيسي معقمة في كل أنبوب.
- مكان أنبوب في الدورق مع 37 ° C مسخن الماء ويقلب الأنابيب بمعدل بطيء (1 الجولة / ثانية) لمدة 30 دقيقة.
- إزالة أنبوب من النمام المغناطيسي مع لوحة التدفئة وترك شظايا العقدة الليمفاوية تسوية.
- إزالة بعناية طاف المخصب في "خلية غير اللحمية". ملاحظة: إذا كان تحليل T، B، والخلايا الجذعية وCD45 - gp38 - CD31 - ومن المتوقع، حفظ "الخلايا غير اللحمية" الكسر.
- غسل الأنسجة المتبقية العقدة الليمفاوية مرة واحدة مع 750 ميكرولتر المتوسطة الأساسي. ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية إلا إذا كان يعمل مع الفئران محصنة الحكومية المختصة.
- السماح شظايا العقدة الليمفاوية تسوية.
- إزالةغير اللحمية جزء العائمة الخلية.
- أضف إلى شظايا العقدة الليمفاوية 750 ميكرولتر المتوسطة الأساسي تستكمل مع 3.5 ملغ / مل كولاجيناز D و 40 ميكروغرام / مل الدناز I.
- مكان أنبوب مرة أخرى في الكأس الذي يحتوي على 37 ° C مسخن الماء.
- هضم الأنسجة الليمفاوية عقدة لمدة 5 دقائق مع التحريك ببطء.
- تفصيل الأنسجة الليمفاوية شظايا عقدة من قبل pipetting والاختلاط 700 ميكرولتر لمدة 10 دورات في السرعة القصوى باستخدام ماصة الأقنية الآلي. ملاحظة: هذه الأنسجة الليمفاوية يعطل عقدة لتحسين الهضم.
- وضع أنبوب مرة أخرى في الكأس مع 37 درجة مئوية الماء مسخن.
- هضم الأنسجة شظايا العقدة الليمفاوية لمدة 10 دقيقة مع التحريك ببطء.
- تفصيل الأنسجة الليمفاوية شظايا عقدة من قبل pipetting وخلط لمدة 99 دورات في السرعة القصوى باستخدام ماصة الأقنية الآلي.
- إضافة 7.5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA لضمان الحفاظ على تعليق خلية واحدة.
- تفصيل شظايا الأنسجة العقدة الليمفاوية بواسطة الأنابيبtting وخلط لمدة 99 دورات في السرعة القصوى باستخدام ماصة الأقنية الآلي.
- إضافة 750 ميكرولتر المتوسطة الأساسي وتمر الخلايا من خلال شبكة من النايلون 70 ميكرون.
- الطرد المركزي تعليق خلية 5 دقائق عند 1،500 x ج، 4 درجات مئوية.
- ويمكن الآن أن تستخدم خلايا انسجة لمزيد من التحليل.
2. تلون الخلايا الليمفاوية عقدة اللحمية
- استخدام مزيج من مكافحة CD45، ومكافحة podoplanin (gp38)، والأجسام المضادة لمكافحة CD31 التعرف على الخلايا TRC، بكا، BEC وDN بنجاح.
- احتضان هضمها العقدة الليمفاوية الأنسجة مع لايف / تعقب الميت، ومكافحة CD45-FITC (1: 200)، ومكافحة gp38-PE (1: 200)، ومكافحة CD31-APC (1: 200) في 100 ميكرولتر HBSS تحتوي على 2 FCS٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل، 4 درجات مئوية، في الظلام.
- غسل الخلايا بإضافة 500 لتر من HBSS تحتوي على 2٪ FCS
- الطرد المركزي تعليق خلية 3 دقيقة في 1500 x ج، 4 درجات مئوية.
- إعادة تعليق في 100 ميكرولتر من HBSS تحتوي على 2٪ FCS.
- تشغيل الخلايا الملون في تدفق عداد الكريات تجهيز المنطقةإد مع البصريات التالية: مصدر الإثارة مع ما يصل الى ثلاثة أجهزة الليزر: الأزرق (488 نانومتر، وتبريد الهواء، و 20 ميغاواط الحالة الصلبة)، الحمراء (633 نانومتر، 17 ميغاواط الحنة)، والبنفسجي (405 نانومتر، 30 ميغاواط الحالة الصلبة) .
- بوابة CD45 - خلايا لاستبعاد الخلايا المكونة للدم.
- singlets بوابة (FSC-W) والخلايا الحية (لايف / تعقب الميت) لاستبعاد الحلل والخلايا الميتة.
- مؤامرة gp38 مقابل CD31 لتصور TRC (gp38 + CD31 -)، كرا (gp38 + CD31 +)، BEC (gp38 - CD31 +) وDN (gp38 - CD31 -) الخلايا (انظر الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول هو بروتوكول الهضم تعديل نشرتها رابط وآخرون، 2007 6 مع أقصر وقت الهضم (45 دقيقة كحد أقصى) بسبب التقسيم الميكانيكية مع ماصة الأقنية الآلي. بالإضافة إلى ذلك، هذا الإجراء هو أكثر توحيدا، ويقلل من تدهور علامات على سطح خلايا انسجة مختلفة العقدة الليمفاوية ويسمح التعامل مع عينة أكثر من واحد في نفس الوقت.
كولاجيناز الرابع وكولاجيناز D سريعة في البروتوكول 6 و البروتوكول الحالي أو كولاجيناز P وDispase في Fletchers بروتوكول 13 عقدة الليمفاوية الحفاظ على انسجة خلايا حيوية وقطع هضم العديد من علامات السطحية بما في ذلك CD45، CD31 gp38 و. لاختبار أزيلت البروتوكول، الإبطين، العضدية والعقد الليمفاوية الأربية الحالية واستيعاب لعزل خلايا انسجة بهم. أظهر تحليل CD45، CD31 gp38 والتعبير وجود TRC، بكا، BEC وDN خلايا معزولة من C57BL / 6 مالجليد (الشكل 1، واستراتيجية النابضة).
إجهاد قد يقلل من قابلية الخلايا الليمفاوية عقدة اللحمية أثناء عملية الهضم. مقارنة بقاء مجموعات سكانية فرعية معزولة من خلايا انسجة باستخدام البروتوكولات الثلاثة المختلفة، تبين أن الجدوى كانت أعلى من 95٪ في بروتوكول فليتشر، ولكن أقل لكل من البروتوكول الحالي وبروتوكول وصلة (الشكل 2A)، على الرغم من إظهار البروتوكول الحالي أفضل البقاء على قيد الحياة في BEC حيوانية ثم ربط البروتوكول. انتشال عدد مجموع الخلايا آخر هضم العقدة الليمفاوية خلايا انسجة مجموعات فرعية كان اعلى بشكل طفيف في البروتوكول الحالي مقارنة بروتوكول رابط وفليتشر بروتوكول (الشكل 2A). وتظهر هذه النتائج أن البروتوكول الحالي يحافظ على سلامة خلايا انسجة العقدة الليمفاوية تشبه بروتوكولات المنشورة. يتم سرد الاختلافات الرئيسية بين البروتوكولات الثلاثة في الجدول 1.
علامات سطح إعادة المطلوبة لتوصيف العقدة الليمفاوية خلايا انسجة التدفق الخلوي وعزلهم من قبل الفرز الخلية. الهلال الأحمر التركي وموظفين المدنيين المحليين عن طريق عزل الحالي، وتمت مقارنة رابط فليتشر وبروتوكولات لب IA، CD140a، CD80، PD-L1 وCD40 التعبير. بعد عزل الخلايا اللحمية جميع البروتوكولات الثلاثة، وجدنا التعبير عن IA ب، CD80، CD140a، PD-L1، CD40 وكان اعلى بناء على الهضم مع CP وLP في كل من الهلال الأحمر التركي وموظفين المدنيين المحليين (الشكل 2B). هذه النتائج تشير إلى أن تدهور بعض جزيئات السطح مع كولاجيناز الرابع وD هم أقل من القوي مع كولاجيناز P وDispase.
أخذت معا، يتضمن البروتوكول الحالي الهضم قصيرة جنبا إلى جنب مع تفصيل الآلي الميكانيكي لتقليل سطح تدهور علامة قابلة للحياة الخلايا الليمفاوية من عقدة اللحمية.
"/>
تم هضمها الرقم 1. العقد TRC، وخلايا كرا، BEC، وتلطيخ DN، النابضة، وتقدير. الليمفاوية من C57BL / 6 الفئران بعد بروتوكول الحالي وملطخة CD45، CD31 وgp38، يعيش / الميت لتحديد TRC، بكا، BEC، وDN الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. وتظهر بيانات النتائج ممثلة للتلطيخ. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.
تم هضمها الشكل 2. الجدوى والسطحية علامة التعبير عن خلايا انسجة العقدة الليمفاوية. العقد الليمفاوية من C57BL / 6 الفئران في أعقاب الحالي (CP)، لينك (LP) وبروتوكول فليتشر (FP) وملطخة CD45، gp38 وCD31 لتحديد TRC، بكا، BEC وDN الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. A) Viabilإيتي وإجمالي عدد الخلايا من جميع المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الليمفاوية عقدة اللحمية بعد لايف / تلطيخ الميت (ن ≥ 5، البيانات المجمعة من 2 تجارب مستقلة والحانات تمثل SEM). B) تحليل التعبير سطح IA ب (APC-Cy7)، CD140a (PerCP-Cy5.5)، CD80 (PerCP-Cy5.5)، PD-L1 (PE-Cy7) و CD40 (PE-Cy7) على TRCS وموظفين المدنيين المحليين (ن = 6 لFP و n = 11 ليرة لبنانية وCP والبيانات المجمعة من 2 تجارب مستقلة والحانات تمثل SEM). الهندسية لصناعة السيارات في مؤسسات التمويل الأصغر القيم مضان لLEC-APC-Cy7: 324 ± 97، كرا-PECy7: 163 ± 82.5، كرا-PerCpCy5.5: 156 ± 36، TRC-APC-Cy7: 349 ± 152، TRC-PECy7: 117 ± 54، TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| بروتوكول الحالي، الانزيمات | -البروتوكول الحالي | -الانزيمات بروتوكول صلة | الارتباط بروتوكول | Fبروتوكول تشر]-الانزيمات | فليتشر-البروتوكول |
| كولاجيناز الرابع، الدناز I | 30 دقيقة، 37 ° C، التحريك | كولاجيناز الرابع، أنا الدناز | 30 دقيقة، 37 ° C | كولاجيناز P، Dispase، أنا الدناز | 20 دقيقة، 37 ° C، عكس كل 5 دقائق |
| كولاجيناز D، أنا الدناز | 5 دقائق، 37 ° C، واثارة، في resuspend | كولاجيناز D، أنا الدناز | 20 دقيقة، 37 ° C | كولاجيناز P، Dispase، أنا الدناز | 10 دقيقة، 37 ° C، و resuspend 30 ثانية |
| 10 دقيقة، 37 ° C، التحريك | كولاجيناز D، أنا الدناز | 37 درجة مئوية، و resuspend كل 10 دقيقة حتى الهضم الكامل | كولاجيناز P، Dispase، أنا الدناز | 37 درجة مئوية، و resuspend كل 5 دقائق حتى الهضم الكامل | |
| إعادة تعليق الميكانيكي الآلي |
الجدول 1. ملخصات قصيرة من CP، LP، FP الإنزيمات المستخدمة والبروتوكولات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
دراسة خلايا انسجة العقدة الليمفاوية أصبحت في الآونة الأخيرة التركيز على البحوث نظرا لتطوير بروتوكولين الهضم نشرت 6،13. كلا البروتوكولين كافية للحصول على الخلايا الليمفاوية واحد العقدة انسجة ولكنها تختلف في استخدام إنزيمات الهضم ووقت الهضم. منذ خلايا انسجة وعلامات سطحها حساسة للالهضم الأنزيمي والإجهاد الميكانيكي، مطلوب بروتوكول الأمثل.
عزل خلايا العقدة الليمفاوية انسجة قابلة للحياة من تشريح العقدة الليمفاوية حديثا هي الخطوة الأولى من أجل أداء المظهرية والتحليل الوظيفي. لذا، من المهم لهضم بعناية مع تركيز محددة من الانزيمات، وعند درجة حرارة مستقرة وللمرة المشار إليه. وقد وصفت بروتوكولين الهضم 6،13، ولكن مع الخطوات الهضم طويلة نوعا ما. لتقليل الوقت الهضم، أدرج تفصيل الميكانيكية وموحدة باستخدام ماصة الأقنية. على (ه) من مزايا البروتوكول الحالي هو أنه يتيح عزل الخلايا اللحمية في 45 دقيقة فقط، وبالتالي تقليل فترة حضانة مع إنزيمات الهضم. بالإضافة إلى ذلك، التحريك المستمر أثناء عملية الهضم يتيح الوصول الأمثل للأنزيمات الهضم إلى بنية العقدة الليمفاوية. وعلاوة على ذلك، تم تخفيض حجم الهضم إلى 750 ميكرولتر التقليل من كمية الإنزيم المستخدم.
قوة ميكانيكية المفرطة يعطل منعطفات ضيقة، ولكنها قد تسبب موت الخلايا في نفس الوقت. لهذا السبب نحن اختبار عدة مجموعات من دورات اعادة تعليق والأجهزة التفكك مختلفة. وجدنا أن استخدام وسيلة ماصة الأقنية الآلي يسمح التفكك داخل التطبيقات 2 من 99 دورات. تطبيق الضغط المستمر للخلايا، وهذا سوف يؤدي إلى تعليق خلية واحدة مع بقاء الأمثل. أربع إلى ست عينات يمكن أن تكون مختلطة وpipetted في نفس الوقت تقليل الوقت من العقدة الليمفاوية عزل الخلايا اللحمية.
ontent "> بروتوكول الهضم لديه للحفاظ على التعبير عن سطح جزيئات تقريبا؛ فقط بهذه الطريقة تلطيخ يصاحب ذلك مع عدة علامات يمكن أن تكشف ما إذا كان السكان غير متجانسة أو غير متجانسة على سبيل المثال، استخدام BP-3 و CD35 في TRC gp38 + CD31 - يسمح التصور وعزل النخاعية TRC (سانجيف لوثر، اتصال شخصي) وعلاوة على ذلك، اتسمت DN جزء سيئة تتميز المزيد كما تحتوي اير + الخلايا وخلية حوطية مثل خلايا إيجابية لإنتغرين α7 (مراجعة في 7، 13). لذلك، تمت مقارنة هذا البروتوكول لتلك التي تم نشرها. كما هو مبين في النتائج، الترددات وأعداد خلايا انسجة العقدة الليمفاوية مماثلة تم الحصول عليها مع البروتوكول الحالي مقارنة مع تلك التي تم نشرها. ومن المثير للاهتمام، وتردد عدد من معزولة TRC كانت أعلى باستخدام بروتوكول فليتشر مما يشير إلى التفكك أفضل من الهياكل TRC مما كانت عليه في البروتوكول الحالي وبروتوكول الارتباط. وعلاوة على ذلك، تم تعزيز التعبير عن مختلف جزيئات السطح مع البروتوكول الحالي مقارنة بروتوكول فليتشر. هذه الاختلافات في طريقة الهضم قد يكون السبب وراء أنماط التعبير المختلفة قليلا في العقدة اللمفاوية خلايا انسجة دراسات 6،19،21. قد يكون من المفيد لاختبار بروتوكولات مختلفة الهضم لأن من مزايا كل بروتوكول. قد يكون البروتوكول الحالي أفضل لتحليل التعبير السطح، بينما بروتوكول فليتشر قد يكون مفيدا لعزل أعداد كبيرة من خلايا قابلة للحياة لتحليل النسخ (كما نشرت في مالهوترا وآخرون. 7). ولمقارنة جميع البروتوكولات الهضم ثلاثة قد يكون من المهم للحصول على أفضل النتائج بعد عزل الخلايا اللحمية العقدة الليمفاوية، وينبغي أن ينظر إليه باعتباره مكملا.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| Stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyrene round bottom tubes 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petri dishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25 G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
