Introduction
淋巴结有专门的隔间，其中对外国和自身抗原的适应性免疫应答发起和协调。这里介绍的过程描述很短的酶消化结合机械式自动移液获得淋巴结单细胞悬液，并获得可行的淋巴结基质细胞的维持几个分子的表面表达。
淋巴结基质细胞形成淋巴结的支架，履行三大职能：第一，他们筛选体液样品抗原，病原体及其病原相关分子模式（的PAMP），以及细胞因子与危险相关分子模式（D-AMPS）目前在体内。第二，它们吸引和指示的抗原呈递细胞（APC）和淋巴细胞相互作用，并启动适应性免疫应答;第三，他们为淋巴细胞1的稳态和分化的结构性环境-3。在炎症过程中淋巴结基质细胞产生的生长因子，细胞因子和趋化因子，适应肿胀从而组织树突状细胞（DC）之间的相互作用，T，和B细胞。免疫反应的编排是唯一可能的，因为由不同的基质细胞群体形成的复合结构的体系结构。
淋巴结基质细胞是CD45阴性细胞中，并且可以通过CD31的表达或GP38在成纤维细胞和内皮细胞1-6相区别。 GP38 + CD31 -定义T区网状细胞（TRC，也被称为FRC：成纤维网状细胞），GP38 + CD31 +限定淋巴管内皮细胞（LEC），GP38 - CD31 +限定血液内皮细胞（BEC）。此外，该亚群的特征显示其他淋巴结基质细胞的存在。事实上，小周细胞样细胞群进行了表征内GP38 - CD31 -人口7。因此，在分离过程中的适应是有利的，用于鉴定不同淋巴结基质细胞的功能特性和特征。
的淋巴结基质细胞消化之前开发协议淋巴结基质细胞的研究是利用组织切片和显微镜不限于原位观测。然而，结构和功能研究表明，淋巴结基质细胞的重要特征。淋巴结基质细胞与平足，胶原和细胞外基质（ECM）蛋白结合以形成所谓的管道系统中的复杂的三维结构，其输送淋巴和相关联的低分子量蛋白质的淋巴结的囊下窦的高内皮微静脉中的T细胞区8。 DC是在与基质细胞紧密接触，并且可以观察到突出到管状CONduit结构来样液和检测抗原8。淋巴结基质细胞（储税券和淋巴管内皮细胞）与DC的相互作用是由趋化因子CCL21和CCL19 9,10释放和呈现介导的。 CCL19和CCL21通过CCR7受体促进树突状细胞和T细胞迁移至淋巴结的T细胞区4,11确认。尽管使用类似的趋化因子，树突状细胞和T细胞有不同的迁徙路线进入淋巴结12。后来，使用淋巴结和纯淋巴结基质细胞分离的酶消化，功能研究，对不同淋巴结基质细胞的作用和其与DC和T / B细胞6,13相互作用的能力进行的。首先，IFN-γ的产生的效应T细胞和淋巴结基质细胞之间的交调失真引起的生产所示以抑制T细胞应答和增殖中的次级淋巴器官14-16的代谢物的一氧化氮。二，淋巴Ñ赋基质细胞已报告，以支持监管DC亚群的分化通过产生IL-10的17的，并通过产生IL-7 6,18的调节幼稚T细胞稳态。三，淋巴结基质细胞Toll样受体的表达表明，基质细胞很容易受到信号从组织损伤时释放的感染或自身分子而得。的确，淋巴结基质细胞与TLR3聚配体的治疗（I：C）诱导主要组织相容性复合体I类表达和共同抑制分子PD-L1的表达上调的适度上调，但不是共刺激分子，从而导致外周组织的急剧变化抗原表达19。几个小组已经表明淋巴结基质细胞表达外周组织中的抗原并诱导自身反应性T细胞19,21-27的耐受性。因此，了解淋巴结基质细胞和其它迁移和再之间的相互作用目前主席淋巴结细胞，将有助于找到新的目标分子，以允许在炎症期间激活或抑制免疫应答。因此，淋巴结的出版酶的分离的实施是必要的。
先前公布的协议使用胶原酶类酶消化具有低机械应力6,19,20的不同组合。然而，长期的孵化与消化酶或消化酶的不同组合，可能会降低分析的激活状态，并确定新的淋巴结基质细胞所需的各种表面分子。根据不同的基质细胞的分析的类型，链路协议或弗莱彻协议可能是更适合的。在所描述的过程中，稍短酶消化结合了自动机械解聚作用，以减少可行淋巴结基质细胞的表面标记物的降解。此过程使高度可重复的分离和区分淋巴结基质细胞群与低变异性和超过95％的存活率。将新鲜分离的淋巴结基质细胞可直接用于表面标志物表达，蛋白质分析和转录的研究，以及建立基质细胞系在体外进行功能测定。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
在这个视频发布和协议，所有动物的程序按照批准的州局巴塞尔城市，瑞士动物的协议进行的。
1，淋巴结制备及消化
- 在烧杯中，以37℃的磁力搅拌器与加热板预热水。
- 制备基本培养基如下：DMEM培养基（不含丙酮酸）补充有2％FCS，1.2mM的氯化钙和青霉素/链霉素（100单位的青霉素，100微克链霉素）。
- 在使用前消毒所有的解剖工具。
- 安乐死每CO 2窒息淋巴结供体小鼠和在无菌条件下解剖淋巴结。不要解剖周围的脂肪。注：此协议是周围皮肤引流淋巴结（腹股沟，臂丛，腋）进行了优化。
- 放置淋巴结中含2ml冰冷的基本培养基的无菌培养皿中。
- 扰乱淋巴结CApsule使用两个地下25针固定在1ml注射器。
- 传输中断淋巴结组织中含有补充了1毫克/毫升胶原酶IV和40微克/毫升DNA酶一750μl的基本培养基5ml的聚丙烯圆底试管
- 每管加一无菌磁力搅拌器。
- 在37℃的烧杯放置管预热水搅拌管以缓慢的速度（1转/秒）30分钟。
- 从磁力搅拌器与加热板拆下管子，让淋巴结片段定居。
- 小心取出富含“非基质细胞”上清。注：如果T，B细胞，树突细胞和CD45的分析- GP38 - CD31 -预见，保存“非基质细胞”部分。
- 洗涤剩余淋巴结组织一次与750微升的基本媒介。注：此步骤仅当工作与免疫能力的小鼠必要的。
- 让淋巴结片段定居。
- 取出非基质细胞漂浮分数。
- 添加到淋巴结片段750微升的基本培养基中添加3.5毫克/毫升胶原酶D和40微克/毫升的DNase一
- 地方管早在含37℃烧杯预热水。
- 消化淋巴结组织为5分钟，同时慢慢搅拌。
- 集计淋巴结组织碎片通过移液和混合700微升，10个循环的最大速度使用自动化多通道移液器。注意：这会破坏淋巴结组织，以改善消化。
- 将管子放回烧杯中37℃预热的水。
- 摘要淋巴结组织碎片的同时，慢慢搅拌另外10分钟。
- 分解淋巴结组织碎片通过移液和使用自动化多通道移液器混合为99个循环的最大速度。
- 加入7.5微升0.5M的EDTA，确保维修单细胞悬液。
- 由管集计淋巴结组织碎片拟合和使用自动化多通道移液器混合为99个循环的最大速度。
- 加入750微升碱性介质中，并通过70微米尼龙网传递细胞。
- 离心细胞悬浮液5分钟，在1500 XG，4℃。
- 基质细胞现在可以被用于进一步的分析。
2，染色淋巴结基质细胞
- 使用抗CD45，抗平足（GP38），抗CD31抗体的结合，成功地承认真相与和解委员会，LEC，BEC和DN细胞。
- 孵化用活/死跟踪器，抗CD45-FITC（1:200）的消化淋巴结组织，抗GP38-PE（1:200），抗CD31-APC（1：200）在100μlHBSS含2 ％FCS的为至少20分钟，4℃下，在黑暗中。
- 洗含2％FCS的细胞中加入500升的HBSS
- 离心细胞悬浮液3分钟，在1500 XG，4℃。
- 重新悬浮在含有2％FCS的100微升HBSS中。
- 运行染色的细胞在流式细胞仪equipp版具有以下光学系统：激发源与多达三个激光器：蓝色（488纳米，风冷，20毫瓦固态），红色（633纳米，17毫瓦的氦氖），紫（405纳米，30毫瓦固态） 。
- 门CD45 -细胞排除造血细胞。
- 门汗衫（FSC-W）和活细胞（活/死追踪器）排除双峰和死细胞。
- 情节GP38 与 CD31的形象化TRC（GP38 + CD31 - ），LEC（GP38 + CD31 +），BEC（GP38 - CD31 +）和DN（GP38 - CD31 - ）细胞（参见图1）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本协议是出版Link 等人 ，2007年6具有更短的消化时间（45分钟，最大）由于机械解聚与自动化多通道移液管的变形消化协议。此外，该过程是更加标准化，最大限度地减少了对不同淋巴结的基质细胞表面标记物的降解，并且允许多于一个样品的处理在同一时间。
胶原酶IV和胶原酶D IN链接协议6和目前的协议或胶原酶P和中性蛋白酶到-Fletchers协议13保持淋巴结基质细胞活力，饶恕的几个表面标志物CD45包括，GP38和CD31的消化。为了测试当前协议，腋窝，上臂和腹股沟淋巴结被拆除，消化，分离的间质细胞。 CD45，GP38和CD31的表达分析表明，真相与和解委员会，LEC，BEC和DN细胞的C57BL / 6 M个孤立的存在冰（ 图1中 ，门控策略）。
机械应力可能在消化过程中减少淋巴结基质细胞的生存能力。比较用三个不同的协议的基质细胞分离的亚群的生存力，我们发现，存活率高于95％，在弗莱彻协议，但较低的两个当前协议和链路协议（ 图2A），尽管当前协议显示更好生存在选委会亚群则链路协议。总细胞数恢复的淋巴结基质细胞亚群的交消化略高在当前的协议相比，链路协议和弗莱彻协议（ 图2A）。这些结果表明，该电流协议维护淋巴结基质细胞相似，发表的方案的可行性。三种协议之间的主要差别列于表1中 。
表面标记物再通过流式细胞仪来表征淋巴结基质细胞和细胞分选分离出他们需要的。储税券及淋巴管内皮细胞，通过电流，链接和弗莱彻的协议进行了比较IA B，CD140a，CD80，PD-1和CD40的表达隔离。通过所有三个协议中分离基质细胞后，我们发现IA B，CD80，CD140a，PD-L1的表达和CD40是经消化的CP和LP两种储税券和淋巴管内皮细胞（ 图2B）为高。这些结果表明，一些表面分子与胶原酶IV和D的降解比用胶原酶P和分散酶不太强。
总而言之，目前的协议包括短消化结合的自动机械解聚作用，以减少可行淋巴结基质细胞的表面标记物的降解。
“/>
从C57BL / 6小鼠如图1 TRC，LEC，BEC，和DN细胞染色，门控和量化。淋巴结消化后，目前的协议，并沾上CD45，GP38和CD31，活/死定义TRC，LEC， BEC，和DN细胞通过流式细胞仪。数据显示，染色的代表性成果。 点击这里查看大图。
以下的电流（CP），链路的（LP）和弗莱彻的协议（FP），并用CD45，GP38和CD31来定义淋巴结基质细胞的图2。生活力和表面标志物表达，从C57BL / 6小鼠的淋巴结进行消化真相与和解委员会，LEC，BEC和DN细胞通过流式细胞仪A）Viabil性和活/死染色后的所有淋巴结基质细胞亚群的细胞总数（N≥5，2个独立的实验汇总数据，棒表示SEM）。 二）保险业监督的B面表达分析（APC-Cy7的），CD140a （PerCP-经Cy5.5），CD80（PerCP-经Cy5.5），PD-L1的（PE-Cy7的）和CD40（PE-Cy7的）上的储税券及淋巴管内皮细胞（N = 6的FP和N = 11为LP和CP ，2个独立的实验数据汇集，棒表示SEM）。几何小额信贷机构自发荧光值LEC-APC-Cy7的：324±97，LEC-PECy7：163±82.5，LEC-PerCpCy5.5：156±36，TRC-APC-Cy7的：349±152，TRC-PECy7：117 ±54，TRC-PerCP，经Cy5.5：121±45。 点击这里查看大图。
| 目前的协议，酶 | 目前的协议 | 链路协议的酶 | 链路协议 | ˚F莱彻协议酶 | 弗莱彻协议 |
| Ⅳ型胶原酶，DNA酶I | 30分钟，37℃，搅拌 | Ⅳ型胶原酶，DNA酶I | 30分钟，37℃ | 胶原酶磷，中性蛋白酶，DNA酶I | 20分钟，37℃下，转化，每5分钟 |
| 胶原酶D，酶I | 5分钟，37℃，搅拌，重悬 | 胶原酶D，DNA酶I | 20分钟，37℃ | 胶原酶磷，中性蛋白酶，DNA酶I | 10分钟，37℃，重悬30秒 |
| 10分钟，37℃，搅拌 | 胶原酶D，DNA酶I | 37℃，悬浮每隔10分钟，直到完全消化 | 胶原酶磷，中性蛋白酶，DNA酶I | 37℃，重悬，每5分钟，直到完全消化 | |
| 自动化机械悬浮 |
CP表1简要总结，LP，使用和协议的FP酶。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
淋巴结基质细胞的研究最近成为研究的热点，由于两个出版消化协议6,13的发展。这两种协议是足够获得单个淋巴结基质细胞，但不同之处在于使用消化酶和消化的时间。自基质细胞和其表面标志物是酶消化和机械应力敏感，一个优化的协议是必须的。
可行的淋巴结基质细胞从新鲜解剖淋巴结的隔离是为了进行表型和功能的分析的第一步。因此，在限定的酶浓度要仔细消化，在稳定的温度和所指示的时间是很重要的。两个协议的消化已经描述了6,13，但是有相当长的消化步骤。以减少消化的时间，机械解聚作用被列入并且用多道移液器标准化。上 e的当前协议的优点在于，它允许在仅45分钟的基质细胞的分离，因此，最小化它们的孵育时间与消化酶。此外，在消化过程中不断搅拌使消化酶的淋巴结结构的最佳访问。此外，消化体积减少到750微升减少酶的用量。
过大的机械力破坏紧密连接，但可能会导致细胞死亡，同时。因为这个原因，我们测试重新悬浮周期和不同的解离设备的多种组合。我们发现，使用一种自动化多通道移液管的允许范围内的99个循环2的应用程序的解离;施加恒定的压力于细胞，这将导致在单细胞悬浮液以最佳的生存能力。四到六个样品可以混合并用移液管在同一时间减少的淋巴结基质细胞分离的时间。
ontent“>消化协议具有保持几乎所有分子的表面表达;只有这样，伴随而来的染色用几个标记可以揭示如果人口是均相或非均相例如，在使用的BP-3和CD35的TRC GP38 + CD31 -允许髓TRC（的Sanjiv路德，个人通信）的可视化和隔离此外，不良的特征DN部分进一步定性为含艾尔+细胞和周细胞样细胞呈阳性整合α7（7检讨， 13），因此，本协议进行比较所公布的。与相比所公布那些当前协议，获得结果所示，类似的频率和淋巴结基质细胞的数目。有趣的是，分离的TRC的频率和数目用弗莱彻协议表明一个更好的解离真相与和解委员会的结构比目前的协议最高，Link协议。另外，各种表面分子的表达增强与相比弗莱彻协议的当前协议。这些差异在消化方法可能是在淋巴结基质细胞的研究6,19,21略有不同表达模式的原因。这可能是有用的测试，因为每一个协议的优点不同的消化协议。当前协议可能是表面表达分析更好，而弗莱彻协议可能是高数量的活细胞的转录分析的分离有用的（如在马尔霍特拉等 7出版）。因此比较这三种消化协议可能是重要的，以获得淋巴结基质细胞的分离后的最佳结果，应该被看作是互补的。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| Stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyrene round bottom tubes 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petri dishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25 G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
