Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lymfeklieren zijn gespecialiseerde compartimenten waar adaptieve immuunrespons tegen buitenlandse en zelf-antigenen worden geïnitieerd en gecoördineerd. De hier gepresenteerde betreft hier een korte enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische pipetteren om lymfeklier enkele celsuspensie te verkrijgen en toegang tot levensvatbare lymfeknoop stromale cellen die de oppervlakte-expressie van verscheidene moleculen kunnen onderhouden.

Lymfeklier stromale cellen vormen het skelet van de lymfeklieren en aan drie belangrijke functies: ten eerste ze filteren lichaamsvloeistoffen antigenen, pathogenen en hun pathogeen geassocieerde moleculaire patroon (PAMPs), alsook cytokines en gevaar geassocieerde moleculaire patroonvoorbeeld (DAMPs) aanwezig in het lichaam. Ten tweede, ze trekken en instrueren antigen presenterende cellen (APC) en lymfocyten te werken en initiëren adaptieve immuunreacties; en derde zij structureel omgeving voor de homeostase en differentiatie van lymfocyten 1-3. Tijdens ontsteking lymfeknoop stromale cellen groeifactoren, cytokines en chemokines, passen zwelling daardoor organiseren de interactie tussen dendritische cellen (DCs), T-en B-cellen. De orkestratie van immuunresponsen alleen mogelijk door de complexe structurele architectuur opgebouwd uit verschillende stromale cel populaties.

Lymfeklier stromale cellen zijn CD45 negatieve cellen en kan worden onderscheiden door de expressie van CD31 of GP38 in fibroblastische en endotheelcellen 1 -6. Gp38 + CD31 - T zone definieert reticulaire cellen (TRC, ook bekend als FRC: fibroblast reticulaire cellen), gp38 + CD31 + definieert lymfatische endotheelcellen (LEC), gp38 - CD31 + definieert bloed endotheelcellen (BEC). Verdere karakterisering van de subpopulaties onthulde het bestaan ​​van andere lymfeknoop stromacellen. Er werd een kleine pericyte-achtige celpopulatie kenmerk in degp38 - CD31 - bevolking 7. Derhalve aanpassing van de isolatie moet voordelig voor identificatie en karakterisatie van de functionele eigenschappen van verschillende lymfeknoop stromacellen.

Vóór de ontwikkeling van lymfeknoop stromacellen digestie protocollen de studie van lymfeknoop stromacellen beperkt tot in situ metingen waarbij weefselsectie en microscopie. Niettemin structurele en functionele studies toonden belangrijke kenmerken van lymfeknoop stromale cellen. Lymfeknoop stromale cellen geassocieerd met podoplanin, collageen en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten een complex 3 dimensionale structuur genoemd leidingsysteem, dat lymfe en bijbehorende laag molecuulgewicht eiwitten vervoert van de subcapsulaire sinus van de lymfeklieren van de hoge endotheliale vormen venulen in de T-cellen zone 8. DCs zijn in nauw contact met stromacellen en kunnen worden waargenomen uitsteekt in de buisvormige conduit structuur om te proeven van vocht en detecteren antigenen 8. De interactie van de lymfeklier stromale cellen (TRC's en LEC's) met DC's wordt gemedieerd door de introductie en presentatie van chemokines CCL21 en CCL19 9,10. CCL19 en CCL21 zijn erkend door de CCR7 receptor faciliteren DC en T-cellen om te migreren naar de lymfeklieren T-cel zone 4,11. Ondanks het gebruik van gelijkaardige chemokines, DC's en T-cellen hebben verschillende migratieroutes naar de lymfeklieren 12. Later, middels enzymatische digestie van de lymfeklieren en isoleren van pure lymfeknoop stromacellen, functionele studies naar de rol van de verschillende lymfeknoop stromale cellen en hun vermogen tot interactie met DCs en T / B-cellen 6,13. Eerst de overspraak tussen IFN-γ producerende effector T-cellen en de lymfeknoop stromale cellen induceert de productie van de metaboliet stikstofoxide aangetoond dat T-cel responsen en proliferatie temperen in de secundaire lymfoïde organen 14-16. Ten tweede, lymfe node stromale cellen gemeld de differentiatie van regelgevende DC subsets ondersteunen via de productie van IL-10 17, en naïeve T cel homeostase moduleren via productie van IL-7 6,18. Ten derde, TLR expressie in lymfeknopen stromale cellen suggereert dat stromale cellen gevoelig voor signaal afgeleid van een infectie of zelf-moleculen model bij weefselbeschadiging. Inderdaad, de behandeling van lymfeklier stromale cellen met de ligand van TLR3 poly (I: C) induceert een bescheiden opregulatie van major histocompatibility complex klasse I expressie en opregulatie van co-remmende eiwit, PD-L1, maar niet die van costimulatoire moleculen, waardoor dramatische veranderingen in perifere weefsels antigenen expressie 19. Verschillende groepen hebben aangetoond lymfeklier stromale cellen brengen perifere weefsel antigenen en veroorzaken tolerantie van zelf-reactieve T-cellen 19,21-27. Daarom begrijpen van de interactie tussen lymfeknoop stromale cellen en andere migrerende en resident lymfeknoopcellen zal helpen om nieuwe targetmoleculen om activering of onderdrukking van de immuunrespons mogelijk te maken tijdens de ontsteking te vinden. Daarom wordt de uitvoering van de gepubliceerde enzymatische scheiding van de lymfeklier nodig.

Eerder verschenen protocollen maken gebruik van verschillende combinaties van collagenase-gebaseerde enzymatische digestie met lage mechanische belasting 6,19,20. Er kunnen lange incubaties met spijsverteringsenzymen of andere combinatie van enzym digestie verschillende oppervlaktemoleculen die nodig is om de activeringsstatus analyseren en nieuwe lymfeknoop stromale cellen te identificeren degraderen. Afhankelijk van het type van de stromale cel analyse, kan het protocol Link Protocol Fletcher of meer geschikt. In de beschreven procedure wordt een iets kortere enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om oppervlaktemerker afbraak van levensvatbare lymfeknoop stromacellen minimaliseren. Deze procedure maakt het mogelijk zeer reproduceerbare isolatie enonderscheid lymfeklier stromale cel populaties met lage variabiliteit en meer dan 95% levensvatbaarheid. De vers geïsoleerde lymfeknopen stromale cellen kunnen direct worden gebruikt voor oppervlakte marker expressie, eiwitanalyse, en transcriptionele studies, alsmede het instellen van stromale cellijnen functionele assays in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In deze video publicatie en protocol, werden procedures waarbij dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de dier-protocol door de kantonrechter Autoriteit Basel-Stadt, Zwitserland goedgekeurd.

1 lymfeklieren Voorbereiding en Spijsvertering

  1. Verwarm water in een bekerglas tot 37 ° C op een magnetische roerder met verwarmingsplaat.
  2. Bereid Basic Medium als volgt: DMEM medium (zonder pyruvaat) aangevuld met 2% FCS, 1,2 mM CaCl2 en Pen / Strep (100 eenheden van penicilline, 100 ug van streptomycine).
  3. Steriliseren alle dissectie instrumenten worden gegeven.
  4. Euthanaseren lymfeklier donormuizen per CO 2 stikken en aseptisch ontleden de lymfeklieren. Niet ontleden de omliggende vet. OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor perifere huid-drainerende lymfeklier (lies, arm, oksel).
  5. Plaats lymfeklieren in een steriele petrischaal met 2 ml ijskoud basismedium.
  6. Verstoren van de lymfeklier capsule met behulp van twee 25 op 1 ml spuit wordt bevestigd G naalden.
  7. Breng de verstoorde lymfeknoop weefsel in een 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem bevattende 750 pi basic medium aangevuld met 1 mg / ml collagenase IV en 40 ug / ml DNAse I.
  8. Voeg een steriele magneetroerder in elke buis.
  9. Plaats buis in het bekerglas met 37 ° C voorverwarmd water en roer de buizen met een lage snelheid (1 ronde / sec) gedurende 30 minuten.
  10. Haal de buis uit de magneetroerder met verwarming plaat en laat lymfeklier fragmenten af ​​te wikkelen.
  11. Verwijder de bovenstaande vloeistof verrijkt met "non-stromale cel" zorgvuldig. OPMERKING: Als de analyse van T, B, dendritische cellen en CD45 - gp38 - CD31 - voorzien, sparen de fractie "niet-stromale cellen".
  12. Wash resterende lymfeklieren weefsel eenmaal met 750 pi basismedium. OPMERKING: Deze stap is alleen noodzakelijk als het werken met immuun-competente muizen.
  13. Laat lymfeklier fragmenten af ​​te wikkelen.
  14. Verwijder denon-stromale cel-drijvende fractie.
  15. In de lymfeknoop fragmenten 750 ul basismedium gesupplementeerd met 3,5 mg / ml collagenase D en 40 ug / ml DNase I.
  16. Plaats tube terug in de beker die de 37 ° C voorverwarmd water.
  17. Verteren lymfeklier weefsel gedurende 5 min, terwijl langzaam roeren.
  18. Gedesaggregeerde lymfeklieren weefselfragmenten door pipetteren en het mengen van 700 ul voor 10 cycli bij maximale snelheid met behulp van een geautomatiseerd meerkanaalspipet. OPMERKING: Dit verstoort lymfeklier weefsel om de spijsvertering te verbeteren.
  19. Plaats de buis terug in het bekerglas met 37 ° C voorverwarmde water.
  20. Digest lymfeklieren weefselfragmenten voor nog eens 10 min, terwijl langzaam roeren.
  21. Disaggregeren lymfeklieren weefselfragmenten door pipetteren en mengen voor 99 cycli bij maximale snelheid met behulp van een geautomatiseerd meerkanaalspipet.
  22. Voeg 7,5 ul 0,5 M EDTA onderhoud van enkele celsuspensie waarborgen.
  23. Gedesaggregeerde lymfeklier weefsel fragmenten door pijptting en mengen voor 99 cycli bij maximale snelheid met behulp van een geautomatiseerd meerkanaalspipet.
  24. Voeg 750 ul basisch milieu en passeren de cellen door een 70 pm nylon mesh.
  25. Centrifugeer celsuspensie 5 min bij 1500 xg, 4 ° C.
  26. Stromale cellen kunnen nu gebruikt worden voor verdere analyse.

2 Kleuring van lymfeknooptest stromale cellen

  1. Gebruik van een combinatie van anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31 antilichamen TRC, LEC, BEC en DN-cellen succesvol herkennen.
  2. Incubeer de gedigereerde lymfeklier weefsel met Live / Dead tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) in 100 pl HBSS bevattende 2 % FCS gedurende ten minste 20 min, 4 ° C, in het donker.
  3. Was de cellen toevoegen van 500 l HBSS bevattende 2% FCS
  4. Centrifugeer celsuspensie 3 min bij 1500 xg, 4 ° C.
  5. Re-schorten in 100 ul van HBSS dat 2% FCS.
  6. Voer de gekleurde cellen in een doorstroomcytometer equippversie met de volgende optica: excitatiebron met drie lasers: blauw (488 nm, luchtgekoelde, 20 mW solid state), rood (633 nm, 17 mW HeNe) en violet (405 nm, 30 mW solid state) .
  7. Gate CD45 - cellen hematopoietische cellen uitsluiten.
  8. Gate singlets (FSC-W) en levende cellen (LEEF / DEAD tracker) om doubletten en dode cellen te sluiten.
  9. Plot gp38 tegen CD31 visualiseren TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) en DN (gp38 - CD31 -) cellen (zie figuur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het huidige protocol is een aangepaste spijsvertering protocol gepubliceerd door Link et al., 2007 6 met een kortere spijsvertering tijd (45 min max) als gevolg van mechanische desaggregatie met een geautomatiseerde meerkanaalspipet. Bovendien is de procedure is gestandaardiseerd, minimaliseert degradatie van oppervlaktemerkers op verschillende lymfeknoop stromale cellen en maakt de behandeling van meer dan een monster tegelijk.

Collagenase IV en Collagenase D in Links protocol 6 en huidige protocol of Collagenase P en Dispase in Fletchers protocol 13 te behouden lymfeklier stromale cellen levensvatbaarheid en sparen de vertering van verschillende oppervlakte markers zoals CD45, gp38 en CD31. Om te testen het huidige protocol, oksel, arm en lies lymfeklieren werden verwijderd en verteerd hun stromale cellen te isoleren. Analyse van CD45, gp38 en CD31 expressie toonde de aanwezigheid van TRC, LEC, BEC en DN-cellen geïsoleerd uit C57BL / 6 mijs (Figuur 1, gating strategie).

Mechanische belasting zou de levensvatbaarheid van lymfeklier stromale cellen te verminderen tijdens de spijsvertering. Vergelijking van de levensvatbaarheid van geïsoleerde subpopulaties van stromale cellen met de drie verschillende protocollen, bleek dat de levensvatbaarheid hoger dan 95% in het Fletcher protocol, maar lager voor zowel huidige protocol en Link Protocol (figuur 2A), maar deze protocol toon beter overleving in de BEC subpopulatie vervolgens Link-protocol. Het totale aantal cellen hersteld na vertering van de lymfeklier stromale cel subsets was iets hoger in Current protocol vergeleken met Link-protocol en Fletcher protocol (Figuur 2A). Deze resultaten tonen aan dat de huidige protocol onderhoudt levensvatbaarheid lymfeknoopma- stromacellen Soortgelijke gepubliceerde protocollen. De belangrijkste verschillen tussen de drie protocollen vermeld in tabel 1.

Oppervlakte markers een re moeten lymfeknoop stromale cellen te karakteriseren door flowcytometrie en isoleren door celsortering. TRC's en LEC's geïsoleerd via Current, werden Link en Fletcher protocollen vergeleken voor IA b, CD140a, CD80, PD-L1 en CD40 expressie. Na het isoleren van stromale cellen door alle drie de protocollen, vonden we de uitdrukking van IA b, CD80, CD140a, PD-L1, en ​​CD40 was hoger na ontsluiting met CP en LP in zowel TRC's en LEC's (figuur 2B). Deze resultaten suggereren dat afbraak van sommige oppervlaktemoleculen met collagenase IV en D minder sterk dan met collagenase P en Dispase.

Samengevat, het huidige protocol bevat een korte digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om oppervlaktemerker afbraak van levensvatbare lymfeknoop stromacellen minimaliseren.

"/>
Figuur 1 TRC, LEC, BEC, en DN cellen kleuring, poorten, en kwantificering. Lymfeklieren van C57BL / 6 muizen werden verteerd na het huidige protocol en gekleurd met CD45, gp38 en CD31, Live / Dead to TRC, LEC definiëren, BEC en DN-cellen door flowcytometrie. Gegevens tonen representatieve resultaten van de vlekken. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2 Levensvatbaarheid en oppervlakte marker expressie van lymfeknoop stromacellen. Lymfklieren van C57BL / 6 muizen werden geknipt na de Stroom (CP), Link's (LP) en Fletcher protocol (FP) en gekleurd met CD45, gp38 en CD31 definiëren TRC, LEC, BEC en DN cellen door flowcytometrie. A) levensvatbaarheidteit en het totale aantal cellen van alle lymfeklieren stromale cel subpopulaties na Levend / Dead kleuring (n ≥ 5, samengevoegde gegevens van 2 onafhankelijke experimenten, balken geven SEM). B) Analyse van de oppervlakte-expressie van IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) en CD40 (PE-Cy7) op TRC's en LEC's (n = 6 voor FP en n = 11 voor LP en CP , samengevoegde gegevens van 2 onafhankelijke experimenten, balken geven SEM). Geometrische MFI auto-fluorescentie waarden voor LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Klik hier voor grotere afbeelding.

Huidige protocol-Enzymen Current-protocol Link Protocol-enzymen Link-protocol FLetcher Protocol-enzymen Fletcher-protocol
Collagenase IV, Dnase I 30 min, 37 ° C, roeren Collagenase IV, DNAse I 30 min, 37 ° C Collagenase P, Dispase, DNAse I 20 min, 37 ° C, zwenken om de 5 min
Collagenase D, Dnase I 5 min, 37 ° C, onder roeren, resuspendeer Collagenase D, DNAse I 20 min, 37 ° C Collagenase P, Dispase, DNAse I 10 min, 37 ° C, 30 sec resuspenderen
10 min, 37 ° C, roeren Collagenase D, DNAse I 37 ° C, resuspendeer elke 10 minuten tot volledige digestie Collagenase P, Dispase, DNAse I 37 ° C, resuspendeer elke 5 min tot volledige digestie
geautomatiseerde mechanische resuspensie

Tabel 1 Korte samenvattingen van de CP, LP, FP gebruikte enzymen en protocollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De studie lymfeknoopma- stromacellen werd onlangs onderzoek te richten door de ontwikkeling van twee gepubliceerde protocollen digestie 6,13. Beide protocollen zijn voldoende om enkele lymfeknoop stromacellen krijgen maar verschillen in het gebruik van verteringsenzymen en de tijd van de spijsvertering. Aangezien stromale cellen en hun oppervlak markers zijn gevoelig voor enzymatische digestie en mechanische belasting is een geoptimaliseerd protocol vereist.

De isolatie van levensvatbare lymfeknoop stromacellen uit vers ontleed lymfeklieren is de eerste stap om fenotypische en functionele analyse. Daarom is het belangrijk om zorgvuldig verteren met de vastgestelde concentratie van enzymen, een stabiele temperatuur en gedurende de aangegeven tijd. Twee digestie protocollen zijn beschreven 6,13 echter met tamelijk lange digestie stappen. Om de tijd van de spijsvertering te verminderen, werd mechanische uitsplitsing opgenomen en gestandaardiseerd gebruik van een multichannel pipet. Op e van de voordelen van het huidige protocol is dat het isoleren van stromale cellen slechts 45 minuten, dus het minimaliseren van de incubatietijd met verteringsenzymen. Bovendien constant roeren tijdens het oplossen kan de optimale toegang van de spijsverteringsenzymen de lymfeklier structuur. Bovendien werd de digestie volume verminderd tot 750 gl minimaliseren van de hoeveelheid enzym.

Overmatige mechanische kracht verstoort tight junctions maar kan celdood veroorzaken tegelijk. Daarom testten we een aantal combinaties van opwerveling cycli en verschillende dissociatie apparaten. We vonden dat het gebruik van een geautomatiseerde multichannel pipet kan de dissociatie binnen 2 toepassingen van 99 cycli; toepassen van een constante druk op de cellen en dit zal resulteren in enkelvoudige celsuspensie optimale levensvatbaarheid. Vier tot zes monsters worden gemengd en gepipetteerd tegelijkertijd verminderen van de tijd van lymfeklier stromale cel isolatie.

NHOUD "> de digestie protocol dient de oppervlakte-expressie van vrijwel alle moleculen handhaven;. alleen zo de gelijktijdige kleuring met verschillende markers kan openbaren als een populatie homogeen of heterogeen bijvoorbeeld het gebruik van BP-3 en CD35 in de TRC gp38 + CD31 -. maakt de visualisatie en isolatie van medullaire TRC (Sanjiv Luther, persoonlijke communicatie) bovendien de slecht gekarakteriseerde DN fractie werd verder gekarakteriseerd als bevattende Aire + cellen en pericyte achtige cellen positief voor integrine α7 (beoordeeld in 7, 13). Daarom heeft de onderhavige protocol vergeleken met de gepubliceerde cadeau. Zoals getoond in de resultaten, soortgelijke frequenties en aantallen lymfeknoop stromacellen werden verkregen met het huidige protocol vergeleken met de gepubliceerde cadeau. Interessant, frequentie en aantal afzonderlijke TRC werden met behulp van de hoogste Fletcher protocol duidt op een betere scheiding van de TRC structuren dan in het huidige protocol enLink protocol. Bovendien is de expressie van verschillende oppervlaktemoleculen werd verbeterd met de huidige protocol vergeleken met Fletcher protocol. Deze verschillen in de spijsvertering methode zou de reden voor iets andere expressie-patronen in de lymfeklier stromale cel studies 6,19,21 zijn. Het kan nuttig zijn om verschillende protocollen digestie vanwege de voordelen van elk protocol testen. Het huidige protocol dacht voor oppervlakte-expressie analyse, terwijl Fletcher protocol bruikbaar voor isolatie van grote aantallen levensvatbare cellen voor transcriptie analyse kunnen zijn (zoals gepubliceerd in Malhotra et al. 7). Daarom is het vergelijken van alle drie de spijsvertering protocollen kan het belangrijk om een ​​optimaal resultaat na isolatie van lymfeklier stromale cellen te verkrijgen en moet worden gezien als aanvulling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29, (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10, (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200, (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8, (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13, (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192, (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198, (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12, (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12, (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6, (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6, (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21, (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210, (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207, (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32, (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207, (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120, (24), 4772-4782 (2012).
Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter