Introduction
I linfonodi sono compartimenti specializzati in cui vengono avviate e coordinate risposte immunitarie adattative contro stranieri e di auto-antigeni. La procedura qui presentata descrive una breve digestione enzimatica combinata con pipettaggio meccanico automatizzato per ottenere linfonodo sospensione singola cella e ottenere l'accesso a linfonodali cellule stromali vitali che mantengono l'espressione di superficie di diverse molecole.
Formare cellule stromali linfonodale l'impalcatura del linfonodo e compiere tre funzioni principali: primo filtrano fluidi corporei di assaggiare antigeni, gli agenti patogeni e il loro modello molecolare associata patogeni (PAMP), così come le citochine e pericolo del modello molecolare associato (smorza) presente nel corpo. In secondo luogo, si attraggono e istruiscono le cellule presentanti l'antigene (APC) e linfociti di interagire e di avviare le risposte immunitarie adattative; e terzo, offrono un ambiente strutturale per l'omeostasi e la differenziazione dei linfociti 1-3. Durante le cellule stromali infiammazione dei linfonodi producono fattori di crescita, citochine e chemochine, adattarsi al rigonfiamento in tal modo organizzare l'interazione tra cellule dendritiche (DC), T, e B- cellule. L'orchestrazione delle risposte immunitarie è possibile solo a causa della complessa architettura strutturale formato da diverse popolazioni di cellule stromali.
Cellule stromali linfonodi sono cellule CD45 negativi e si distinguono per l'espressione di CD31 o gp38 in cellule endoteliali e fibroblastiche 1 -6. Gp38 + CD31 - definisce le cellule della zona T reticolari (TRC, noto anche come FRC: cellule reticolari fibroblastiche), gp38 + CD31 + definisce cellule linfatiche endoteliali (LEC), gp38 - CD31 + definisce cellule endoteliali del sangue (BEC). Inoltre, la caratterizzazione delle sottopopolazioni ha rivelato l'esistenza di altre cellule stromali linfonodali. Infatti, una piccola popolazione di cellule periciti-simile è stato caratterizzato nellagp38 - CD31 - la popolazione 7. Pertanto, l'adattamento della procedura di isolamento è vantaggiosa per l'identificazione e la caratterizzazione delle proprietà funzionali di varie cellule stromali linfonodali.
Prima dello sviluppo del linfonodo cellule stromali digestione protocolli di studio delle cellule stromali linfonodali era limitato a osservazioni in situ utilizzando la sezione di tessuto e microscopia. Tuttavia, studi strutturali e funzionali hanno mostrato caratteristiche importanti delle cellule stromali linfonodali. Cellule stromali linfonodi sono associati con podoplanin, collagene e della matrice extracellulare (ECM) proteine per formare un complesso di 3 struttura dimensionale chiamato sistema conduit, che trasporta le proteine linfatiche e massa molecolare associato-basso dal seno subcapsulare di linfonodo all'alta endoteliale venule nella T cellule zona 8. Dendritiche sono in stretto contatto con le cellule dello stroma e può osservare sporge nel con tubolarestruttura duit di campione di fluido e rilevare gli antigeni 8. L'interazione delle cellule stromali linfonodali (TRC e LECs) con DC è mediata dal rilascio e la presentazione delle chemochine CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 sono riconosciuti dal recettore CCR7 facilitare dendritiche e le cellule T di migrare al linfonodo zona di cellule T 4,11. Nonostante l'uso di chemochine simili, le cellule DCs e T hanno diverse rotte migratorie verso i linfonodi 12. Successivamente, utilizzando la digestione enzimatica del linfonodo e l'isolamento delle cellule stromali linfonodali puri, studi funzionali sono stati condotti sul ruolo delle diverse cellule dei linfonodi stromali e la loro capacità di interagire con le cellule dendritiche e le cellule T / B 6,13. In primo luogo, il crosstalk tra la produzione di cellule T effettrici IFN-γ e cellule stromali linfonodali induce la produzione del metabolita ossido nitrico dimostrato di smorzare le risposte delle cellule T e la proliferazione negli organi linfoidi secondari 14-16. In secondo luogo, linfa ncellule stromali ODE sono stati riportati per supportare la differenziazione delle sottopopolazioni DC regolamentazione attraverso la produzione di IL-10 17, e di modulare naif omeostasi delle cellule T attraverso la produzione di IL-7 6,18. In terzo luogo, espressione di TLR in cellule stromali linfonodali suggerisce che le cellule stromali sono suscettibili di segnale derivato da una infezione o di auto-molecole rilasciato durante lesioni dei tessuti. Infatti, il trattamento di cellule stromali linfonodali con il ligando di TLR3 poly (I: C) induce una modesta sovraregolazione di grande espressione di istocompatibilità di classe I e sovraregolazione di co-inibitorio molecola PD-L1, ma non di molecole costimolatorie, con conseguente drammatici cambiamenti nel tessuto periferico antigeni espressione 19. Diversi gruppi hanno mostrato cellule stromali linfonodali esprimono antigeni tissutali periferiche e inducono tolleranza delle cellule T autoreattive 19,21-27. Pertanto, la comprensione delle interazioni tra cellule stromali linfonodali e l'altro re migratorio ecellule linfonodali sidente aiuteranno a trovare nuove molecole bersaglio per consentire l'attivazione o la soppressione delle risposte immunitarie durante l'infiammazione. Pertanto, è necessaria l'attuazione della separazione enzimatica pubblicata del linfonodo.
Protocolli precedentemente pubblicati utilizzano diverse combinazioni di base di collagenasi-digestione enzimatica con una bassa sollecitazione meccanica 6,19,20. Tuttavia, lunghe incubazioni con enzimi di digestione o la diversa combinazione di digestione enzimatica potrebbero degradare diverse molecole di superficie necessaria per analizzare lo stato di attivazione e di individuare nuove cellule stromali linfonodali. A seconda del tipo di analisi delle cellule stromali, il protocollo Link o Fletcher protocollo potrebbe essere più adatto. Nella procedura descritta, una digestione enzimatica leggermente più corto è combinato con disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la superficie marcatore degradazione delle cellule stromali nodo linfa vitale. Questa procedura consente di isolamento altamente riproducibile edistinzione dei linfonodi popolazioni di cellule stromali con bassa variabilità e di oltre il 95% vitalità. Le cellule stromali linfonodi isolati a fresco possono essere utilizzati direttamente per l'espressione marcatore di superficie, analisi delle proteine, e gli studi trascrizionali, nonché creazione di linee di cellule stromali di effettuare saggi funzionali in vitro.
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Protocol
In questa pubblicazione video e protocollo, sono state effettuate tutte le procedure sugli animali conformemente al protocollo animali approvato dalla Autorità cantonale di Basilea Città, Svizzera.
1 Linfonodi Preparazione e digestione
- Acqua preriscaldo in un becher da 37 ° C su un agitatore magnetico con piastra di riscaldamento.
- Preparare Base Medio come segue: terreno DMEM (senza piruvato) supplementato con FCS 2%, 1,2 mM CaCl 2 e Pen / Strep (100 unità di penicillina, 100 mg di streptomicina).
- Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione prima dell'uso.
- Euthanize topi linfonodale donatori per CO 2 asfissia e asettico sezionare i linfonodi. Non sezionare il grasso circostante. NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per il nodo periferico-pelle drenante linfatico (inguinale, brachiale, ascellare).
- Mettere i linfonodi in una capsula di Petri sterile contenente 2 ml di ghiaccio freddo ambiente basico.
- Interrompere il linfonodo capsule utilizzando due aghi 25 G fissi sulla siringa da 1 ml.
- Trasferire il tessuto linfonodale interrotto in 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo contenente 750 ml terreno base integrato con 1 mg / ml di collagenasi IV e 40 mcg / ml I. DNAse
- Aggiungere un agitatore magnetico sterile in ciascuna provetta.
- Inserire il tubo nel bicchiere con 37 ° C preriscaldato acqua e mescolare i tubi a bassa velocità (1 round / sec) per 30 min.
- Rimuovere il tubo dalla agitatore magnetico con piastra di riscaldamento e lasciare frammenti linfonodali stabilirsi.
- Rimuovere con cautela il surnatante arricchito in "cella non stromali". NOTA: Se l'analisi di T, B, cellule dendritiche e CD45 - gp38 - CD31 - è previsto, salva la frazione "cellule non-stromali".
- Lavare restante tessuto linfonodale una volta con 750 microlitri di media di base. NOTA: Questo passaggio è necessario solo se si lavora con i topi immuno-competenti.
- Lasciate frammenti linfonodali stabilirsi.
- Rimuovere ilfrazione di cellule-floating non-stromale.
- Aggiungi ai frammenti linfonodali 750 microlitri terreno base integrata con 3,5 mg / ml Collagenase D e 40 mcg / ml DNasi I.
- Collocare il tubo indietro nel bicchiere contenente la 37 ° C preriscaldato acqua.
- Digest nodo tessuto linfatico per 5 minuti mentre lentamente mescolando.
- Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo di pipettaggio e mescolando 700 ml per 10 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. NOTA: Questo sconvolge nodo tessuto linfatico per migliorare la digestione.
- Posizionare il tubo di nuovo nel bicchiere con 37 ° C acqua preriscaldata.
- Digest frammenti di tessuto linfonodale per altri 10 min, mescolando lentamente.
- Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo pipettando e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata.
- Aggiungere 7,5 ml di 0,5 M EDTA per assicurare il mantenimento della sospensione singola cellula.
- Frammenti di tessuto linfonodale disaggregare per tubotting e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata.
- Aggiungere 750 microlitri di media di base e passare le cellule attraverso una maglia di nylon di 70 micron.
- Sospensione cellulare Centrifugare 5 min a 1.500 xg, a 4 ° C.
- Cellule stromali possono ora essere utilizzati per ulteriori analisi.
2. colorazione di cellule stromali Linfonodo
- Utilizzare una combinazione di anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anticorpi anti-CD31 per riconoscere con successo le cellule TRC, LEC, BEC e DN.
- Incubare il tessuto linfonodale digerito con Live / inseguitore Morto, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) in 100 microlitri HBSS contenente 2 % FCS per almeno 20 min, 4 ° C, al buio.
- Lavare le cellule aggiungendo 500 l di HBSS contenente 2% FCS
- Sospensione cellulare Centrifugare 3 min a 1500 xg, a 4 ° C.
- Risospendere in 100 ml di HBSS contenente 2% FCS.
- Eseguire le cellule colorate in un citofluorimetro equipped con le seguenti ottiche: fonte di eccitazione fino a tre laser: blu (488 nm, raffreddato ad aria, 20 mW a stato solido), rosso (633 nm, 17 mW HeNe), e viola (405 nm, 30 mW a stato solido) .
- Porta CD45 - cellule di escludere le cellule ematopoietiche.
- Canottiere Cancello (FSC-W) e le cellule vive (live / inseguitore DEAD) per escludere doppietti e cellule morte.
- Trama gp38 vs CD31 per visualizzare TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) cellule (vedi Figura 1) e DN (gp38 - - CD31).
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Representative Results
Il presente protocollo è un protocollo di digestione modificata pubblicato da Link et al., 2007 6 con un tempo di digestione breve (45 minuti massimo) a causa di disaggregazione meccanica con una pipetta multicanale automatizzata. Inoltre, la procedura è più standardizzato, minimizza la degradazione dei marcatori di superficie su diverse cellule stromali linfonodali e permette la gestione di più di un campione allo stesso tempo.
Collagenase IV e Collagenase D in Links protocollo 6 e protocollo corrente o Collagenase P e dispasi in protocollo Fletchers 13 mantengono linfonodo cellule stromali vitalità e risparmiano la digestione di alcuni marcatori di superficie, tra cui CD45, CD31 e gp38. Per testare i nodi di protocollo, ascellari, brachiale e linfonodi inguinali attuali sono stati rimossi e digeriti per isolare le cellule stromali. Analisi di CD45, gp38 e CD31 espressione dimostrato la presenza di cellule TRC, LEC, BEC e DN isolati da C57BL / 6 mghiaccio (Figura 1, strategia di gating).
Lo stress meccanico potrebbe ridurre la vitalità delle cellule stromali nodo linfatiche durante la digestione. Confrontando la fattibilità di sottopopolazioni isolate di cellule stromali utilizzando i tre diversi protocolli, si è constatato che la redditività è stata superiore al 95% nel protocollo Fletcher, ma inferiore sia per il protocollo corrente e il protocollo di collegamento (Figura 2A), anche se corrente spettacolo protocollo migliore sopravvivenza nella sottopopolazione BEC poi Link Protocol. Il numero di cellule totali recuperati dopo la digestione dei linfonodi sottopopolazioni di cellule stromali è stata leggermente superiore nel protocollo attuale rispetto al protocollo di collegamento e protocollo Fletcher (Figura 2A). Questi risultati dimostrano che il protocollo attuale mantiene la vitalità delle cellule stromali linfonodali simili a protocolli pubblicati. Le principali differenze tra i tre protocolli sono elencati nella Tabella 1.
Marcatori di superficie di un re necessarie per caratterizzare le cellule stromali linfatiche nodo mediante citometria di flusso e di isolarli dai ordinamento delle cellule. TRC e LEC isolato via corrente, sono stati confrontati i protocolli di collegamento e Fletcher per IA b, CD140a, CD80, PD-L1 ed espressione CD40. Dopo aver isolato cellule stromali da tutti e tre i protocolli, abbiamo trovato l'espressione di IA B, CD80, CD140a, PD-L1, e CD40 era più alta su digestione con CP e LP in entrambi TRC e LEC (Figura 2b). Questi risultati suggeriscono che il degrado di alcune molecole di superficie con collagenasi IV e D sono meno forti che con Collagenase P e dispasi.
Nel loro insieme, l'attuale protocollo include una breve digestione combinata con disaggregazione meccanico automatizzato per ridurre al minimo la superficie marcatore degradazione delle cellule stromali nodo linfa vitale.
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Figura 1 nodi TRC, cellule LEC, BEC, e DN colorazione, gating, e quantificazione. Linfa C57BL / 6 topi sono stati digeriti seguendo il protocollo attuale e colorati con CD45, CD31 e gp38, Live / Morto per definire TRC, LEC, BEC, e DN cellule mediante citometria a flusso. I dati mostrano risultati rappresentativi della colorazione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2 Viabilità e superficiale espressione marker di cellule stromali linfonodali. Linfonodi di topi C57BL / 6 sono stati digeriti in seguito alla corrente (CP), il protocollo di Fletcher (FP) e colorati con CD45, gp38 e CD31 di Link (LP) e per definire TRC, LEC, BEC e DN cellule mediante citometria a flusso. A) Viabillità e il numero totale delle cellule di tutte le sottopopolazioni di cellule stromali linfonodo dopo Live / colorazione Morto (n ≥ 5, i dati combinati di due esperimenti indipendenti, barre rappresentano SEM). B) Analisi di espressione di superficie di IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) e CD40 (PE-Cy7) su TRC e LEC (n = 6 per FP e n = 11 per LP e CP , dati aggregati di 2 esperimenti indipendenti, barre rappresentano SEM). Geometriche delle IFM valori di auto-fluorescenza per LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
| Corrente Protocollo-Enzimi | Current-protocollo | Link Protocol-enzimi | Link-protocollo | FLetcher Protocol-enzimi | Fletcher-protocollo |
| Collagenase IV, DNasi I | 30 min, 37 ° C, agitazione | Collagenase IV, DNAsi I | 30 min, 37 ° C | Collagenase P, dispasi, DNAse I | 20 min, 37 ° C, invertire ogni 5 min |
| Collagenase D, DNasi I | 5 min, 37 ° C, agitazione, risospendere | Collagenase D, DNAsi I | 20 min, 37 ° C | Collagenase P, dispasi, DNAse I | 10 min, 37 ° C, risospendere 30 sec |
| 10 min, 37 ° C, agitazione | Collagenase D, DNAsi I | 37 ° C, risospendere ogni 10 minuti fino a completa digestione | Collagenase P, dispasi, DNAse I | 37 ° C, risospendere ogni 5 minuti fino a completa digestione | |
| risospensione meccanica automatizzata |
Tabella 1. brevi riassunti di CP, LP, enzimi FP usati e protocolli.
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Discussion
Lo studio delle cellule stromali linfonodali recentemente è diventato un focus di ricerca a causa dello sviluppo di due protocolli di digestione pubblicati 6,13. Entrambi i protocolli sono adeguate per ottenere cellule stromali nodo singolo linfatici ma differiscono per l'uso di enzimi digestivi e il tempo di digestione. Poiché le cellule stromali e loro marcatori di superficie sono sensibili alla digestione enzimatica e sollecitazioni meccaniche, è necessario un protocollo ottimizzato.
L'isolamento delle cellule stromali linfonodo vitali dalle linfonodo appena sezionato è il primo passo per eseguire analisi fenotipica e funzionale. Pertanto, è importante digerire accuratamente con la concentrazione definita di enzimi, ad una temperatura stabile e per il tempo indicato. Sono stati descritti due protocolli di digestione 6,13, ma con mineralizzazione piuttosto lunghi. Per ridurre il tempo di digestione, disaggregazione meccanica era inclusa e standardizzato con una pipetta multicanale. Su e dei vantaggi del protocollo attuale è che permette l'isolamento di cellule stromali in soli 45 minuti, quindi riducendo al minimo il tempo di incubazione con gli enzimi digestivi. Inoltre, agitazione costante durante la digestione permette l'accesso ottimale degli enzimi digestivi alla struttura linfonodo. Inoltre, il volume di digestione è stata ridotta a 750 microlitri al minimo la quantità di enzima impiegato.
Forza meccanica eccessiva distrugge giunzioni strette ma potrebbe causare la morte cellulare allo stesso tempo. Per questo motivo abbiamo testato diverse combinazioni di cicli di ri-sospensione e diversi dispositivi di dissociazione. Abbiamo trovato che l'uso di una pipetta multicanale automatizzata consente la dissociazione entro 2 applicazioni di 99 cicli; applicare una pressione costante alle cellule e questo si tradurrà in sospensione di cellule singole con redditività ottimale. Quattro a sei campioni possono essere mescolati e pipettati allo stesso tempo riducendo il tempo di linfonodo isolamento delle cellule stromali.
ontent "> Il protocollo digestione deve mantenere l'espressione di superficie di quasi tutte le molecole;. solo così la colorazione concomitante con diversi marcatori può rivelare se una popolazione è omogenea o eterogenea Ad esempio, l'uso di BP-3 e CD35 nella TRC gp38 + CD31 -. consente la visualizzazione e l'isolamento di midollare TRC (Sanjiv Lutero, comunicazione personale) Inoltre, la frazione poco caratterizzato DN è stato ulteriormente caratterizzato come contenente + cellule e periciti Aire come cellule positive per l'integrina α7 (recensione a 7, 13). Pertanto, il presente protocollo è stato confrontato con quelli pubblicati. Come mostrato nei risultati, le frequenze e il numero di cellule stromali linfonodali simili sono stati ottenuti con il protocollo in corso rispetto a quelli pubblicati. interessante notare che, la frequenza e il numero di isolati TRC sono stati più alta utilizzando il protocollo Fletcher suggerendo una migliore dissociazione delle strutture TRC rispetto al protocollo attuale eProtocollo Link. Inoltre, l'espressione di diverse molecole di superficie è stata arricchita con il protocollo corrente rispetto al protocollo Fletcher. Queste differenze nel metodo di digestione potrebbe essere il motivo per leggermente diversi pattern di espressione negli studi sulle cellule stromali linfonodali 6,19,21. Potrebbe essere utile per testare diversi protocolli di digestione a causa dei vantaggi di ogni protocollo. Il protocollo attuale potrebbe essere migliore per l'analisi di espressione di superficie, mentre il protocollo Fletcher potrebbe essere utile per l'isolamento di un numero elevato di cellule vitali per l'analisi di trascrizione (come pubblicato in Malhotra et al. 7). Pertanto, confrontando tutti e tre i protocolli di digestione potrebbe essere importante per ottenere risultati ottimali dopo l'isolamento delle cellule stromali linfonodali e dovrebbe essere visto come complementare.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| Stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyrene round bottom tubes 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petri dishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25 G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
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